基因工程技术

PCR：
• 引入合适的酶切位点，一个/两个。 引入合适的酶切位点，一个 两个 两个。 • 加保护碱基，1-3个。 加保护碱基， 个 • 加上想要的标签，如 Flag, Myc, His, HA。 加上想要的标签， 。 • 启始及终止密码子。 启始及终止密码子。
高保真聚合酶： ， 高保真聚合酶：HF，Pfu，Probest 等。 ，
是细菌染色体外能够自我复 分子。 制的双链环状 DNA 分子。
克隆载体: 克隆载体: pBR322
特点： 特点： • • • 分子量小， 分子量小，4.3kb，便于操作。 ，便于操作。 有两个抗性基因，便于转化子筛选。 有两个抗性基因，便于转化子筛选。 有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上， 种位于 有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，7种位于 四环素选择标记上， 种位于 种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏 抗性基因上。 四环素选择标记上，4种位于 抗性基因上 抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活， 抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组 插入失活 和非重组分子。 和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数， 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停 止时，它仍能继续复制。 止时，它仍能继续复制。
片断的回收与纯化
载体： 载体：
• 载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目 的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。 • 种类：
按来源分： 质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、 柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ). 按作用分： 克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、 穿梭载体(shuttle vector)
碱性磷酸酶处理： 碱性磷酸酶处理：
平头末端： 平头末端：
连接酶对平末端DNA的Km （1）增加连接酶的量 （连接酶对平末端 ） 的 约高于粘性末端DNA100倍 ） 倍 约高于粘性末端 （2）在末端加上一个人工接头，内含有一定的限制性内 ）在末端加上一个人工接头， 切酶位点，经酶切处理产生粘性末端， 切酶位点，经酶切处理产生粘性末端，然后与载体 连接。如加上一个人工接头内含 序列， 连接。如加上一个人工接头内含GAATTC序列，用 序列 EcoRI酶切，产生EcoRI 粘性末端。 酶切，产生 粘性末端。 酶切
TA 克隆
A
A
TOPO-TA
表达载体：带有调控基因表达所必需的转录与翻译元件， 表达载体：带有调控基因表达所必需的转录与翻译元件，如启
动子等，这些调控元件应与宿主细胞相适应。 动子等，这些调控元件应与宿主细胞相适应。
• 原核 His-tag: pQE系列 系列(Qiagen), pET22(Novagen) 系列
筛
筛选含有重组分子的克隆
鉴
鉴定重组分子片段
基因工程流程示意图
构建重组分子（连接） 构建重组分子（连接）
• 原料 原料： 目的基因： 目的基因：研究对象 载体： 载体：目的基因的运载工具 工具酶：连接酶、 工具酶：连接酶、限制性内切酶
目的基因片段来源： 目的基因片段来源： 来源
• •
基因组DNA（非编码序列） （非编码序列） 基因组 PCR 方法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列， 方法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列， 已有其它克隆构建或从商品化的cDNA文库扩增） 文库扩增） 已有其它克隆构建或从商品化的 文库扩增
GST-tag: pGEX系列 系列(Pharmacia) 系列
真核表达载体：大多是穿梭载体。 真核表达载体：大多是穿梭载体。
pcDNA 3系列 (Invitrogen)， 系列 ，
pFLAG-CMV系列 系列(Sigma) 系列
DNA分子的体外连接： DNA分子的体外连接：方法 分子的体外连接
连接酶： 连接酶：两种
• DNA连接酶：连接双链中两条DNA链之间形成磷酸二酯键，封闭 DNA连接酶： 连接酶 双螺旋骨架缺口。需要一条DNA链的3‘-末端具有游离的OH， 另一条DNA链5’-末端的磷酸基团-P，吸能反应，需ATP存在。 也可做DNA修复。但不能连接两条单链DNA分子和环化的单链 DNA分子。而且只能连接粘性末端。 • T4 DNA连接酶：是从感染T4噬菌体的E．coli中分离得到的一种 DNA连接酶 连接酶： 连接酶。粘性末端、平末端、平末端上加人工接头。用途比DNA 连接酶广泛，是分子生物学研究及基因克隆中较常用的连接酶。
重组子导入受体细胞： 重组子导入受体细胞：途径
• 转化：质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌（感受态菌） 转化：质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌（感受态菌） DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌 的过程 • 转染：噬菌体、病毒、或以它作为载体构建的重组子主动或被动 转染：噬菌体、病毒、 被导入细胞的过程。 被导入细胞的过程。 • 感染：以病毒为载体的重组子，在体外包装成具有感染力的病毒 感染：以病毒为载体的重组子， 颗粒，通过感染受体细胞，然后整合到受体细胞基因组上。 颗粒，通过感染受体细胞，然后整合到受体细胞基因组上。
定义： 定义：
• 基因工程（gene engineering） 基因工程（ ）
重组DNA技术（recombinant DNA technique）：是指在各种 重组 技术（ ）：是指在各种 技术 ）： 酶的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）在体外与病毒、细 酶的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）在体外与病毒、 菌或其它载体通过入工剪切、连接构成重组DNA分子，将其导入 菌或其它载体通过入工剪切、连接构成重组 分子， 分子 受体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和 表达，这种有目 受体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆” 表达， 的的应用分子克隆技术，人为地改造基因，改变生物遗传性状的系 的的应用分子克隆技术，人为地改造基因， 列过程，总称为基因工程。 列过程，总称为基因工程。
﹦
连接反应： 连接反应：
H2O Buffer Vector Insert ligase
10ul 体系
14℃过夜
连接反应条件 连接酶的活性； 的纯度； 连接酶的活性；DNA的纯度；载体与目的基因的比 的纯度 适宜； ℃ 不高于 不高于16℃ 过夜 例； PH值7.2-7.8适宜；14℃(不高于 ℃)过夜 值 适宜
重组子导入受体细胞： 重组子导入受体细胞：
• 把重组DNA导入受体细胞进行扩增.根据所用载体的特 性选择适宜的受体细胞（原核，真核）及选择适宜的 转化或转染的方法。 • 受体细胞的要求：必须具备使外源DNA进行复制的能 力（提供复制所需的原料）而且还应该能够表达由导 入的重组体分子所提供的某种表型特征，这样才有利 于转化子细胞的选择与鉴定。
• 克隆载体 克隆载体(cloning vector)
用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分 子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它 质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建（pBR322）。
• 表达载体 表达载体(expression vector)
使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入 适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译 （pcDNA3）。
应用：
• 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 • 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成，生产多 肽产品。 • 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调 控机制等
基因工程基本步骤： 基因工程基本步骤： 步骤
分、切 目的基因 + 载体分子
接
构成重组DNA分子 分子 构成重组
转
导入到合适的受体细胞（转化） 导入到合适的受体细胞（转化）
Eco RⅠ Ⅰ
Eco RⅠ Ⅰ Eco RⅠ Ⅰ
连接策略：来自百度文库
连接浓度： 连接浓度：
• 片段与载体连接机率＞自身环化 片段与载体连接机率＞ • 一般计算公式： 一般计算公式： 粘性末端： 粘性末端： 载体片段含量（ ） 载体长度 载体长度（ ） 载体片段含量（ng）/载体长度（kb） DNA片段含量（ng）/ DNA片段长度（kb） 片段含量（ ） 片段长度（ ） 片段含量 片段长度 平末端 1：5 ~ 10 ： 1 3-5
转化
• 受体细胞：大肠杆菌，基因工程中最常用的宿主细胞 • 转化机理：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA 发生可遗传的改变。
• 转化效率： 转化效率： 只有很少比例的细胞有能力掺入质粒DNA 只有很少比例的细胞有能力掺入质粒 转化时大约在1000个DNA分子中，只有一个 个 分子中， 分子获得成功。 转化时大约在 分子中 只有一个DNA分子获得成功。 分子获得成功 一般每微克完整的pBR322DNA产生 5-107 转化细胞 产生10 一般每微克完整的 产生
基因工程技术
The Nobel Prize in Chemistry 1980
Jackson, Symons, and Berg (1972) – generated first recombinant DNA molecules
Cohen and Boyer (1973) – produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host
其他酶： 其他酶：末端修饰酶
末端脱氧核苷酸转移酶（ transferase） 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase）
简称末端转移酶。在合适的反应系统中，这种酶使DNA片段平末端的3′OH加上同聚核苷酸，产生具有 poly（A）、或poly（T）、或poly（G）、 或poly（C）的粘性末端。
碱性磷酸酶 根据DNA重组的需要，为防止两DNA片段末端之间连接，经常采用 碱性磷酸酶处理，使DNA末端的5′-P成为5′-OH。目前采用的碱 性磷酸酶有两种，即来源于大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶（BAP）和 来源于小牛肠的小牛肠碱性磷酸酶（CIP）。CIP的比活性比BAP高 出10倍以上，而且对热敏感，便于加热使其失活。
穿梭载体(shuttIe vector) 穿梭载体
能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体。 其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的 复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS），它即能在 原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用 于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移。
质粒载体
• 具有复制起始点， 具有复制起始点，这是质粒自我增 复制起始点 殖的必要条件。 殖的必要条件。 • 具有较小的分子量，较高的拷贝数， 具有较小的分子量，较高的拷贝数， 是一个松弛型的质粒。 是一个松弛型的质粒。 松弛型的质粒 • 具有某种选择性标记以区别转化和 具有某种选择性标记以区别转化和 选择性标记 非转化细胞。 非转化细胞。大多是一些抗菌素抗 性基因， 性基因，赋予受体细胞对某些抗生 素的抗性，为转化子选择提供便利。 素的抗性，为转化子选择提供便利。 （Ampr；Tetr） • 具有若干限制性内切酶单一识别位 具有若干限制性内切酶单一识别位 单一 点，便于外源基因插入。 便于外源基因插入。
粘性末端： 粘性末端：相同的粘性末端互相配对进行连接
两种情况： 两种情况：
（a）目的基因和载体 目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接。载体 目的基因和载体 易自身环化。 用碱性磷酸酶(能除掉DNA两端的5’ 磷酸基团）处 理载体，可防止载体自身环化。
（b）目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶 切割后连接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆)。
• •
通过RT-PCR 方法得到目的基因 方法得到目的基因cDNA 通过 人工合成基因片段（价钱昂贵） 人工合成基因片段（价钱昂贵）
目的基因来源选择： 目的基因来源选择： 来源选择
• 取决于解决什么问题？ 取决于解决什么问题？ 基因功能研究
cDNA RT-PCR
基因表达调控的研究
基因组DNA PCR