版药典药品微生物限度检查法

举例
一.六味地黄丸微生物限度检查法
检验方法 取本品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲
液100ml，使分散均匀，作为1：10供试液； 取供试液按常规法测定细菌数、霉菌及酵母 菌数，并进行控制菌和大肠菌群检查。
方法说明
六味地黄丸处方为熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、 泽泻，均没有明显抑菌作用。验证实验中，采用常规法测定 5株验证菌株（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希 菌、白色念珠菌和黑曲霉）的回收率，均符合要求，故进行 细菌、霉菌及酵母菌计数时可采用常规法测定。对于控制菌 和大肠菌群检查，采用大肠埃希菌为对照，与不加供试液的 阳性对照比较，生长正常，故控制菌和大肠菌群检查亦可按 常规法检验。
验证时，加菌是在最后一次冲洗中，加入的 菌量不要超过100个。
同时应作稀释液回收。
薄膜过滤法注意事项：
1.滤膜孔径应不大于0.45um,直径约为50nm.选择滤膜材质时应 保证供试品及溶剂不影响微生物的充分被截留.滤器及滤膜使 用前应采用适宜的方法灭菌. 2.使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性.水溶性供试液过滤 前先将少量的冲洗液润湿滤膜.油类供试品,其滤膜和过滤器在 使用前应充分干燥.为发挥滤膜的最大过滤效率,应保持供试品 溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面. 3.供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每 次冲洗冲洗量为100ml,每片滤膜的总过滤量不宜过大,以避免 滤膜上的微生物受损.
微生物检查方法
常规法 培养基稀释法 离心沉淀集菌法 薄膜过滤法 中和法
回收率测定
1) 试验组：分别1：10供试液1 ml、50~100cfu/ ml 试 验菌株同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养 基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结 果。薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌
结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。 若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和 控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查； 若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释 法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法 等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑 菌活性，并重新进行方法验证。
检查法
供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。 阳性对照试验 进行供试品控制菌检查时，应做 阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为 10~100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳 性对照试验应检出相应的控制菌。 阴性对照试验 取稀释液10ml照相应控制菌检 查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生 长。
清液，留底部集菌液约2ml用。
薄膜过滤法
取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液,加至适 量的稀释剂中,混匀,过滤.若供试品每1g或1ml所含 的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液1ml,过滤. 用7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲 洗液冲洗滤膜,冲洗方法和冲洗量同计数方法的验证 。冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或 玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培 养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜.
取规定量的供试液至较大量的培养基中，使 单位体积内的供试品含菌量减少，至不含抑 菌作用。
一般可以0.5ml/皿，0.2 ml/皿，0.1 ml/皿
离心法
离心法有低速离心法和高速离心法 低速离心法是500转/分离心5分钟，取上清液
备用。 高速离心法是3000转/分离心20分钟，弃去上
回收率计算
样品回收率计算公式=((试验组平均菌数-供试 液对照组平均数)÷活菌组平均菌数)*100%
表1 菌落计数（cfu/ml）

试验菌 实验次数 试验组 活菌组 供试液对照组
大肠杆菌 1
54 49 62 60
0

2
98 87 102 94
0

3
45 50 55 57
0
金黄色 1
三.双黄连口服液微生物限度检查法
细菌数测定 取本品原液，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
100ml，使分散均匀，采用薄膜过滤法，滤过，以 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜（约 100ml/次，冲洗3次），测定细菌数。以金黄色葡 萄球菌[CMCC（B）26 003]为阳性对照。 霉菌及酵母菌数测定 取本品原液，按常规法测定霉菌及酵母菌数。 控制菌检查 取本品原液1ml加入100ml胆Baidu Nhomakorabea乳糖增菌液，按常规 法测定。
菌种 对试验菌种的要求同细菌、霉菌和酵母菌计数
方法的验证。
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
乙型副伤寒沙门菌
铜绿假单胞菌
生孢梭菌
菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙
型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养 肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培 养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时。 用 0.9% 无 菌 氯 化 钠 溶 液 制 成 每 1ml 含 菌 数 为 10 ～ 100cfu的菌悬液。
供试液的制备
液体供试品 固体、半固体或粘稠性供试品
取供试品10 g（10ml) ，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100ml,混匀，为1：10供试液，

需用特殊供试液制备方法的供试品

非水溶性供试品

膜剂供试品

肠溶及结肠溶制剂供试品

气雾剂、喷雾剂供试品
非水溶性供试品
取本品10g，置输液瓶中加无菌十四烷酸异丙 脂20ml，充分振摇，使供试品溶解。
培养 温度
细菌为30～35℃ 霉菌及酵母菌 为23～28℃ 控制菌为35～37℃
检验量
一般供试品的检验量为10g或10ml，化学膜 剂为100cm2。贵重药品，微量包装药品的检 验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品， 其检验量应增加10g或10ml。
检验时应从2个以上最小包装单位中抽取供试 品，膜剂还不得少于4片。
（2阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了 验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试 验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌 检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌； 验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，梭菌 检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴 性对照菌不得检出。
（2阴性菌对照组
如常规法作大肠埃希菌检查：取pH7.0无菌氯 化钠-蛋白胨缓冲液10ml及金黄色葡萄球菌菌 液1ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，按大肠 埃希菌检查法进行检查。
60 58 67 75
0
葡萄球菌 2
50 45 58 53 0

3
71 73 78 73
0
枯草杆菌 1
49 41 58 55
0

2
38 42 45 52
0

3
74 80 85 88
0
白色念珠菌 1 101 90 103 104
0

2 79 75 81 89 0

3 85 83 95 86 0
注意事项
用于检验的供试品应按药典规定取自至少两个独立包装，取 样前混匀，供试品须经研磨、匀浆等方法尽量分散均匀。
二、非水溶性供试品（含凡士林基质 及乳膏剂）供试液制备
1、样品：红霉素软膏 2、薄膜过滤法：取供试品10g，加至20ml十四烷酸异丙酯
（必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量），充分振摇，使供 试品溶解。然后加入45℃左右的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓 冲液100ml，振摇5-10分钟，萃取后，静置使油水明显分层， 取其水层为1：10的供试液 3、取供试液1ml注入开放式滤器，用冲洗液冲洗滤膜，每 次冲洗量为100ml，消除抗菌作用后，取出滤膜贴于规定的 琼脂平板，置规定温度培养24-72小时，逐日观察结果 4、阳性对照：薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌
常规法
(1) 试验组: 分别取1：10供试液1 ml、试验菌株1ml 同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后， 置规定温度培养24~72小时观察结果。每株试验菌平 行制备2个平皿。 (2) 活菌组 测定每一菌株的试验菌数 各取试验菌液1 ml加入平皿中，立即倾注琼脂培养基， 待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。每 株试验菌平行制备2个平皿。 (3) 供试液对照 测定供试品本底菌数 取1：10供试液1 ml加入平皿中，立即倾注琼脂培养 基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。 细菌、霉菌及酵母菌平行制备2个平皿。
2) 活菌组：测定每一菌株加的试验菌数
3) 供试液对照：测定供试品本底菌数
4) 稀释剂对照组
稀释剂对照组
供试品制备需要分散、乳化、中和、离心或 薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照 组，以考察供试液制备过程中微生物受影响 的程度。
菌液制备
1．取经37℃培养18-24小时，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌肉汤培养物1ml加9ml生理盐水10倍稀释至10-5 ~10-9，为50~100个/ml，做活菌计数备用 2．取经25℃ 培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物 1ml加9 ml生理盐水10倍稀释至10-5 ~10-7，为50~100个/ml，做 活菌计数备用 3．取经25℃ 培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加3~5ml盐水 洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 取1 ml 加9 ml生理盐水，逐管 10倍稀释为10-4 ~10-6约50~100个/ ml，做活菌计数备用
4.阴性对照 取试验用的稀释液1ml,照上述薄膜
过滤法操作,作为阴性对照.阴性对照不得有菌生长.
5.培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法,
每片滤膜上的菌数应不超过100.
6.菌数报告规则 以相当于1g或1ml供试品的
菌落数报告菌数.若滤膜上无菌落生长,以＜1报告 菌数(每张滤膜过滤1g或1ml供试品),或＜1乘以稀 释倍数的值报告菌数.
验证方法
（1）试验组 取规定量供试液及 10~100cfu试验菌加入增菌培养基中， 依相应控制菌检查法进行检查。 如常规法取10ml供试液加1ml菌液加 入增菌培养基。 当采用薄膜过滤法时，取规定量供试 液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后 一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培 养基或取出滤膜接入增菌培养基中。
中和法
针对品种选用特殊的中和剂或灭活剂。 中和剂或灭活剂可以加在所用的稀释液或培
养基中。
控制菌检查
控制菌检查方法的验证 当建立药品的微生物限度检查法时,应进行控
制菌检查方法的验证,以确认所采用的方法适 合于该药品的控制菌检查.若药品的组分或原 检验条件发生改变可能影响检验结果时,检查 方法应重新验证.
然后加45℃ pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 100ml，充分振摇，将输液瓶倒置，静置使油 水明显分层，分别取其水层1ml加入平皿。
验证试验
一 、目的：确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性 二 、内容：细菌、霉菌及酵母菌数测定（即：对5株阳性 对照实验菌株的回收率逐一进行验证） 三 、菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]、 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )[CMCC(B) 26003]、 大肠杆菌（Escherichia coli） [CMCC(F) 44102]、 白色念珠菌(Candida a lbicans )[CMCC(F ) 98001]、 黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003] 四 、方法：中国药典2005版微生物限度检查法方法验证实 验 五 、方法验证：细菌、霉菌酵母菌数测定，至少应进行3 次独立的平行实验，每次平行实验回收率逐均应在70%以上
黑曲霉 1 61 57 68 65 0

2 49 47 51 54 0

3 95 94 105 96 0
回收率 84％ 94％ 88％ 83％ 86％ 95％ 80% 82% 89%
92% 91% 93%
89% 91% 94%
培养基稀释法
当供试品五种菌中有一种菌的回收率未达到 70％时，首先考虑用培养基稀释法。
2005版药典药品微生物限度检查法
概念
微生物限度检查法系指检查非规定灭菌制剂 及其原料，辅料受微生物污染程度的方法。 检查项目包括细菌数，霉菌数及酵母菌数及 控制菌检查
环境条件
应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100 级的单项流空气区域内进行。检验全过程必 须严格遵守无菌操作，防止再污染。洁净区 域应定期进行洁净度验证。