基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用
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CH3 OH O O H O H
12
OCH3 CH3 O
13 15 17 11 10 19
HO H
22 23
H CH3
25
aveC
R2 H
CH3
O
21
CH3
O
CH3
H CH3
9 8
O
1 2 7 6 5
O H
3 4
脱水酶
阿维菌素“2”组 分
O
H
CH3
CH3 OH O CH3 CH3 O H O CH3 O H
R2 OH NH 2 NH 2 NH2
R3 H H H H
APH(2") ANT(2")
AAC Aminoglycoside APH A minoglycoside ANT Aminoglycoside
ac etyltransferases ph osphotrasferases n ecleotide transferases
构建重组质粒(带甲氧基转移酶)
acetyl CoA + malonyl CoA polyketide pathway 大菌素（macrocin) 甲氧基转移酶 Tylosin
转化到弗氏链霉菌 (S.fradiae)
转化菌株
泰洛星 (Tylosin) 产量显著提高
2.增加正调节基因, 去除负调节基因
菌携带的质粒SCP I 编码的。在其生物合
成结构基因的上游，存在一个负调节基因mmy。
（次甲霉素高产表达）
3.增加抗性基因的拷贝数
抗性基因的作用是避免抗生素产生菌被自身产生的代谢产 物所杀灭。其作用可通过三条途径实现：1.抗性基因产物(酶)将 抗生素作用的底物加以修饰; 2.将抗生素的分子结构加以修饰,使 其失活; 3.将抗生素分子排出细胞外。 提高菌种耐受自身产生抗生素的能力是取得高产的前提， 此外，将胞内的抗生素排出胞外，还可以解除高浓度代谢产物 对其生物合成的反馈调节，使产物大量合成。 将抗生素抗性基因片段连接到适当的质粒上，用得到的重 组质粒转化抗生素生产菌株，就可能使抗生素的产量得以提高。
CH 3
O
H
O CH 3 O H
阿维菌素“A”组分
O H
CH 3
OCH3
阿维菌素C5位的甲基化
“B” 组分
H
H 3
3
“A” 组分
CH3
ATP
CH3
O H
5
O H
5
OH
COOH H2 N C H CH2 CH2 +S CH3 H H
HC N
OCH3 OCH 3
转甲基酶
NH2 N
COOH H2 N C H CH2 CH2 S
增加IPNS基因提高青霉素产量
转化青霉素产生菌 Wis54-1255
转化菌株
青霉素V产量提高40%
例2. 头孢菌素C生物合成的限速酶
在头孢菌素C 的工业发酵生产中，人们发现发酵结束后在得到
的发酵液中，除了主要产物是头孢菌素C外，在发酵液中还积累另
一种产物-青霉素N。 问题：积累中间产物-青霉素N
OH N H N H (CH2)10CH3
产生菌:天蓝色链霉菌 S.colicolorA3(2)
构建重组质粒(带甲氧基转移酶)
转化到氧甲基转移酶缺陷变株
N
转化菌株
S-腺苷甲硫氨酸
氧甲基转移酶 十一烷基灵菌红素产量提高5倍
OCH3
N H
N
N H
(CH2)10CH3
增加限速酶的其它例子-4:
例4. 泰洛星 (Tylosin) 产生菌:弗氏链霉菌 (S.fradiae)
12 13 15 17 19
OR1
OCH3 CH3
25
H O
22 21
23
O H CH3
R2 H
CH3
11 10
阿维菌素“1”组分
9 8
O
1 2 7
O H
3 4 5
O H
6
CH3
OR1
aveC 基因 在染 色体 上的 位置
图 1-7 aveC,aveE 基因在阿维链霉菌生物合成基因簇中的位置[32] Fig.1-7 The location of aveC,aveE genes in AVM biosynthesis gene cluster
HC N
NH 2 N
CH2
N
N
O
CH2 H
N
N
O
H H OH OH
aveD
S-腺苷甲硫氨酸
H H H OH OH
S-腺苷高半胱氨酸
阿维菌素生物合成基因簇
0 10 20 30 40 50 60 70 80
kb
BamHI map
AveA1
aveA2
aveA3
aveA4
aveR aveF aveD aveC aveE
MYM+Am 黑色为双交换菌落代表 图 2-2 双交换菌株的筛选 Fig. 2-2
MYM+Am+Tsr
Selection of double cross-over Strepomyces avermitilis colonies
发酵产物的HPLC分析
B2a
A2a B2a D24-1 B1a B1a
A1a D24-2
control
AveD24
D24-1组分的质谱分析
cheng024_1 #96 RT: 1.70 AV: 1 NL: 8.70E7 T: + c Full ms [ 150.00-2000.00] 100 95 90 85 80 75 432.2 70 65 829.6 813.6
基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用
主要应用:
1. 提高次级代谢产物的产量 2. 改进代谢产物的组分 3. 改进菌种的生理性能 4. 产生新的代谢产物
(一) 提高次级代谢产物的产量
基因工程技术提高抗生素产量的主要手段
1. 增加限速酶的基因拷贝数
2. 增加正调节基因,去除负调节基因 3. 增加抗性基因的拷贝数
增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量
例1. Davies J. 利用链霉菌质粒pIJ702 从卡那霉素产生菌克隆了6’-N-氨基糖 苷乙酰转移酶AAC6’的基因(aacA),该基因产物在乙酰辅酶A的存在下,可将 氨基糖苷类抗生素的氨基糖6’乙酰化。. 将aacA基因转入新霉素和卡那霉素 的产生菌中, 结果显著提高了抗生素的产量.
845.8 1282.8 847.7 959.3 1159.6 1276.5 1025.5 1265.4 1129.8 1377.6 1390.0 1516.6 1572.8 1781.4 1879.0 1990.2
1638.4 1723.2
2. 只产Avermectin “2”组分基因工程菌的构建
增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量-2
例2. 螺旋霉素抗性基因srmB
重组质粒
转化 S.ambofaciens（生二素链霉菌）
转化子 使螺旋霉素产量提高。
(二) 改进代谢产物的组分
链霉菌产生的次级代谢产物常常是一组结构相似的混
合物。每个化合物称为它的一个组分。多组分产生的分子基 础是因为次级代谢产物的合成酶对底物的选择性不强以及合
转化
转化子- 链霉菌细胞
氨基糖苷类抗生素产量提高
卡那霉素6’-乙酰转移酶[AAC（6’）] 的作用
AAC(4') R1 -H 2 C HO APH(3') AAC(2') HO R2 HO AAC(6') AAC(3)
O
NH 2 O O HO NH 2 NH R3
R1 卡那霉素 A 卡那霉素B 卡 那 霉 素C 妥布霉素 CH 2 OH OH NH 2 NH 2 OH NH 2
调节基因根据其作用的不同分为正调节和负调节。正 调节促进生物合成结构基因的转录，负调节阻扼结构基因 的转录。
将带有正调节基因片段的重组质粒转化到生产菌株 中，由于转录功能的增强，使生物合成结构基因得以高水 平的表达，提高了代谢产物的产量。 反之，对于负调节基因，通过基因工程的手段，将其 祛除或失活，就能解除阻扼作用，同样导致使生物合成结 构基因高水平的表达，提高代谢产物的产量。
成途径中分支途径的存在。
通过基因工程手段，灭活某分支途径的酶，就可以去除 该分之支途径的产物。此策略常用来去除发酵产物中的无用 组分，提高有用组分的含量。
例一: 阿维菌素产生菌的基因改造
CH 3 OH O CH 3 CH 3 O H O CH 3 O H CH 3 O O H Y H O O H CH 3 R2 H X CH 3 OCH 3
m/z813[M+Na] +, D24-1的分子质量为790。与107#菌 株发酵液主组分oligmycinA的分子量一致。将两菌株 发酵液提取物混合后进样，根据在HPLC分析中D24-1 组分和菌株Ave107#的主峰相重合，可以推测D24-1组 分为oligmycinA。
Relative Abundance
4. 挑选双交换菌株 5. 阳性菌株的发酵 6. 发酵产物的组分分析(HPLC, 质谱)
Disruption plasmid of aveD gene
双交换菌株（阻断变株）的挑选
2 双交换菌株（阻断变株）的挑选
转入 28 ℃ 3-5 天 MS 涂布 28 ℃ 3-5 天 MYM （1-3 代） MYM+Am 转入 MYM+Am 单孢子悬液
原因：下一步反应为限速酶反应
解决：导入额外的扩环酶/羟化酶基因 结果：使头孢菌素C的产量提高 25-50%， 积累的青霉素N消失。
增加限速酶基因提高头孢菌素C产量
转化C.acremonium394-4
转化后菌株
头孢菌素C产量提高25-50%
增加限速酶的其它例子-3:
例3.
十一烷基灵菌红素
acetyl CoA polyketide pathway
Eb:异青霉素N合成酶
青霉素酰基转移酶
异青霉素N合成酶对P.chrysogenum青霉素产量的影响
菌株 原始菌株 低产菌株 Wis 54-1255 IPNS 的基 因拷贝数 mRNA量 青霉素产量 导入带IPNS 的基因片段 1 ---100% 140% 32-64 1 ---高产菌株 AS-P-78 9-14
调节基因在次级代谢产物合成中的作用
次级代谢产物生物合成基因簇内的正负调节基因
基因 brpA 效应 正 菌株 吸水链霉菌 次级代谢产物 Bialaphos 功 能
激活 bar ( Bialaphos 抗性)基因和 6 个 bap (生物合成)基因的转录 激活 tyl F(编码MOMT) 和其它tyl 生物合成基因的表达 能使 act 菌株放线紫红素的产 量增加 30 ～ 40 倍 该基因的插入失活导致次甲霉 素过量生产 调节链霉素的生物合成
O H CH 3 OR1
R1 A1a A1b A2a A2b B1a B1b B2a B2b CH3 CH3 CH3 CH3
H H H H
X-Y CH
CH 2
R2 CH
OH CH
C2 H5 CH3 C2 H5 CH3 C2 H5 CH3 C2 H5 CH3
CH
CH 2
CH
OH CH
阿维菌素“B”组分转化成“A”组分的分子基 础
1. 增加限速酶的基因拷贝数
原理： A
Ea Eb Ec Ed
B
C
D
限速酶 Rate-limiting Bottleneck
E ( 代谢产物）
Ea
Eb ACV三肽 异青霉素N
Ea: ACV合成酶
Ec 青霉素
Ec:异青霉素N酰基水解酶
例1:
起始原料 -aminoadipic acid L-cysteine L-valine
tylG
正
弗氏链霉菌
泰洛星
actII
正
天蓝色链霉菌
放线紫红素
mmy
strR .
负
天蓝色链霉菌
次甲霉素
正
灰色链霉菌
链霉素
去除负调节基因使结构基因超量表达
O H3C O H3C COOH CH2
mmy
Methylenomycin（次甲霉素）
克隆到质粒上 次甲霉素是由天蓝色链霉菌产生的抗生素， 研究结果表明，次甲霉素是由天蓝色链霉 转化变青链霉菌 转化子
60 55 50 45 40 35 30 25 404.2 20 15 10 5 0 200 400 600 800 1000 m/z 1200 1400 1600 1800 2000 303.3 369.3 361.3 415.2 437.3 465.1 691.0 717.6 608.8 529.3 808.3
aveB Ⅰ orf1
aveBⅢ
aveBⅤ
aveBⅦ aveBⅧ
aveBⅡ
aveBⅣ aveBⅥ
图3
阿弗菌素生物合成基因簇的物理基因图谱
1.用基因工程手段灭活C5-氧甲基转移酶基 因
主要过程： 1. 克隆阿维菌素生物合成的aveD基因 2. 构建 gene disruption 质粒
3. 转化阿维菌素产生菌(S.avermitilis)
CH 3 OH O CH 3 CH 3 O H O CH 3 O H CH 3 O O H Y H O O H CH 3 R2 H X CH 3 OCH3
aveD
C5-氧甲基转移酶
阿维菌素“B”组分
O H CH 3
OH
百度文库
CH 3 OH O
OCH3 CH 3 Y H O O H CH 3 O O H CH 3 R2 H X CH 3
12
OCH3 CH3 O
13 15 17 11 10 19
HO H
22 23
H CH3
25
aveC
R2 H
CH3
O
21
CH3
O
CH3
H CH3
9 8
O
1 2 7 6 5
O H
3 4
脱水酶
阿维菌素“2”组 分
O
H
CH3
CH3 OH O CH3 CH3 O H O CH3 O H
R2 OH NH 2 NH 2 NH2
R3 H H H H
APH(2") ANT(2")
AAC Aminoglycoside APH A minoglycoside ANT Aminoglycoside
ac etyltransferases ph osphotrasferases n ecleotide transferases
构建重组质粒(带甲氧基转移酶)
acetyl CoA + malonyl CoA polyketide pathway 大菌素（macrocin) 甲氧基转移酶 Tylosin
转化到弗氏链霉菌 (S.fradiae)
转化菌株
泰洛星 (Tylosin) 产量显著提高
2.增加正调节基因, 去除负调节基因
菌携带的质粒SCP I 编码的。在其生物合
成结构基因的上游，存在一个负调节基因mmy。
（次甲霉素高产表达）
3.增加抗性基因的拷贝数
抗性基因的作用是避免抗生素产生菌被自身产生的代谢产 物所杀灭。其作用可通过三条途径实现：1.抗性基因产物(酶)将 抗生素作用的底物加以修饰; 2.将抗生素的分子结构加以修饰,使 其失活; 3.将抗生素分子排出细胞外。 提高菌种耐受自身产生抗生素的能力是取得高产的前提， 此外，将胞内的抗生素排出胞外，还可以解除高浓度代谢产物 对其生物合成的反馈调节，使产物大量合成。 将抗生素抗性基因片段连接到适当的质粒上，用得到的重 组质粒转化抗生素生产菌株，就可能使抗生素的产量得以提高。
CH 3
O
H
O CH 3 O H
阿维菌素“A”组分
O H
CH 3
OCH3
阿维菌素C5位的甲基化
“B” 组分
H
H 3
3
“A” 组分
CH3
ATP
CH3
O H
5
O H
5
OH
COOH H2 N C H CH2 CH2 +S CH3 H H
HC N
OCH3 OCH 3
转甲基酶
NH2 N
COOH H2 N C H CH2 CH2 S
增加IPNS基因提高青霉素产量
转化青霉素产生菌 Wis54-1255
转化菌株
青霉素V产量提高40%
例2. 头孢菌素C生物合成的限速酶
在头孢菌素C 的工业发酵生产中，人们发现发酵结束后在得到
的发酵液中，除了主要产物是头孢菌素C外，在发酵液中还积累另
一种产物-青霉素N。 问题：积累中间产物-青霉素N
OH N H N H (CH2)10CH3
产生菌:天蓝色链霉菌 S.colicolorA3(2)
构建重组质粒(带甲氧基转移酶)
转化到氧甲基转移酶缺陷变株
N
转化菌株
S-腺苷甲硫氨酸
氧甲基转移酶 十一烷基灵菌红素产量提高5倍
OCH3
N H
N
N H
(CH2)10CH3
增加限速酶的其它例子-4:
例4. 泰洛星 (Tylosin) 产生菌:弗氏链霉菌 (S.fradiae)
12 13 15 17 19
OR1
OCH3 CH3
25
H O
22 21
23
O H CH3
R2 H
CH3
11 10
阿维菌素“1”组分
9 8
O
1 2 7
O H
3 4 5
O H
6
CH3
OR1
aveC 基因 在染 色体 上的 位置
图 1-7 aveC,aveE 基因在阿维链霉菌生物合成基因簇中的位置[32] Fig.1-7 The location of aveC,aveE genes in AVM biosynthesis gene cluster
HC N
NH 2 N
CH2
N
N
O
CH2 H
N
N
O
H H OH OH
aveD
S-腺苷甲硫氨酸
H H H OH OH
S-腺苷高半胱氨酸
阿维菌素生物合成基因簇
0 10 20 30 40 50 60 70 80
kb
BamHI map
AveA1
aveA2
aveA3
aveA4
aveR aveF aveD aveC aveE
MYM+Am 黑色为双交换菌落代表 图 2-2 双交换菌株的筛选 Fig. 2-2
MYM+Am+Tsr
Selection of double cross-over Strepomyces avermitilis colonies
发酵产物的HPLC分析
B2a
A2a B2a D24-1 B1a B1a
A1a D24-2
control
AveD24
D24-1组分的质谱分析
cheng024_1 #96 RT: 1.70 AV: 1 NL: 8.70E7 T: + c Full ms [ 150.00-2000.00] 100 95 90 85 80 75 432.2 70 65 829.6 813.6
基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用
主要应用:
1. 提高次级代谢产物的产量 2. 改进代谢产物的组分 3. 改进菌种的生理性能 4. 产生新的代谢产物
(一) 提高次级代谢产物的产量
基因工程技术提高抗生素产量的主要手段
1. 增加限速酶的基因拷贝数
2. 增加正调节基因,去除负调节基因 3. 增加抗性基因的拷贝数
增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量
例1. Davies J. 利用链霉菌质粒pIJ702 从卡那霉素产生菌克隆了6’-N-氨基糖 苷乙酰转移酶AAC6’的基因(aacA),该基因产物在乙酰辅酶A的存在下,可将 氨基糖苷类抗生素的氨基糖6’乙酰化。. 将aacA基因转入新霉素和卡那霉素 的产生菌中, 结果显著提高了抗生素的产量.
845.8 1282.8 847.7 959.3 1159.6 1276.5 1025.5 1265.4 1129.8 1377.6 1390.0 1516.6 1572.8 1781.4 1879.0 1990.2
1638.4 1723.2
2. 只产Avermectin “2”组分基因工程菌的构建
增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量-2
例2. 螺旋霉素抗性基因srmB
重组质粒
转化 S.ambofaciens（生二素链霉菌）
转化子 使螺旋霉素产量提高。
(二) 改进代谢产物的组分
链霉菌产生的次级代谢产物常常是一组结构相似的混
合物。每个化合物称为它的一个组分。多组分产生的分子基 础是因为次级代谢产物的合成酶对底物的选择性不强以及合
转化
转化子- 链霉菌细胞
氨基糖苷类抗生素产量提高
卡那霉素6’-乙酰转移酶[AAC（6’）] 的作用
AAC(4') R1 -H 2 C HO APH(3') AAC(2') HO R2 HO AAC(6') AAC(3)
O
NH 2 O O HO NH 2 NH R3
R1 卡那霉素 A 卡那霉素B 卡 那 霉 素C 妥布霉素 CH 2 OH OH NH 2 NH 2 OH NH 2
调节基因根据其作用的不同分为正调节和负调节。正 调节促进生物合成结构基因的转录，负调节阻扼结构基因 的转录。
将带有正调节基因片段的重组质粒转化到生产菌株 中，由于转录功能的增强，使生物合成结构基因得以高水 平的表达，提高了代谢产物的产量。 反之，对于负调节基因，通过基因工程的手段，将其 祛除或失活，就能解除阻扼作用，同样导致使生物合成结 构基因高水平的表达，提高代谢产物的产量。
成途径中分支途径的存在。
通过基因工程手段，灭活某分支途径的酶，就可以去除 该分之支途径的产物。此策略常用来去除发酵产物中的无用 组分，提高有用组分的含量。
例一: 阿维菌素产生菌的基因改造
CH 3 OH O CH 3 CH 3 O H O CH 3 O H CH 3 O O H Y H O O H CH 3 R2 H X CH 3 OCH 3
m/z813[M+Na] +, D24-1的分子质量为790。与107#菌 株发酵液主组分oligmycinA的分子量一致。将两菌株 发酵液提取物混合后进样，根据在HPLC分析中D24-1 组分和菌株Ave107#的主峰相重合，可以推测D24-1组 分为oligmycinA。
Relative Abundance
4. 挑选双交换菌株 5. 阳性菌株的发酵 6. 发酵产物的组分分析(HPLC, 质谱)
Disruption plasmid of aveD gene
双交换菌株（阻断变株）的挑选
2 双交换菌株（阻断变株）的挑选
转入 28 ℃ 3-5 天 MS 涂布 28 ℃ 3-5 天 MYM （1-3 代） MYM+Am 转入 MYM+Am 单孢子悬液
原因：下一步反应为限速酶反应
解决：导入额外的扩环酶/羟化酶基因 结果：使头孢菌素C的产量提高 25-50%， 积累的青霉素N消失。
增加限速酶基因提高头孢菌素C产量
转化C.acremonium394-4
转化后菌株
头孢菌素C产量提高25-50%
增加限速酶的其它例子-3:
例3.
十一烷基灵菌红素
acetyl CoA polyketide pathway
Eb:异青霉素N合成酶
青霉素酰基转移酶
异青霉素N合成酶对P.chrysogenum青霉素产量的影响
菌株 原始菌株 低产菌株 Wis 54-1255 IPNS 的基 因拷贝数 mRNA量 青霉素产量 导入带IPNS 的基因片段 1 ---100% 140% 32-64 1 ---高产菌株 AS-P-78 9-14
调节基因在次级代谢产物合成中的作用
次级代谢产物生物合成基因簇内的正负调节基因
基因 brpA 效应 正 菌株 吸水链霉菌 次级代谢产物 Bialaphos 功 能
激活 bar ( Bialaphos 抗性)基因和 6 个 bap (生物合成)基因的转录 激活 tyl F(编码MOMT) 和其它tyl 生物合成基因的表达 能使 act 菌株放线紫红素的产 量增加 30 ～ 40 倍 该基因的插入失活导致次甲霉 素过量生产 调节链霉素的生物合成
O H CH 3 OR1
R1 A1a A1b A2a A2b B1a B1b B2a B2b CH3 CH3 CH3 CH3
H H H H
X-Y CH
CH 2
R2 CH
OH CH
C2 H5 CH3 C2 H5 CH3 C2 H5 CH3 C2 H5 CH3
CH
CH 2
CH
OH CH
阿维菌素“B”组分转化成“A”组分的分子基 础
1. 增加限速酶的基因拷贝数
原理： A
Ea Eb Ec Ed
B
C
D
限速酶 Rate-limiting Bottleneck
E ( 代谢产物）
Ea
Eb ACV三肽 异青霉素N
Ea: ACV合成酶
Ec 青霉素
Ec:异青霉素N酰基水解酶
例1:
起始原料 -aminoadipic acid L-cysteine L-valine
tylG
正
弗氏链霉菌
泰洛星
actII
正
天蓝色链霉菌
放线紫红素
mmy
strR .
负
天蓝色链霉菌
次甲霉素
正
灰色链霉菌
链霉素
去除负调节基因使结构基因超量表达
O H3C O H3C COOH CH2
mmy
Methylenomycin（次甲霉素）
克隆到质粒上 次甲霉素是由天蓝色链霉菌产生的抗生素， 研究结果表明，次甲霉素是由天蓝色链霉 转化变青链霉菌 转化子
60 55 50 45 40 35 30 25 404.2 20 15 10 5 0 200 400 600 800 1000 m/z 1200 1400 1600 1800 2000 303.3 369.3 361.3 415.2 437.3 465.1 691.0 717.6 608.8 529.3 808.3
aveB Ⅰ orf1
aveBⅢ
aveBⅤ
aveBⅦ aveBⅧ
aveBⅡ
aveBⅣ aveBⅥ
图3
阿弗菌素生物合成基因簇的物理基因图谱
1.用基因工程手段灭活C5-氧甲基转移酶基 因
主要过程： 1. 克隆阿维菌素生物合成的aveD基因 2. 构建 gene disruption 质粒
3. 转化阿维菌素产生菌(S.avermitilis)
CH 3 OH O CH 3 CH 3 O H O CH 3 O H CH 3 O O H Y H O O H CH 3 R2 H X CH 3 OCH3
aveD
C5-氧甲基转移酶
阿维菌素“B”组分
O H CH 3
OH
百度文库
CH 3 OH O
OCH3 CH 3 Y H O O H CH 3 O O H CH 3 R2 H X CH 3