版药典药品微生物限度检查法

黑曲霉 1 61 57 68 65 0

2 49 47 51 54 0

3 95 94 105 96 0
回收率 84％ 94％ 88％ 83％ 86％ 95％ 80% 82% 89%
92% 91% 93%
89% 91% 94%
培养基稀释法
当供试品五种菌中有一种菌的回收率未达到 70％时，首先考虑用培养基稀释法。
供试液的制备
液体供试品 固体、半固体或粘稠性供试品
取供试品10 g（10ml) ，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100ml,混匀，为1：10供试液，

需用特殊供试液制备方法的供试品

非水溶性供试品

膜剂供试品

肠溶及结肠溶制剂供试品

气雾剂、喷雾剂供试品
非水溶性供试品
取本品10g，置输液瓶中加无菌十四烷酸异丙 脂20ml，充分振摇，使供试品溶解。
举例
一.六味地黄丸微生物限度检查法
检验方法 取本品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲
液100ml，使分散均匀，作为1：10供试液； 取供试液按常规法测定细菌数、霉菌及酵母 菌数，并进行控制菌和大肠菌群检查。
方法说明
六味地黄丸处方为熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、 泽泻，均没有明显抑菌作用。验证实验中，采用常规法测定 5株验证菌株（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希 菌、白色念珠菌和黑曲霉）的回收率，均符合要求，故进行 细菌、霉菌及酵母菌计数时可采用常规法测定。对于控制菌 和大肠菌群检查，采用大肠埃希菌为对照，与不加供试液的 阳性对照比较，生长正常，故控制菌和大肠菌群检查亦可按 常规法检验。
（2阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了 验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试 验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌 检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌； 验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，梭菌 检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴 性对照菌不得检出。
（2阴性菌对照组
如常规法作大肠埃希菌检查：取pH7.0无菌氯 化钠-蛋白胨缓冲液10ml及金黄色葡萄球菌菌 液1ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，按大肠 埃希菌检查法进行检查。
回收率计算
样品回收率计算公式=((试验组平均菌数-供试 液对照组平均数)÷活菌组平均菌数)*100%
表1 菌落计数（cfu/ml）

试验菌 实验次数 试验组 活菌组 供试液对照组
大肠杆菌 1
54 49 62 60
0

2
98 87 102 94
0

3
45 50 55 57
0
金黄色 1
验证时，加菌是在最后一次冲洗中，加入的 菌量不要超过100个。
同时应作稀释液回收。
薄膜过滤法注意事项：
1.滤膜孔径应不大于0.45um,直径约为50nm.选择滤膜材质时应 保证供试品及溶剂不影响微生物的充分被截留.滤器及滤膜使 用前应采用适宜的方法灭菌. 2.使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性.水溶性供试液过滤 前先将少量的冲洗液润湿滤膜.油类供试品,其滤膜和过滤器在 使用前应充分干燥.为发挥滤膜的最大过滤效率,应保持供试品 溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面. 3.供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每 次冲洗冲洗量为100ml,每片滤膜的总过滤量不宜过大,以避免 滤膜上的微生物受损.
然后加45℃ pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 100ml，充分振摇，将输液瓶倒置，静置使油 水明显分层，分别取其水层1ml加入平皿。
验证试验
一 、目的：确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性 二 、内容：细菌、霉菌及酵母菌数测定（即：对5株阳性 对照实验菌株的回收率逐一进行验证） 三 、菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]、 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )[CMCC(B) 26003]、 大肠杆菌（Escherichia coli） [CMCC(F) 44102]、 白色念珠菌(Candida a lbicans )[CMCC(F ) 98001]、 黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003] 四 、方法：中国药典2005版微生物限度检查法方法验证实 验 五 、方法验证：细菌、霉菌酵母菌数测定，至少应进行3 次独立的平行实验，每次平行实验回收率逐均应在70%以上
清液，留底部集菌液约2ml用。
薄膜过滤法
取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液,加至适 量的稀释剂中,混匀,过滤.若供试品每1g或1ml所含 的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液1ml,过滤. 用7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲 洗液冲洗滤膜,冲洗方法和冲洗量同计数方法的验证 。冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或 玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培 养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜.
三.双黄连口服液微生物限度检查法
细菌数测定 取本品原液，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
100ml，使分散均匀，采用薄膜过滤法，滤过，以 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜（约 100ml/次，冲洗3次），测定细菌数。以金黄色葡 萄球菌[CMCC（B）26 003]为阳性对照。 霉菌及酵母菌数测定 取本品原液，按常规法测定霉菌及酵母菌数。 控制菌检查 取本品原液1ml加入100ml胆盐乳糖增菌液，按常规 法测定。
4.阴性对照 取试验用的稀释液1ml,照上述薄膜
过滤法操作,作为阴性对照.阴性对照不得有菌生长.
5.培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法,
每片滤膜上的菌数应不超过100.
6.菌数报告规则 以相当于1g或1ml供试品的
菌落数报告菌数.若滤膜上无菌落生长,以＜1报告 菌数(每张滤膜过滤1g或1ml供试品),或＜1乘以稀 释倍数的值报告菌数.
60 58 67 75
0
葡萄球菌 2
50 45 58 53 0

3
71 73 78 73
0
枯草杆菌 1
49 41 58 55
0

2
38 42 45 52
0

3 1 101 90 103 104
0

2 79 75 81 89 0

3 85 83 95 86 0
培养 温度
细菌为30～35℃ 霉菌及酵母菌 为23～28℃ 控制菌为35～37℃
检验量
一般供试品的检验量为10g或10ml，化学膜 剂为100cm2。贵重药品，微量包装药品的检 验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品， 其检验量应增加10g或10ml。
检验时应从2个以上最小包装单位中抽取供试 品，膜剂还不得少于4片。
2005版药典药品微生物限度检查法
概念
微生物限度检查法系指检查非规定灭菌制剂 及其原料，辅料受微生物污染程度的方法。 检查项目包括细菌数，霉菌数及酵母菌数及 控制菌检查
环境条件
应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100 级的单项流空气区域内进行。检验全过程必 须严格遵守无菌操作，防止再污染。洁净区 域应定期进行洁净度验证。
常规法
(1) 试验组: 分别取1：10供试液1 ml、试验菌株1ml 同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后， 置规定温度培养24~72小时观察结果。每株试验菌平 行制备2个平皿。 (2) 活菌组 测定每一菌株的试验菌数 各取试验菌液1 ml加入平皿中，立即倾注琼脂培养基， 待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。每 株试验菌平行制备2个平皿。 (3) 供试液对照 测定供试品本底菌数 取1：10供试液1 ml加入平皿中，立即倾注琼脂培养 基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。 细菌、霉菌及酵母菌平行制备2个平皿。
微生物检查方法
常规法 培养基稀释法 离心沉淀集菌法 薄膜过滤法 中和法
回收率测定
1) 试验组：分别1：10供试液1 ml、50~100cfu/ ml 试 验菌株同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养 基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结 果。薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌
结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。 若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和 控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查； 若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释 法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法 等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑 菌活性，并重新进行方法验证。
检查法
供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。 阳性对照试验 进行供试品控制菌检查时，应做 阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为 10~100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳 性对照试验应检出相应的控制菌。 阴性对照试验 取稀释液10ml照相应控制菌检 查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生 长。
取规定量的供试液至较大量的培养基中，使 单位体积内的供试品含菌量减少，至不含抑 菌作用。
一般可以0.5ml/皿，0.2 ml/皿，0.1 ml/皿
离心法
离心法有低速离心法和高速离心法 低速离心法是500转/分离心5分钟，取上清液
备用。 高速离心法是3000转/分离心20分钟，弃去上
验证方法
（1）试验组 取规定量供试液及 10~100cfu试验菌加入增菌培养基中， 依相应控制菌检查法进行检查。 如常规法取10ml供试液加1ml菌液加 入增菌培养基。 当采用薄膜过滤法时，取规定量供试 液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后 一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培 养基或取出滤膜接入增菌培养基中。
2) 活菌组：测定每一菌株加的试验菌数
3) 供试液对照：测定供试品本底菌数
4) 稀释剂对照组
稀释剂对照组
供试品制备需要分散、乳化、中和、离心或 薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照 组，以考察供试液制备过程中微生物受影响 的程度。