PBMC的分离
PBMC提取
PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。
其中淋巴细胞占很大一部分。
分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml 仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。
红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。
吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
注意事项全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。
否则将分层混乱。
步骤：配制所需的溶液：a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；c.将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；d.取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。
然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。
离心完毕将得到如图所示分层；PBMC所在细胞层为白色。
此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml 离心管中。
e.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；f.加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；g.细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。
pbmc离心条件
pbmc离心条件PBMC离心条件PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血单个核细胞的简称，它是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞等。
离心是一种常见的分离技术，可以将PBMC从外周血中分离出来。
离心条件对于PBMC的纯度和活力至关重要。
本文将详细介绍PBMC离心条件的相关内容。
一、离心设备选择在PBMC离心过程中，常用的离心设备有离心管、离心机和离心离心管。
离心管是最常用的离心设备，适用于小规模的离心。
离心机则适用于大规模离心，可以同时离心多个样本。
离心离心管则是一种专门用于离心PBMC的设备，其设计使得PBMC可以在离心过程中得到更好的保护，减少损伤。
二、离心速度和时间离心速度和时间是影响PBMC离心效果的重要因素。
一般来说，离心速度越高，离心时间越长，可以得到更纯的PBMC。
但是过高的离心速度和时间也会对PBMC造成损伤，影响其活力。
因此，在选择离心速度和时间时，需要根据具体实验要求和离心设备的要求进行调整。
三、离心温度和离心液离心温度和离心液对于PBMC的离心效果也有重要影响。
一般来说，较低的离心温度可以保护PBMC的活力，常用的离心温度为4摄氏度。
离心液的选择也要根据实验需要进行调整，常用的离心液有PBS、Ficoll等。
离心液的选择应考虑其密度梯度和对PBMC的影响。
四、离心后的处理离心后，需要对分离得到的PBMC进行进一步的处理。
常见的处理方法包括洗涤、冻存和培养。
洗涤可以去除离心液和杂质，保证PBMC的纯度。
冻存可以将PBMC保存起来，以备后续实验使用。
培养可以使PBMC在适当的条件下继续生长和增殖。
总结：PBMC离心条件对于实验结果的准确性和可靠性至关重要。
合理选择离心设备、调整离心速度和时间、控制离心温度和离心液，以及适当处理离心后的PBMC，都是保证离心效果的关键。
只有在严格控制离心条件的前提下，才能得到高质量的PBMC，为后续的实验提供可靠的基础数据。
ficoll分离法分离pbmc
ficoll分离法分离pbmcFicoll分离法分离PBMC的介绍PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell），又称外周血单个核细胞，是人体免疫系统中重要的组成部分。
PBMC中包含淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等，是研究免疫学、血液学和生物学的重要细胞。
对PBMC的分离和纯化对于后续的实验研究有着至关重要的作用。
其中，Ficoll分离法是常用的PBMC分离方法之一，其通过悬浮PBMC在密度梯度上，利用真核细胞和其它细胞在稀释Ficoll溶液中的胶体压差选择性沉降，从而获得纯净的PBMC。
下面，本文将详细介绍Ficoll分离法分离PBMC的步骤和特点。
一、操作步骤1、制备样本：以抗凝剂抗凝的外周血为样品。
2、制备Ficoll-Paque溶液：5ml Ficoll-Paque液加5ml PBS进行混合。
3、样本的悬浮液：将5ml抗凝的外周血加入到50ml 耐酸碱离心管内。
缓慢倒入Ficoll-Paque溶液，避免两种溶液混合。
装好离心管盖，以3000r/min离心30min（制备不同量的悬浮液时离心的时间不同），过程中不能震动，最好在无扰动的条件下离心。
4、取上清液：离心结束后，可以清晰地看到上清液、白膜和红血块。
样品中的细胞被Ficoll在稀释液中的胶体压力亲和力离心到离心管的木纹间。
无线假底离心管是离心过程中压力拍打细胞下沉粘连的机会最小的离心材料。
在冰上开盖依次取出，将悬浮液上清液倒在装有PBS的无菌离心管中。
5、PBS的加入：加入PBS，摇匀，离心1800r/min，10min。
取出，弃上清液。
6、PBS的加入和离心：重复上一步2次。
最后一次离心弃掉PBS，留下沉淀细胞。
二、特点1、相对纯净度高：Ficoll-Paque是一种密度梯度介质，利用细胞的沉降速度和浮力进行分离。
使不同密度的细胞分层，从而实现分离。
使用该分离方法分离PBMC，可获得高度纯净的细胞，最大限度减少不同细胞系之间的干扰。
PBMC的分离
PBMC的分离物品准备：外周血来源的白细胞浓缩液、生理盐水、50ml注射器×1、20ml注射器×3、10ml注射器×2、50ml离心管×7、15ml离心管×4、淋巴细胞分离液分离步骤：1、将外周血来源的白细胞浓缩液用生理盐水1：1稀释，从离心管边缘轻轻加于淋巴细胞分离液上面（淋巴细胞分离液与外周血来源的白细胞浓缩液等体积），离心（2000r/min，20min，22℃），分离白膜层细胞即外周血单个核细胞（PBMC）。
2、用培养液洗涤5-6次（离心速度1500r 15min-1500r 15min-1000r10min-800r 10min-800r 5min），用含10%的胎牛血清的RPMI 1640液调整细胞浓度为2×106 /ml，加入6孔板，于37℃，5% CO2孵育箱培养2h，吸去悬浮的细胞，用温热的RPMI 1640培养液洗涤2遍，所得的贴壁细胞即DC前体细胞。
3、所吸去的悬浮细胞为淋巴细胞，用含10％的胎牛血清的RPMI 1640（含终浓度为800U/L的rhIL-2）重悬，计数并调整细胞密度为1×106/ml，置于75cm2培养瓶内，37℃，5% CO2孵育箱培养，隔天换含新鲜IL-2的RPMI 1640培养液维持细胞活力，待用。
注意事项：1、密度梯度离心时，加速度宜慢2、密度梯度离心时间不宜过长，对细胞损伤较大3、如分离后的细胞悬液中有较多红细胞，可使用红细胞裂解液，37℃裂解5min，注意裂解时间不宜过长，以免一项单核细胞活性4、稀释血和分离液的比例可以是1：1或2：1，最好达离心管的1/2-2/3，1/2最好，分层明显，即50ml的离心管只装到30ml5、吸取白膜层时，注意不要吸到分离液，可以先吸去血浆层6、注意淋巴细胞分离液和细胞培养液使用前都应水浴至室温7、离心后离心管中液体分为5层：血浆层、PBMC层、分离液层、粒细胞层、红细胞层。
密度梯度离心法分离PBMC操作流程
密度梯度离心法分离P B M C操作流程 The final edition was revised on December 14th, 2020.密度梯度离心法分离PBMC1.在15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液Ficoll。
2.取5mL抗凝静脉血与5mL无菌PBS按照1：1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。
外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为1：1：1。
3. 水平离心400g×30分钟。
（注意：为保证分离效果，需将离心机升降速率调至最低，即升速为1，降速为0，这样调整后，升降速会比较慢，总体离心时间约为1小时。
）4.离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。
在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
此外，还含有血小板。
血浆和PBS单个核细胞淋巴细胞分离液红细胞和粒细胞5.去除部分上层液体（用移液管吸取，不可倾倒），余下约1mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。
置入另一15mL离心管中，加入5倍以上体积的PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。
6.末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，可根据情况适量增减时间。
7. 加入10mL PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。
8. 末次离心后，弃上清，加入含有10%FBS的RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。
用本法分离PBMC，每1mL全血可分离得到1~2×106 PBMC，不同人个体之间存在一定差异。
活细胞百分率在95％以上。
注意：1.所有操作都应在无菌条件下进行。
2.在分离前Ficoll和PBS等试剂均需在37℃恒温水浴中预热半小时以上。
3.吸取单个核细胞时不可避免会吸到Ficoll，而Ficoll密度比细胞要大，因此步骤5中需加入足量PBS稀释，若PBS体积太小可能会导致细胞无法离心收集。
pbmc分离步骤
pbmc分离步骤
PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血单个核细胞的缩写，通常包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。
以下是从外周血中分离PBMC的一般步骤，主要采用密度梯度离心法：
1.材料准备：
•外周血样本
•无菌PBS（磷酸盐缓冲液）
•密度梯度分离液（如Ficoll-Paque）
2.密度梯度分离：
•将外周血与相同体积的PBS混合均匀。
•将混合物缓慢地倒在密度梯度分离液上，确保形成一个清晰的界面。
•用无菌技术，将样本与PBS和分离液的混合物轻轻地分层到离心管中。
3.离心：
•使用无菌技术将离心管放入离心机，进行离心。
•设置适当的离心参数，通常是低速度离心，以避免细胞破裂。
•离心结束后，PBMC会沉积在分离液的界面上。
4.PBMC收集：
•使用无菌技术，将PBMC小心地从离心管的界面上吸取出来，放入新的离心管中。
5.洗涤：
•使用PBS或细胞培养基等缓冲液洗涤PBMC，以去除密度梯度分离液的残留。
6.计数和保存：
•使用血细胞计数板或血细胞计数仪等设备，计数PBMC的细胞数。
•根据需要，将PBMC冻存或直接用于后续实验。
注意事项：
•所有步骤应在无菌条件下进行，以避免细菌和其他污染物的引入。
•使用离心管和仪器前后要进行严格的消毒。
•密度梯度分离液的选择要根据实验需要，通常使用Ficoll-Paque 等离子浓度梯度离心介质。
这些步骤是标准的PBMC分离方法，但可能需要根据具体实验的需求进行微调。
PBMC的分离培养及处理步骤
刘凤君实验步骤1.采血：抽取初治(初始抗病毒治疗）之前CHB、CHC患者外周静脉血6ml，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。
2.稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀。
3.加样：取50ml离心管，吸取6ml Ficoll（淋巴细胞分离液）于离心管中，（Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1），管倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面。
4.离心：18-20℃,2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。
5.回收：将移液管直接插入云雾层（或者先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。
6.洗涤：加入至少于PBMC（外周血单个核细胞）体积3倍的PBS，18-20℃,2000rpm，10min，两次。
7.细胞计数：弃上清，加1ml RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清），吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。
①专用仪器测定：吸取一定量的PBMC细胞悬液于EP管中，取等量2%台盼蓝，吹打混匀后吸取1滴进行细胞浓度测定。
②血细胞计数板：取一滴PBMC悬液与一滴2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。
细胞数/ml=4个大方格细胞总数/4×104×2（稀释倍数）8.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105/ml培养基，加于6孔板或24孔板中进行培养。
（我们通常是培养过夜后再进行下一步处理）。
9.干扰素处理：加入500IU/ml（培养基的终浓度）的α-IFN（干扰素），同时设对照组，时间为8小时。
（家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去干扰素处理的步骤。
10.细胞收集：将6孔板或24孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将Trizol转入EP管中。
11.细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。
单个细胞分离技术PBMC
多组学分析
结合基因组、转录组、蛋白质 组等多组学分析，深入揭示 PBMC在生理和病理状态下的 分子机制。
临床转化研究
加强PBMC分离技术的临床转 化应用，推动其在疾病诊断、 治疗和预后评估等方面的实际 应用。
伦理和社会问题
关注PBMC分离技术的伦理和 社会问题，确保研究遵循相关 法规和伦理准则，保护受试者 的权益和隐私。
单个细胞分离技术（C
目
CONTENCT
录
• 引言 • PBMC的分离方法 • PBMC的应用领域 • PBMC分离技术的挑战与展望 • 结论
01
引言
目的和背景
研究细胞类型和功能
PBMC分离技术用于研究人体内不同免疫细胞的类型、功能和相 互作用，有助于深入了解免疫系统的运作机制。
疾病诊断和治疗
PBMC分离技术为免疫学、生物学和医学研 究提供了重要的基础，使得科学家能够深入 研究单个细胞的特性和功能。
药物研发
PBMC分离技术为药物研发提供了实验模型 ，有助于筛选和验证药物的疗效和安全性。
对未来研究的建议和展望
01
02
03
04
技术创新与优化
进一步探索和开发更高效、准 确的PBMC分离技术，提高细 胞纯度和回收率。
个体化用药
根据患者PBMC的反应差异，可 以为患者选择合适的药物和剂量， 实现个体化用药。
04
PBMC分离技术的挑战与展望
细胞活性与纯度问题
细胞活性
在分离过程中，PBMC的活性可能会受到影响，导致其功能和代谢活动的改变。 为保持细胞活性，需要优化分离条件，如选择适当的抗凝剂、离心速度和时间等 。
流式细胞分离法
总结词
一种高效、快速的分离技术
PBMC的分离计数和培养
PBMC的分离计数和培养
分别将4ml的猪外周血淋巴细胞分离液吸至无菌的10ml离心管内，标号。
取4ml抗凝血用Hank’s液等体积稀释，取5ml 小心缓慢地沿10ml离心管管壁滴加到已加好4ml淋巴细胞分离液上，使之形成明显的界面。
18—20℃，水平离心机2000r/min 离心20min。
离心后其中的内容物分为4层，上层为血浆层，中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在最上层和淋巴细胞分离液之间有一层乳白色云雾状带，为本试验所需的淋巴细胞层。
缓慢旋转吸取淋巴细胞层至一新的10ml无菌离心管内，加5ml 红细胞裂解液充分混匀静止5min后，18—20℃，1500r/min离心10min，弃上清。
加入5ml的PBS洗涤细胞，混匀，1500r/min 离心10min，吸弃上清。
重复洗涤细胞2次，最后1次离心后用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液1ml重悬细胞，取20μl细胞悬液加20μl，0.4%台盼兰染液并在倒置显微镜下用血球计数板进行细胞计数，死细胞被染成蓝色，要求淋巴细胞活性≥95%。
调整细胞浓度至5*105/ml。
将细胞悬液按每孔1ml加到24孔细胞培养板中。
将细胞培养板放置于37℃、5% CO2的培养箱中培养24h，收集细胞培养上清液。
pbmc分离结果
pbmc分离结果PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）分离结果是指将外周血中的白细胞分离出来的实验结果。
PBMC是指在外周血中存在的各种核细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等。
PBMC分离结果在生物医学研究中具有重要意义，可以用于免疫学研究、细胞治疗和药物开发等方面。
PBMC主要通过离心技术进行分离。
首先，采集新鲜外周血样本，并将其加入抗凝剂保存。
然后，将外周血样本轻轻倒入离心管中，并使用相应的稀释液进行稀释。
接下来，将离心管放入离心机中进行离心。
离心过程中，由于外周血成分的不同密度，PBMC会在特定离心力下沉降到离心管的底部，形成一层细胞沉积物。
最后，将上清液轻轻吸出，留下PBMC沉积物。
PBMC分离结果可以通过显微镜观察，也可以通过流式细胞术进一步鉴定和分析。
显微镜观察可以直接观察到PBMC的形态特征，如淋巴细胞的小圆形核和少量胞质。
而流式细胞术则可以利用特定的细胞表面标记物，对PBMC进行表型和功能分析。
PBMC分离结果在免疫学研究中具有广泛的应用。
通过分离PBMC，可以对免疫细胞的种类、数量和功能进行研究，了解免疫机制和疾病发生发展的规律。
例如，可以通过分离PBMC来检测某种疾病的免疫指标，如细胞因子水平、T细胞亚群的比例等。
此外，PBMC还可以用于体外培养细胞，进行免疫治疗研究。
通过激活PBMC并与其他靶细胞相互作用，可以评估抗肿瘤药物和免疫治疗的效果。
PBMC分离结果也在细胞治疗领域具有重要作用。
细胞治疗是利用人体的细胞、组织或细胞因子来治疗疾病的一种新型治疗方法。
PBMC 中的多能干细胞（如间充质干细胞）具有自我更新和多向分化能力，可以用于再生医学研究和治疗。
通过分离PBMC，可以提取出这些多能干细胞，并进行体外扩增和定向分化，最终用于临床治疗。
此外，PBMC分离结果在药物开发中也扮演着重要角色。
药物开发过程中，需要评估药物的毒性和免疫原性。
PBMC的分离培养及处理步骤
刘凤君实验步骤1. 采血：抽取初治（初始抗病毒治疗）之前CHB CHC患者外周静脉血6ml ，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。
2. 稀释：室温下加入等体积的 PBS,轻轻吹打混匀。
3. 加样：取50ml离心管，吸取6ml Ficoll （淋巴细胞分离液）于离心管中，（ Ficoll 与稀释前血液的体积比为 1:1 ），管倾斜 45°，将稀释后的血液在Ficoll 液面上方约1cm 处沿管壁缓慢加至Ficoll 上面。
4•离心：18-20 C ,2000rpm , 30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。
5. 回收：将移液管直接插入云雾层（或者先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。
6. 洗涤：加入至少于PBMC （外周血单个核细胞）体积3倍的PBS, 18-20C ,2000rpm , 10min，两次。
7. 细胞计数：弃上清，加 1ml RPMI-1640 培养基（含 10%胎牛血清），吹打混匀，制备成 PBMC细胞悬液。
①专用仪器测定：吸取一定量的PBMC细胞悬液于EP管中，取等量2% 台盼蓝，吹打混匀后吸取 1 滴进行细胞浓度测定。
②血细胞计数板：取一滴 PBMC悬液与一滴2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数 4大格内细胞总数。
细胞数 /ml=4个大方格细胞总数/4 X 104 X 2 （稀释倍数）8. 细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为 2X 105/ml培养基，加于6 孔板或24 孔板中进行培养。
（我们通常是培养过夜后再进行下一步处理）。
9. 干扰素处理：加入500IU/ml （培养基的终浓度）的a -IFN （干扰素），同时设对照组，时间为 8 小时。
（家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去干扰素处理的步骤。
10. 细胞收集：将 6 孔板或 24 孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将 Trizol转入EP管中。
大鼠pbmc分离的量
大鼠pbmc分离的量1.引言概述大鼠外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC）的分离是生物医学研究中常用的技术之一。
PBMC主要由淋巴细胞、单核细胞和少量的自然杀伤细胞组成。
分离PBMC可以提供大量的细胞来进行免疫学研究、细胞培养和药物筛选等实验。
分离大鼠PBMC的关键步骤是通过密度梯度离心的方法来分离淋巴细胞和单核细胞。
在此过程中，外周血液样品中的全血会先经过稀释处理，然后被缓慢地滴加到密度梯度离心管中。
接着，离心管将被放置于离心机中进行高速离心，离心的时间和离心速度会使血液中的不同细胞沉降到不同的位置。
最终，我们可以通过管中的沉淀层将PBMC分离出来。
PBMC分离技术的成功与否对后续实验的质量和准确性具有重要影响。
因此，在进行大鼠PBMC分离之前，需要严格控制实验条件和操作技巧，确保样品的完整性和纯度。
此外，为了增加分离PBMC的收率，也可以调整密度梯度离心液和离心的速度等参数。
总之，大鼠PBMC的分离是一项关键的技术，对于研究和应用免疫细胞生物学具有重要的意义。
通过合理使用该技术，我们可以获得高质量的PBMC，用于进一步的免疫学或临床研究。
（以上为文章1.1 概述部分的内容，仅供参考）1.2 文章结构文章结构部分的内容可以从以下几个方面进行编写：本文将按照以下结构进行阐述：1. 引言：首先，简要概述大鼠PBMC分离的重要性和应用背景，介绍PBMC的定义和重要性，以及本文的目的和意义。
2. 正文：2.1 第一要点：在本部分，详细介绍大鼠PBMC分离的方法和步骤。
包括样本的收集、处理和分离PBMC 的技术原理和步骤。
同时，可对常用的离心分离法、密度梯度离心法和磁珠分离法进行介绍和比较，分析各种方法的优缺点和适用范围。
可以附上操作流程图以方便读者理解。
2.2 第二要点：该部分可进一步探讨大鼠PBMC分离后的应用领域和相关研究进展。
比如，可以介绍在免疫学研究中，大鼠PBMC的应用，如体外诱导成熟巨噬细胞、淋巴细胞增殖实验以及细胞因子的检测等。
4.PBMC分离
外周血单个核细胞(PBMC)
包括淋巴细胞和单核细胞。
是免疫学实验最常用的细胞，也是T、B细胞分
离纯化的第一步。
常用分离方法：聚蔗糖-泛影葡胺(FicollUrografin)密度梯度离心法
1
2
2
1
1
2000rpm 20min
1
1000rpm 3 3 3 10min
3
方 法
稀释的抗凝静脉血1ml 取一只玻璃试管，加入1ml淋巴细胞分离液；转移血标 本于淋巴细胞分离液上层（注意：保持液面完整) 离心，2000rpm，20min 吸取单个核细胞（中间白膜层），转移至一新试管中
加入5倍量D-Hank’s ，混匀，离心，1000rpm，10min
弃上清，留少许重悬沉淀 滴一滴细胞悬液于载玻片上，盖盖玻片，镜下观察
结 果
(一)
血浆 PBMC 分离液 PMN RBC
(二) 镜下观察结果
实验报告
外周血单个核细胞(PBMC)的分离
方法、原理、步骤、结果
原 理
聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液 比重为1.077±0.001
红细胞、粒细胞比重1.09；
淋巴细胞和单核细胞的比重1.075
稀释抗凝血
血浆 单个核细胞
淋巴细胞分离液
凝兔子外周血 淋巴细胞分离液 D-Hank’s液 试管、吸管等
pbmc分离关键
pbmc分离关键PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells，外周血单个核细胞）是一种重要的免疫细胞类型，对于研究免疫学、细胞治疗和药物筛选等领域具有重要意义。
正确高效地分离PBMC是进行这些研究的基础步骤之一。
本文将介绍PBMC的分离关键技术和步骤，以期为相关研究提供参考。
一、材料准备在进行PBMC分离前，需要准备以下材料：1. 外周血样品：获取血样需要经过伦理审批，并且操作人员需要具备相应的培训和防护措施。
2. 无菌离心管：用于收集血样和分离PBMC。
3. 无菌PBS缓冲液：用于稀释血样和洗涤PBMC。
4. Ficoll-Paque密度梯度离心液：用于分离PBMC和其他血细胞。
5. 离心机：用于离心操作，选择适当的离心机型号和转速。
二、PBMC分离步骤步骤一：稀释和混匀将外周血样品放入无菌离心管中，并用无菌PBS缓冲液稀释样本。
稀释比例通常为1:1或1:2，可根据实验需求进行调整。
然后，轻轻反复混匀，确保血液和缓冲液充分混合。
步骤二：制备密度梯度离心液将适量的Ficoll-Paque密度梯度离心液放入另一个无菌离心管中。
具体用量需要根据血液样本的体积进行计算，通常为血液样本体积的一半或三分之二。
制备好后，将离心管轻轻摇晃来均匀混合。
步骤三：层析离心将混匀后的外周血样品缓慢倾倒至含有Ficoll-Paque离心液的无菌离心管中，确保两者不混合。
注意避免气泡的产生。
倾倒完成后，离心管中会出现明显的三个层次：上层为血浆，中间层为白细胞和单核细胞，下层为红细胞。
步骤四：离心将离心管放入离心机中，调整适当的离心参数。
常规情况下，离心速度为400×g，离心时间为20分钟。
离心过程结束后，离心管中的PBMC将沉淀在管底。
步骤五：收集PBMC将上层血浆和下层红细胞倒出，只留下中间层的PBMC。
尽量避免将红细胞和离心液残留物带到PBMC中。
三、注意事项1. 操作要严格遵循无菌操作规范，保证样品的纯度和可靠性。
外周血PBMC的分离
3.18℃，1500r/min，离心30min
4. 轻轻吸取PBMC层移入另一试管中
5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min 离心5min ，弃上清。
注意事项
1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释 2.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 3.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加， 以免冲散界面 4. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上 清液或分层液而导致血小板污染
一、外周血PBMC的分离
原理
外周血各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
原理
红细胞
1.093 1.092
淋巴细胞 单核细胞
外周血
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
1.075~1.090 1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀 释 外 周 血
稀释的血浆、 血小板
1500rpm, 20℃ , 30min
PHale Waihona Puke MCFicollFicoll
红细胞 粒细胞
实验步骤
1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的 管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2）
PBMC的分离
人的PBMC的制备
1. 取抗凝血，以1000 rpm离心8min后，吸掉上层血浆，用生理盐水稀释1倍。
2. 吸取淋巴细胞分离液3~4ml放入10mL玻璃离心管中。
3. 用毛细吸管吸取稀释全血，在离分离液面上1cm处，沿离心管壁徐徐加入，使稀释全血于分离液上分层，注意不要用力过大，以免破坏分层液面。
稀释全血与分离液体积比例约为2：1。
4. 用低速离心机以2200 rpm离心20min。
离心管内容物即分为三层，上层为血浆(内含血小板)，中间层为分离液，底层为红细胞和多核白细胞。
在上、中层液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层。
5. 用毛细吸管轻轻插入到单个核细胞层，沿离心管壁周缘小心吸取单个核细胞，转移至另一新的离心管中。
6. 加入10倍以上体积的PBS，吹打混匀，1650 rpm离心8min，弃上清。
7. 再加入10ml PBS，1350 rpm离心8min，弃上清。
8. 用适量含10%胎牛血清的培养基重悬细胞，并计数。
不用抗凝剂对pbmc的分离及生物活力的影享实验结果
不用抗凝剂对pbmc的分离及生物活力的影享实验主要试剂配制（1）PBS：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，高压灭菌，4℃保存备用。
（2）RPIM-1640培养基：临用前根据需要加15%胎牛血清，最后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL，置于4℃冰箱保存。
（3）台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100mL，1500rpm离心15min，吸取上层液，即为4%水溶液。
用前，用1.8%氯化钠溶液稀释1倍，即为2%台盼蓝染液。
实验步骤一、PBMC原代分离步骤1)抽取人的外周血于肝素抗凝管中，取足5mL新鲜血液，加入PBS按1：1稀释血液（一般采血管2mL+2mL）。
2)取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用。
3)吸取稀释血液，在离分层液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，并与分离液形成明显界面。
4) 室温，离心2000rpm，20min。
此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层呈白膜状。
5) 小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞。
加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心1500rpm，10min。
6) 去上清液，加入1640培养基1mL混匀，取少量进行细胞计数。
7)用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性：取2滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，5-10min后取样作湿片高倍镜检。
活细胞不着色，死细胞染成蓝色。
计数200个细胞，计算活细胞百分率，活性应在95％以上。
二、DC细胞诱导1)将收集的PBMC在1640培养基，在37 ℃、5 % CO2条件下在培养板培养4h。
2)轻轻吸取上清，收集贴壁细胞，加入含15%血清，100ng/ml rhGM-CSF、100ng/ml rhIL-4的1640培养基，培养5～7d获得未成熟DC，用25ng/ml hTNF-α刺激2～3天，获得成熟DC。
外周血PBMC的分离
外周血PＢＭC旳分离
原理
外周血多种血细胞旳密度不尽相似,运用淋巴细胞分层液（Fｉｃｏｌl)作密度梯度离心,使一定比重旳细胞群按相应密度梯度分布,从而将多种血细胞加以分离。
外周血
红细胞
粒细胞
单个核细胞
血小板
淋巴细胞
单核细胞
1.030~1.035
1.075~1.090 Ficoll：1.077±0.001
(PBMC)
1.092
1.093
实验环节
注意事项
1500rpm, 20℃ , 30min
PBMC
红细胞粒细胞
Ficoll
稀释外周血
Ficoll
稀释旳血浆、血小板 ⏹ 1.采血，稀释
（外周血：稀释液=1：2）
⏹ 2.在离心管中加入Ficoll ，沿倾斜旳管壁缓缓加入稀释旳外周血（Ficoll ：稀释血=1：2） ⏹ 3.18℃，1500r/min ，离心30min ⏹ 4. 轻轻吸取PBMC 层移入另一试管中
⏹
5.加足量稀释液充足洗涤，1800 r/min 离心5min ，弃上清。
⏹每毫升外周血液大概可获1×106单个核细胞
⏹Ficoll应适量，外周血应充足稀释
⏹温度直接影响到Ficoll旳比重和分离效果
⏹在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面
⏹吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多旳上清液或分层液而导
致血小板污染。
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PBMC的分离
物品准备：外周血来源的白细胞浓缩液、生理盐水、50ml注射器×1、20ml注射器×3、10ml注射器×2、50ml离心管×7、15ml离心管×4、淋巴细胞分离液分离步骤：
1、将外周血来源的白细胞浓缩液用生理盐水1：1稀释，从离心管边缘轻轻加于淋巴细胞分离液上面（淋巴细胞分离液与外周血来源的白细胞浓缩液等体积），离心（2000r/min，20min，22℃），分离白膜层细胞即外周血单个核细胞（PBMC）。
2、用培养液洗涤5-6次（离心速度1500r 15min-1500r 15min-1000r
10min-800r 10min-800r 5min），用含10%的胎牛血清的RPMI 1640液调整细胞浓度为2×106 /ml，加入6孔板，于37℃，5% CO2孵育箱培养2h，吸去悬浮的细胞，用温热的RPMI 1640培养液洗涤2遍，所得的贴壁细胞即DC前体细胞。
3、所吸去的悬浮细胞为淋巴细胞，用含10％的胎牛血清的RPMI 1640（含终浓度为800U/L的rhIL-2）重悬，计数并调整细胞密度为1×106/ml，置于75cm2培养瓶内，37℃，5% CO2孵育箱培养，隔天换含新鲜IL-2的RPMI 1640培养液维持细胞活力，待用。
注意事项：
1、密度梯度离心时，加速度宜慢
2、密度梯度离心时间不宜过长，对细胞损伤较大
3、如分离后的细胞悬液中有较多红细胞，可使用红细胞裂解液，37℃裂解5min，注意裂解时间不宜过长，以免一项单核细胞活性
4、稀释血和分离液的比例可以是1：1或2：1，最好达离心管的1/2-2/3，1/2最好，分层明显，即50ml的离心管只装到30ml
5、、
6、吸取白膜层时，注意不要吸到分离液，可以先吸去血浆层
7、注意淋巴细胞分离液和细胞培养液使用前都应水浴至室温
8、离心后离心管中液体分为5层：血浆层、PBMC层、分离液层、粒细胞层、红细胞层。
9、低速离心有助于去除细胞悬液中的血小板，因此洗涤时离心速度较低。