基因工程技术表达

利用基因工程技术表达 已知的目Байду номын сангаас序列
要求：已知目的基因的cDNA序列， 拟采用基因工程技术在哺乳动物 细胞中表达该序列中的133-1941 位序列，设计试验方案。
实验设计思路
1.根据已知的cDNA序列，设计引物扩 增133-1941； 2得到扩增引物后，通过TOPO TA克隆 插入质粒； 3.该质粒扩增后可以直接转染动物细 胞用来表达，或者进一步亚克隆到更 强的表达质粒后再转染
一、查阅相关资料
通过GenBank查找登录号：AK135903.1查找相关序列及其信息 DEFINITION Mus musculus in vitro fertilized eggs cDNA, RIKEN fulllength，enriched library, clone:7420435F10 product:zona pellucida， glycoprotein 2, full insert sequence. SOURCE Mus musculus (house mouse) ORGANISM Mus musculus Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Glires; Rodentia; Sciurognathi; Muroidea; Muridae; Murinae; Mus; Mus.
二、从组织中提取该段目的基因
1.采集细胞：对组织细胞剪碎分离成 单个细胞，离心，取下层。采用第一 次讨论课时提取细胞中DNA的方法进 行提取及分离 2.检验DNA纯度 3.选用合适的核酸内切酶剪切1331941位序列。
三、扩增，制质粒
1.设计合适的引物，进行PCR扩增
2.得到扩增引物后，通过TOPO TA克隆插入质粒
T-A克隆
把PCR片断与一个具有3‘-T突出的载体DNA连接 起来的方法。因为PCR反应中所使用的聚合酶具 有末端转移的活性，通常在3'加上A。例如：Taq 聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应 时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突 出端。只有用经过特殊处理的具有3’-T突出末 端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。使用 不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃ 10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端 加上A，因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直 接连接。