基因工程技术课件
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基因工程ppt课件
提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与: cDNA合成法
+ 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补 的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。
+ 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解， 使之变成单链的的基因主要是指___编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因_
请举出三个以上的例子
供体生物细胞
2、获人工化学合成
限制酶
取出 DNA 用限制酶剪 去与模板互补的DNA双链） 重复循环
16
实际具体过程
17
PCR技术
• 原理： DNA复制 • 前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列 • 原料
模板DNA；DNA引物；四种脱氧 核苷酸；热稳定DNA聚合酶 （Taq酶）
• 方式：以_指__数__方式扩增，
PCR扩增仪
即_2_n__（n为扩增循环的次数）
18
1、概念：
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。 通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物 的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
1
2. 基因工程最基本的工具 ──限制性内切酶
以大肠杆菌中的一种叫做EcoRІ的限制酶为例：
限制酶
结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。
终止子：位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断，能 终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别 受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细
27
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD
A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
一定大小的DNA片段
将DNA片段与: cDNA合成法
+ 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补 的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。
+ 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解， 使之变成单链的的基因主要是指___编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因_
请举出三个以上的例子
供体生物细胞
2、获人工化学合成
限制酶
取出 DNA 用限制酶剪 去与模板互补的DNA双链） 重复循环
16
实际具体过程
17
PCR技术
• 原理： DNA复制 • 前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列 • 原料
模板DNA；DNA引物；四种脱氧 核苷酸；热稳定DNA聚合酶 （Taq酶）
• 方式：以_指__数__方式扩增，
PCR扩增仪
即_2_n__（n为扩增循环的次数）
18
1、概念：
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。 通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物 的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
1
2. 基因工程最基本的工具 ──限制性内切酶
以大肠杆菌中的一种叫做EcoRІ的限制酶为例：
限制酶
结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。
终止子：位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断，能 终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别 受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细
27
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD
A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
高中生物基因工程课件
毒性和提高免疫原性。
基因工程疫苗的应用
03
预防传染病，如乙型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗等，降低人
群发病率。
基因工程抗体
基因工程抗体的种类
包括单克隆抗体、双特异性抗体、人源化抗体等。
基因工程抗体的制备
通过基因工程技术克隆和表达抗体的重链和轻链可变区基因，与适 当的恒定区基因融合，在哺乳动物细胞中表达。
公众参与与透明度
加强公众参与和透明度，促进利益相关方的对话 和协商，共同制定符合各方利益的决策。
3
国际合作与协调
加强国际合作与协调，共同制定国际性的伦理准 则和法律法规，促进全球范围内的公平和平等。
谢谢
THANKS
生物固氮
通过基因工程技术将固氮基因转入植物，提高植 物的固氮能力，减少化肥使用。
生物农药
通过基因工程技术生产具有杀虫、杀菌作用的生 物农药，减少化学农药的使用。
基因编辑技术
利用基因编辑技术如CRISPR-Cas9等对作物进行 精确的基因改造，提高作物的抗逆性和产量。
05 基因工程与环境保护
CHAPTER
生物的遗传性状。
基因工程原理
基因工程基于分子生物学和遗传学 原理，通过改变生物体的基因组， 实现对生物性状的遗传改良。
基因工程操作步骤
基因工程的操作步骤包括基因克隆 、载体构建、受体细胞转化、基因 表达和产物分离纯化等。
基因工程的历史与发展
基因工程的起源
基因工程的未来发展
基因工程起源于20世纪70年代，当时 科学家发现了限制性内切酶和DNA连 接酶，为基因操作提供了工具。
基因工程在土壤修复中的应用
土壤修复是指通过各种手段改善土壤质量，降低土壤污染 对环境和人体健康的影响。基因工程技术可以帮助我们培 育出具有特定功能的植物，用于土壤修复。
基因工程-课件ppt
(7)用于载体的质粒 DNA 分子上至少含一个限制酶识别位点(√ )
(8)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在
并表达
(√)
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
2．载体需具备的条件及其作用(连线)
对点落实
返回
1．(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个 DNA 片段上依次表示出了
EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和 Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列
与 切 割 位 点 ， 图 (b) 为 某 种 表 达 载 体 的 示 意 图 ( 载 体 上 的
EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
↓
↓
↓
——GAATTC—— ——GGATCC—— ——GATC——
返回
(2)写出产生的末端的种类：①产生的是黏性末端；②产生的 是 平末端 。 (3)EcoRⅠ限制酶和 SmaⅠ限制酶识别的碱基序列 不同，切割 位点不同 (填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性 。
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
图(b)
图(c)
(3)DNA 连接酶是将两个 DNA 片段连接起来的酶，常见的
有__E_·_c_o_l_i__D_NA_连__接__酶_和____T_4D_N_A_连___接__酶___，其中既能连接黏 性末端又能连接平末端的是__T_4D_N_A__连__接__酶___。
解析
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
《基因工程简介》课件
前沿的学科，将对医学、农业、环境和能源等领域带来深刻的变革和进步。了解基因工程的基本概 念、应用和挑战，是我们迎接未来科技发展的重要一步。
基因转导
将外源基因导入目标细胞，实 现基因功能的调控和表达。
基因编辑
利用CRISPR-Cas9等技术，对基 因组中的特定位置进行精确编 辑和改造。
基因工程的伦理和风险问题
1 伦理问题
基因工程涉及对生命和基因的控制，引发伦理和道德层面的反思和讨论。
2 风险问题
基因工程可能带来环境风险和基因突变等潜在问题，需要严格的安全评估和监管。
《基因工程简介》PPT课 件
基因工程是一门研究控制和改变生物基因组的学科。通过改变生物体基因组 的结构和组织，可以产生改善农作物、生产药物、治疗疾病等社会需求的生 物。
基因工程的定义
基因工程是一种重要的生物技术，利用现代分子遗传学和基因组学知识，设 计和操作基因的技术，以改变生物体的特征，实现对生命过程和物质转化的 控制。
农业生产
基因工程可以改良农作物，提高产 量和耐性，解决粮食安全和环境问 题，为农业生产带来巨大变革。
基因编辑
通过基因编辑技术，可以精确修改 和调整生物基因组，开辟了新的治 疗疾病和改良物种的途径。
基因工程的主要技术方法
基因克隆
将感兴趣的基因从一个物种转 移到另一个物种，以实现基因 的功能研究和应用。
3 社会问题
基因工程引发公众关注和争议，涉及科技发展与社会责任之间的平衡问题。
基因工程的未来发展趋势
精准医学
基因工程将深化个体基因组研究， 实现个体化治疗和预防，推动精 准医学的发展。
生物能源
基因工程技术有望提升生物能源 的生产效率，推动可再生能源的 发展和应用。
基因转导
将外源基因导入目标细胞，实 现基因功能的调控和表达。
基因编辑
利用CRISPR-Cas9等技术，对基 因组中的特定位置进行精确编 辑和改造。
基因工程的伦理和风险问题
1 伦理问题
基因工程涉及对生命和基因的控制，引发伦理和道德层面的反思和讨论。
2 风险问题
基因工程可能带来环境风险和基因突变等潜在问题，需要严格的安全评估和监管。
《基因工程简介》PPT课 件
基因工程是一门研究控制和改变生物基因组的学科。通过改变生物体基因组 的结构和组织，可以产生改善农作物、生产药物、治疗疾病等社会需求的生 物。
基因工程的定义
基因工程是一种重要的生物技术，利用现代分子遗传学和基因组学知识，设 计和操作基因的技术，以改变生物体的特征，实现对生命过程和物质转化的 控制。
农业生产
基因工程可以改良农作物，提高产 量和耐性，解决粮食安全和环境问 题，为农业生产带来巨大变革。
基因编辑
通过基因编辑技术，可以精确修改 和调整生物基因组，开辟了新的治 疗疾病和改良物种的途径。
基因工程的主要技术方法
基因克隆
将感兴趣的基因从一个物种转 移到另一个物种，以实现基因 的功能研究和应用。
3 社会问题
基因工程引发公众关注和争议，涉及科技发展与社会责任之间的平衡问题。
基因工程的未来发展趋势
精准医学
基因工程将深化个体基因组研究， 实现个体化治疗和预防，推动精 准医学的发展。
生物能源
基因工程技术有望提升生物能源 的生产效率，推动可再生能源的 发展和应用。
基因工程技术ppt课件
是指目的基因在受体细胞内表达，研究功能。
3
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
应用：
• 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 • 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成,生产多肽
产品。 • 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调
载体：
• 载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目 的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。
• 种类： 按来源分： 质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、 柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ). 按作用分： 克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、 穿梭载体(shuttle vector)
四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏 抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组 和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停 止时，它仍能继续复制。
16
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
17
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
18
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程TA 源自隆AA19
3
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
应用：
• 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 • 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成,生产多肽
产品。 • 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调
载体：
• 载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目 的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。
• 种类： 按来源分： 质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、 柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ). 按作用分： 克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、 穿梭载体(shuttle vector)
四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏 抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组 和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停 止时，它仍能继续复制。
16
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
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病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
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病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程TA 源自隆AA19
基因工程简介PPT课件
• 细胞染色体外能自主复制的小型环状 DNA分子；
• 质粒是基因工程中最常用的运载体； • 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒； • 质粒的存在对宿主细胞无影响； • 质粒的复制只能在宿主细胞内完成。
.
15
（三）、基因工程操作的步骤
提取 目的 基因
目的基 因与运 载体结 合
将目的 基因导 入受体 细胞
目的基 因地检 测和表 达
.
•用与提取目的基
因相同的限制
酶切割质粒使之 出现一个切口， 将目的基因插入 切口处，让目的 基因的黏性末端 与切口上的黏性 末端互补配对后， 在DNA连接酶的 作用下连接形成 重组DNA分子 （重组质粒）
20
3、将目的基因导入受体细胞（并扩增）
• 基因工程中常用的受体细胞：
• 导入受体细胞常用的方法：
功能受损。
1971年，美国科学家在体外做了试验， 用带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染患 者的离体组织细胞，结果发现这些组织细胞 能够利用半乳糖了。这表明，用基因替换的 方法治疗这种遗传病是可能的。
.
4
（一）、基因工程概念
——定向改造生物的新技术
别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程
结果
基因拼接技术 或DNA重组技术 生物外
将目的基因导 入受体细胞
• 目的基因的扩增
将受体细胞 进行扩增
.
21
4、目的基因的检测和表达：
• 为什么要检测？ • 检测方法？
.
22
表达：受体细胞表现出特定的性状。
例：用棉铃饲喂棉 铃虫，如虫吃后不出现 中毒症状，说明未摄入 目的基因或摄入目的基 因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了 抗虫基因并得到表达。
• 质粒是基因工程中最常用的运载体； • 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒； • 质粒的存在对宿主细胞无影响； • 质粒的复制只能在宿主细胞内完成。
.
15
（三）、基因工程操作的步骤
提取 目的 基因
目的基 因与运 载体结 合
将目的 基因导 入受体 细胞
目的基 因地检 测和表 达
.
•用与提取目的基
因相同的限制
酶切割质粒使之 出现一个切口， 将目的基因插入 切口处，让目的 基因的黏性末端 与切口上的黏性 末端互补配对后， 在DNA连接酶的 作用下连接形成 重组DNA分子 （重组质粒）
20
3、将目的基因导入受体细胞（并扩增）
• 基因工程中常用的受体细胞：
• 导入受体细胞常用的方法：
功能受损。
1971年，美国科学家在体外做了试验， 用带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染患 者的离体组织细胞，结果发现这些组织细胞 能够利用半乳糖了。这表明，用基因替换的 方法治疗这种遗传病是可能的。
.
4
（一）、基因工程概念
——定向改造生物的新技术
别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程
结果
基因拼接技术 或DNA重组技术 生物外
将目的基因导 入受体细胞
• 目的基因的扩增
将受体细胞 进行扩增
.
21
4、目的基因的检测和表达：
• 为什么要检测？ • 检测方法？
.
22
表达：受体细胞表现出特定的性状。
例：用棉铃饲喂棉 铃虫，如虫吃后不出现 中毒症状，说明未摄入 目的基因或摄入目的基 因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了 抗虫基因并得到表达。
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使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入 适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译 （pCDNA3）。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
穿梭载体(shuttIe vector)
能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体. 其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的 复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS），它即能在 原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用 于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移。
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质粒载体
• 具有复制起始点，这是质粒自我增 殖的必要条件。
• 具有较小的分子量，较高的拷贝数， 是一个松弛型的质粒。
• 具有某种选择性标记以某些抗生
素的抗性，为转化子选择提供便利。
转
导入到合适的受体细胞（转化）
筛
筛选含有重组分子的克隆
鉴
鉴定重组分子片段
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基因工程流程示意图
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构建重组分子（连接）
• 原料： 目的基因：研究对象 载体：目的基因的运载工具 工具酶：连接酶、限制性内切酶
• 种类： 按来源分： 质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、 柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ). 按作用分： 克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、 穿梭载体(shuttle vector)
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目的基因片段来源：
• 基因组DNA • PCR 方法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列，
已目的基因cDNA • 人工合成基因片段（价钱昂贵）
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
The Nobel Prize in Chemistry 1980
Jackson, Symons,and Berg (1972) – generated first recombinant DNA molecules
Cohen and Boyer (1973) – produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host vectors – carriers of foreign DNA
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基因克隆(gene cloning )：
是指目的基因与载体DNA连接构成的DNA重组体在受体细胞 内进行复制、扩增的技术。
基因表达(gene expression)：
是指目的基因在受体细胞内表达，研究功能。
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定义：
• 基因工程（gene engineering）
重组DNA技术（recombinant DNA technique）：是指在各种酶 的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）在体外与病毒、细菌 或其它载体通过入工剪切、连接构成重组DNA分子，将其导入受体 细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和 表达，这种有目的的 应用分子克隆技术,人为的改造基因,改变生物的遗传性状的系列过 程,总称为基因工程
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目的基因来源选择：
• 取决于解决什么问题？
基因功能研究
cDNA RT-PCR
基因表达调控的研究
基因组DNA PCR
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PCR：
• 引入合适的酶切位点，一个/两个。 • 加保护碱基，1-3个。 • 加上想要的标签，如 Flag, Myc, His, HA。 • 启始及终止密码子。
四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏 抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组 和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停 止时，它仍能继续复制。
高保真聚合酶：HF, Pfu, Probest 等。
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片断的回收与纯化
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载体：
• 载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目 的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。
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• 克隆载体(cloning vector)
用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分 子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它 质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建（PBR322）。
• 表达载体(expression vector)
应用：
• 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 • 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成,生产多肽
产品。 • 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调
控机制等
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基因工程基本步骤：
分、切
目的基因 + 载体分子
接
构成重组DNA分子
（Ampr；Tetr）
是细菌染色体外能够自我复
• 具有若干限制性内切酶单一识别位
制的双链环状 DNA 分子。
点，便于外源基因插入。
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克隆载体: PBR322
特点： • 分子量小，4.3kb，便于操作。 • 有两个抗性基因，便于转化子筛选。 • 有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，7种位于
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穿梭载体(shuttIe vector)
能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体. 其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的 复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS），它即能在 原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用 于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移。
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质粒载体
• 具有复制起始点，这是质粒自我增 殖的必要条件。
• 具有较小的分子量，较高的拷贝数， 是一个松弛型的质粒。
• 具有某种选择性标记以某些抗生
素的抗性，为转化子选择提供便利。
转
导入到合适的受体细胞（转化）
筛
筛选含有重组分子的克隆
鉴
鉴定重组分子片段
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基因工程流程示意图
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构建重组分子（连接）
• 原料： 目的基因：研究对象 载体：目的基因的运载工具 工具酶：连接酶、限制性内切酶
• 种类： 按来源分： 质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、 柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ). 按作用分： 克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、 穿梭载体(shuttle vector)
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目的基因片段来源：
• 基因组DNA • PCR 方法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列，
已目的基因cDNA • 人工合成基因片段（价钱昂贵）
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
The Nobel Prize in Chemistry 1980
Jackson, Symons,and Berg (1972) – generated first recombinant DNA molecules
Cohen and Boyer (1973) – produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host vectors – carriers of foreign DNA
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
基因克隆(gene cloning )：
是指目的基因与载体DNA连接构成的DNA重组体在受体细胞 内进行复制、扩增的技术。
基因表达(gene expression)：
是指目的基因在受体细胞内表达，研究功能。
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定义：
• 基因工程（gene engineering）
重组DNA技术（recombinant DNA technique）：是指在各种酶 的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）在体外与病毒、细菌 或其它载体通过入工剪切、连接构成重组DNA分子，将其导入受体 细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和 表达，这种有目的的 应用分子克隆技术,人为的改造基因,改变生物的遗传性状的系列过 程,总称为基因工程
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目的基因来源选择：
• 取决于解决什么问题？
基因功能研究
cDNA RT-PCR
基因表达调控的研究
基因组DNA PCR
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PCR：
• 引入合适的酶切位点，一个/两个。 • 加保护碱基，1-3个。 • 加上想要的标签，如 Flag, Myc, His, HA。 • 启始及终止密码子。
四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏 抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组 和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停 止时，它仍能继续复制。
高保真聚合酶：HF, Pfu, Probest 等。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
片断的回收与纯化
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
载体：
• 载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目 的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。
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• 克隆载体(cloning vector)
用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分 子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它 质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建（PBR322）。
• 表达载体(expression vector)
应用：
• 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 • 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成,生产多肽
产品。 • 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调
控机制等
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基因工程基本步骤：
分、切
目的基因 + 载体分子
接
构成重组DNA分子
（Ampr；Tetr）
是细菌染色体外能够自我复
• 具有若干限制性内切酶单一识别位
制的双链环状 DNA 分子。
点，便于外源基因插入。
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克隆载体: PBR322
特点： • 分子量小，4.3kb，便于操作。 • 有两个抗性基因，便于转化子筛选。 • 有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，7种位于