《酶工程实验》教案
酶工程实验
实验一淀粉酶的提取及活力测定一、实验目的淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性较强。
水稻萌发时淀粉酶活性最强。
水稻萌发时淀粉活性的大小与种子萌发力有关。
本实验通过对水稻萌发期淀粉酶活性测定，学习和掌握淀粉酶的测定方法，了解水稻生长与之代谢的关系。
二、原理淀粉酶能将淀粉水解成麦芽糖，由于麦芽糖能将3，5-二硝基水杨酸试剂还原成3-氨基-5-硝基水杨酸的橙红色化合物，且在一定范围内还原糖的浓度与反应液的颜色成正比，故利用比色法可求出麦芽糖的含量。
以5分钟内每克样品水解产生麦芽糖的毫克数表示酶活性的大小。
植物淀粉酶可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种，其中β-淀粉酶不耐热，在温度70℃以上易钝化：而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。
根据以上特性，可分别测定这两种淀粉酶的活性。
如测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性，即为淀粉酶总活性。
三、实验材料、仪器及试剂1．仪器：20ml具塞试管移液管 100ml容量瓶石英砂研钵721型分光光度计离心机恒温水箱离心管2．试剂：（1）1%淀粉溶液：称1.0克可溶性淀粉，加入100ml蒸馏水煮沸。
（临用时配制）（2）pH5.6柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸21.0克，溶解后定容至1000ml；B、称取柠檬酸钠29.4克，溶解后定容至1000ml；量取A液55ml与B液145ml混匀，即为pH5.6的缓冲液。
（3）0.4mol/L氢氧化钠溶液。
（4）3,5-二硝基水杨酸试剂：取1.0克3,5-二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖，勿使二氧化碳进入。
（5）麦芽糖标准溶液：称取0.1000克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，然后定容至100ml，取为1mg/ml麦芽糖标准液。
实验材料：萌发水稻种子。
四、实验方法1．酶液的制备：称取去根萌发水稻种子2克（含外壳），置研钵中，加1克石英沙研磨成匀浆。
《酶工程实验》教案
(一）、培养基的配置
1、1 LLB（Luria—Bertani）液体培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl10 g。每L LB固体培养基还需加琼脂粉12 g。
2、1 L产纤维素酶菌株筛选培养基：羧甲基纤维素10 g，蛋白胨10 g,酵母粉10 g，KH2PO41 g, NaCl5 g，葡萄糖2 g，琼脂12 g，灭菌备用。
瘤胃微生物的遗传改造也已引起了人们的广泛注意，利用DNA重组技术提高反刍动物瘤胃中纤维素转化率，可以大幅度降低饲料用量，带来巨大的经济效益。近几年来，瘤胃微生物遗传改造的研究已取得较大进展。瘤胃细菌,如Butyricibrio fibrisolcens的载、受体系统已基本建立；来自Bacteroides Succinogenes和Butyrivibrio sp的某些纤维素酶基因已相继被克隆，目前存在的主要问题是瘤胃中微生物种类繁多，各类微生物生长速度随环境不同而变化，在瘤胃中滞留时间短，难以建立起稳定的工程菌。
自然界中存在着诸多天然的产纤维素酶的菌株,所以对产纤维素酶菌株的选育也是研究纤维素酶的一个热点。产纤维素酶的菌株主要可以分为以下几类:
1） 真菌类：
丝状真菌是目前研究最多的纤维素降解类群，该类微生物能产生大量的纤维素酶，研究较多的有木霉属、曲霉属、青霉属、根霉属和漆斑霉属。其中尤以木霉属的产量居上，里氏木霉（Trichoderma ressiei）、康氏木霉(Trichoderma koniggii）、拟康氏木霉（Trichodermapseudokoniggii）、绿色木霉（Trichoderma viride)、黑曲霉(Aspergillus niger)等是其中活性较高的代表菌种。
(八） 微生物酶的提取方法
(1)酶的粗提;
酶工程实验doc
酶工程实验指导实验一从植物材料中提取制备过氧化物酶一．实验目的学习从植物材料中制备过氧化物酶的方法，了解纯化酶的一些基本步骤。
比较不同植物材料过氧化物酶的含量与活性，掌握酶纯化的相关计算方法。
二．实验原理过氧化物酶（EC 1. 11. 1. 7）是一类以铁卟啉为辅基的氧化酶，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，在工业上也广泛被应用。
过氧化物酶可溶于水，溶解度约为5%（W/V），溶液呈棕红色，透明。
此酶可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而在0.62饱和度以上则不溶。
该酶能催化愈创木酚反应产生有色物质：以此可进行酶活性的测定。
许多植物如辣根、柑桔叶子、白萝卜等含有较多的过氧化物酶，在这些植物材料的溶出物中，加入不同浓度的硫酸铵进行分段盐析，对过氧化物酶进行粗提，然后用有机溶剂沉淀、结晶等方法可对该酶进行纯化，得出较纯的制品。
三．主要仪器与试剂仪器：组织捣碎机，冰箱，真空冷冻干燥机，离心机，紫外-可见分光光度计等。
试剂：愈创木酚，丙酮，过氧化氢，硫酸铵等。
四．实验步骤（尽量在冰浴中进行）鲜植物样品约70克，剪碎或捣烂，加少许水研磨成浆（可用捣碎机），转移到500ml的烧杯中，加水至约200ml，于冰箱中浸提约2小时（中间多次搅动）。
多层纱布挤压过滤后离心（4000rpm），10ml上清液用来测酶活力，其余上清液按226克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置1小时以上，离心(4000rpm)去沉淀。
上清液再按258克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置4小时以上。
离心收集沉淀，用水溶解至约10ml，用水透析去盐，离心去沉淀，取部分酶液稀释后测酶活。
其余酶液用作精制样品。
在搅动下沿着杯壁加入一倍体积预冷(-15℃)的丙酮于酶液中，混匀，静置10分钟，低温离心(8000rpm, 4℃) 去沉淀。
按上清液与丙酮之比为1比0.8再次加入预冷丙酮，静置10分钟后离心(8000rpm, 4℃) 收集沉淀，溶于少量水中，透析去丙酮。
酶工程实习设计方案
吉林农业大学酶工程实习设计方案题目名称：纤维素酶和果胶酶的固定化及性质研究学生姓名：院系：生命科学学院专业班级：指导教师：职称：讲师2014年6月12日1前言 (1)1.1纤维素 (1)1.2纤维素酶 (1)1.3酶的固定化技术 (1)1.4固定化的方法 (2)1.4.1吸附法 (2)1.4.2 包埋法 (2)1.4.3 共价结合法 (3)1.4.4 交联法 (3)1.5 实验目的及意义 (3)2 仪器与试剂 (4)2.1 试剂配制 (4)2.1.1 缓冲溶液的配制 (4)2.1.2 DNS显色剂 (4)2.1.3 标准葡萄糖溶液的配制（1mg/ml） (4)2.1.4 海藻酸钠溶液的配制 (4)2.1.5 1.5%壳聚糖 (4)2.1.6酶液制备 (4)2.2 仪器 (4)3 方法与步骤 (5)3.1葡萄糖标准曲线的绘制 (5)3.2游离纤维素酶活力测定 (5)3.3 固定化影响因素 (5)3.3.1固定化时间对酶固定化的影响 (5)3.3.2 pH对酶固定化的影响 (6)3.3.3固定化时间对酶固定化影响 (6)3.4 不同条件对酶反应的影响 (7)3.4.1 温度对游离酶反应的影响 (7)3.4.2 pH对游离酶反应的影响 (7)3.4.3 底物浓度对游离酶反应的影响 (8)3.4.4 温度对固定化酶反应的影响 (8)3.4.5 pH对固定化酶活力的影响 (9)3.4.7 底物浓度对固定化酶活力的影响 (10)3.5 交联固定纤维素酶 (10)3.5.1戊二醛浓度对酶固定化的影响 (10)3.5.2交联时间对固定化的影响 (11)3.6壳聚糖吸附交联法固定化酶 (11)参考文献 (12)1前言1.1纤维素纤维素(C6H10O5)n。
一种天然有机高分子化合物。
由许多个D(+)-葡萄糖通过β-1, 4糖甙键结合成的多糖,是构成植物细胞壁的主要成分。
纤维素和淀粉一样无还原性,不溶于水和一般有机溶剂,但溶于氢氧化铜的氨溶液、浓的氯化锌溶液、硫氰酸钙和某些盐类的饱和溶液。
酶工程实验指导
酶工程实验指导西南农业大学农学与生物科技学院2009年3月实验一产蛋白酶菌株的分离一、实验目的学习胞外生产微生物菌种的分离选择，熟悉分离菌种的基本操作。
二、实验原理工业上常用的生产酶的微生物有许多，重要的有枯草杆菌和真菌中的曲霉等等，它们都能产生耐热的芽孢或分生孢子，分离这类菌种时可采取先进行一定的热处理杀灭其它营养细胞，提高该菌株的相对数目。
根据胞外酶能分泌到培养基的特点，采用一定的方法在培养基上形成单菌落分泌的酶形成的“水解透明圈”，可对产酶的微生物的产酶能力（活力）进行初步估计、分离高产酶的微生物。
三、试剂、仪器高压灭菌锅，天平，无菌超净工作台，培养皿（8套/组）、试管（2支/组）、三角瓶、烧杯、酵母膏，蛋白胨，NaCl、琼脂粉，奶粉三、操作步骤1、带菌土壤的热处理称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。
2、分离选择培养基的配制，各组按下列比例配制120ml培养基：奶粉2g ，自来水50ml，装入50ml三角瓶琼脂1.8g ，NaCl 0.5g，自来水70ml，装入100ml三角瓶自来水50ml，装入50ml三角瓶取50ml烧杯一个，放入5支带帽5ml离心管，灭菌备用。
分别封口，常规灭菌（121℃、20min）,灭菌后待冷却至不太烫手时混合上述液体，按无菌操作要领迅速倒平板8个，其中4个加有0.2ml不同稀释倍数（操作5）的样品液（菌悬液），迅速混合冷却形成平板，余4个平板冷却后用于涂布筛选。
3、稀释制备菌液，取5支灭菌带帽5ml离心管，各加入无菌水3.6ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水10ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入0.4ml微生物悬液，混合均匀后再取0.4ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取0.4ml到第三支试管中，以此类推。
4、斜面培养基配制：配制100ml LB培养基，加入1.5g琼脂粉、蛋白胨1.0g、酵母膏1.0g、NaCl、1.0g加水到100ml，调节pH=7,加热融化后，各组倒斜面培养基2 支，灭菌备用。
酶工程教案1
长沙医学院教案课程名称酶工程授课题目（章节或主题）第一章绪论授课教师罗琼所属系（部）基础医学系所属教研室生物技术职称助教授课时间年月日第周星期第节第次课授课时数3学时授课班级生物技术专业（本科√专科□）级教学课型理论课√实验课□见习课□习题课□讨论课□其它□教材名称、作者、出版社及出版时间酶工程、郭勇主编、科学出版社、2009.8教学目的要求：1.酶工程的内容、任务、特点。
2. 酶工程的发展概况。
3.本课程的要求。
重点与难点：重点：酶工程的内容难点：酶工程的发展概况教学方法（请打√选择）：讲授法√讨论法□启发式□自学辅导法√练习法(习题或操作) 读书指导法√ＰＢＬ（以问题为中心的教学法）□其他□教学手段（请打√选择）：板书√实物□标本□挂图□模型□投影√幻灯□录像√CAI（计算机辅助教学）□教学过程设计和教学内容：第一节酶的定义此列为提示栏（包括重点、难点、教学方法、时间分配一：酶的定义（一）定义：酶是具有生物催化功能的生物大分子，按照分子中起催化作用的主要组分的不同，自然界中天然存在的酶可以分为蛋白类酶和核酸类酶两大类别。
二：酶工程的相关概念（一）酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
（二）酶的生产（三）酶的改性（四）酶的应用第二节酶的发展历史一：酶的发展历史（一）人们对酶的认识起源于生产与生活实践。
1.夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。
2.公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。
3.春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。
（二）西方国家19世纪对酿酒发酵过程进行了大量研究。
教学手段、更新教学内容、教书育人等）通过复习生化的酶学内容引进新课程（三）1896年,日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作消化剂,开创了有目的的进行酶生产和应用的先例。
（四）现已鉴定出4000多种酶，数百种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。
第三节酶的分类与命名一：酶的分类与命名（一）蛋白类酶的分类与命名1.1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶。
酶工程实验指导课件.doc
广东省高教厅重点实验室——现代生物技术实验室教材酶工程实验技术华南农业大学广东省教育厅现代生物技术重点实验室酶工程分室2007年11月编者的话华南农业大学现代生物技术实验室酶工程分室是由广东省高教厅和华农大投资建设的教学提高型实验室，面向石牌地区六所高校的高年级本科生及硕士、博士研究生开设《酶工程实验技术》课程。
该课程以实验为主，为保证学生在修读本课程时有较好的理论基础，要求所有学生预修―酶工程与蛋白质工程‖。
本课程实验内容分酶源的获取、酶制剂分离纯化及分析鉴定、酶制剂的体外改造、酶制剂的应用和酶基因的重组表达五大部分，具体如下：内容实验序号实验项目名称I、酶源的获取1，5 产淀粉酶菌株的快速筛选、木瓜蛋白酶制剂的制备2 鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离II 、酶制剂的分离纯化及鉴定分析3 纯化鸡蛋清溶菌酶的纯度分析4 纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析5木瓜蛋白酶制剂的制备6 壳聚糖凝胶颗粒固定化木瓜蛋白酶III 、酶制剂的体外改造*实验8 中过氧化物酶在滤纸上固定化的部分亦属此部分内容。
7 酶反应器设计及酪蛋白水解物的制备IV 、酶制剂的应8 消毒液中过氧化氢浓度的酶试纸法测定用9 邻苯二酚双加氧酶基因在大肠杆菌中的高效重组表达V 酶基因的重组表达VI 实验总结及实验总结等。
演示等为满足课程教学的需要，经反复修改，特编写了本实验教材。
本实验指导的编写由王炜军，郭振飞，方颖、刘娥娥老师参加编写，在此一并表示感谢！本实验指导为试用第五版，试用后我们将根据各校修课的情况作进一步修改，敬请兄弟院校的同行多提宝贵意见。
2实验一、产淀粉酶菌株的快速筛选一、目的学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。
二、原理产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养基中的淀粉，由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉（本实验为RBV- 淀粉，呈鲜艳的紫红色），当其被淀粉酶作用后便形成可溶，且较易扩散的小分水解物，从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈。
生物大实验2(酶工程实验)
实验一酶促反应中初速度时间范围测定一、实验目的1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。
二、实验原理酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。
它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。
酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。
以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate,NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。
在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。
即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。
而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。
可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。
进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。
要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
三、实验试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A在0.6～0.7之间。
405（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。
（4）0.3mol/LNaOH溶液2．器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。
《酶工程实验》word版
实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100～150ml（×6）。
2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3.温度计（0～100℃）。
4.微量滴定管5ml（×1）。
5.容量瓶1000ml（×1）。
四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。
6、25% H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定管号试剂0123450.05mol/L H2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml9.50.51.008.500.51.258.250.51.677.830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。
酶工程实验讲义最终稿
基本原理：
碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫 颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲 线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
BCA蛋白质检测流程：
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度
考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合 符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收 的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干 扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。 R250中的R代表Red，偏红，(C45H44N3O7S2Na ).R250属于 慢染，脱色脱的完全，主要用于电泳染色 G250中的G就是Green，偏绿(C47H48N3O7S2Na ).G250属于 快染，脱色脱的不彻底，主要用于蛋白测定，比考马斯亮 蓝R250多二个甲基.λ max=590―610nm.
实验试剂
酸性磷酸酯酶酶液 5 mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)：精确称取磷
酸苯二钠(C6H6Na2PO4·2H2O，相对分子质量 254.10)2.54 g，加蒸馏水溶解后定容至100mL，即配 成了100 mmol／L磷酸苯二钠水溶液，密闭保存备用。 用0.2mol／L的pH5.6的乙酸盐缓冲液稀释20倍，即得 5mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)。
0
Folin-酚稀溶液
各0.5mL 0号试管加入酶液0.5mL
35℃保温显色10min以上 0
A680
具体时间控制表
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
酶液加入 时刻 （min ） 11号试管 最先加样
10
9
8
7
6
5
4
3
酶工程实验方案
酶工程实验方案一、实验目的通过本实验，学生将学会利用酶工程实验技术，熟悉酶的生产、纯化和应用过程，培养学生实验操作技能和科学研究能力，为学生今后的科研工作打下良好的基础。
二、实验原理酶工程是利用生物工程学原理和技术手段，对酶进行筛选、改造和工程应用。
酶在生产中扮演着极其重要的角色，它广泛应用于食品、医药、环保、能源、材料等领域。
酶工程实验的关键是酶的生产和纯化技术。
典型的酶工程包括：酶源的筛选、酶基因的克隆与表达、酶的纯化和酶的应用等。
三、实验内容本实验将包括以下内容：1. 酶源的筛选：选择一种具有较高酶活性的微生物菌株，进行培养、鉴定，筛选出所需酶。
2. 酶基因的克隆与表达：通过PCR技术扩增酶基因，将其克隆至适当的表达载体中，然后将其转化至表达宿主中，表达目的蛋白。
3. 酶的纯化：采用离心、柱层析、过滤等方法对表达蛋白进行酶的分离和纯化。
4. 酶的应用：将纯化的酶用于特定的生产或研究中，评价酶的性能。
四、实验步骤1. 酶源的筛选（1）选择合适的微生物菌株，进行培养并获得菌液样品。
（2）采集菌液样品，进行酶活性测试，筛选出具有较高酶活性的菌株。
2. 酶基因的克隆与表达（1）利用PCR技术扩增酶基因。
（2）将扩增出的酶基因克隆至表达载体中。
（3）转化表达载体至适当的表达宿主中，进行表达。
3. 酶的纯化（1）收集表达蛋白，进行细胞破碎，得到目的蛋白混合物。
（2）通过离心、柱层析、过滤等方法对蛋白混合物进行纯化。
4. 酶的应用（1）评价纯化酶的性能。
（2）将纯化的酶用于特定的生产或研究中。
五、实验材料和仪器1. 微生物菌株：待定2. 实验宿主：大肠杆菌等3. 载体：pET等4. 酶活性测试试剂盒5. PCR试剂盒6. 离心机、柱层析仪、过滤器等实验仪器七、实验结果1. 酶源的筛选结果：取得具有较高酶活性的微生物菌株。
2. 酶基因的克隆与表达结果：成功将酶基因克隆至表达载体中，并通过转化实现表达。
3. 酶的纯化结果：得到较纯的酶样品。
[工学]《酶工程》教案
![[工学]《酶工程》教案](https://img.taocdn.com/s3/m/9fe9e605a31614791711cc7931b765ce05087abe.png)
《酶工程》教案安排：本课总学时为48，其中理论课40，实验课8，周学时为3学时。
要求：要求同学们课前预习教材，带着问题听课，这样学习效果好；学生上课作笔记，动动脑；学生课后复习和整理笔记，教师作课后小结和布置作业，达到教学相长的目的。
绪论1教学目标：使学生掌握酶、酶工程的概念，酶的化学性质与催化特性，了解酶的分类与命、酶活力测定、酶的生产方法。
2教学内容：主要讲酶和酶工程的基本概念与发展史、影响酶催化作用的因素、酶的分类与命名、酶的化学性质与催化特性、酶活力测定、酶的生产方法。
3重点和难点：酶、酶工程、酶活力有关的概念；酶的化学性质与催化特性、酶活力测定。
4教学方法：采用讲授式、启发式、图示法、问答式相结合的教学方法。
5板书设计:从上至下，从左至右；大标题始终留在黑板的左边；书写规范。
6学时分配：理论3学时，实验2学时。
7教学进程：第一节酶和酶工程的基本概念与发展史1酶的基本概念酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。
按化学组成分：蛋白类酶（Enzyme proteins）和核酸类酶（Ribozyme RNAs）。
a蛋白类酶（Enzyme proteins）酶是由生物体产生的具有催化活性的蛋白质。
b核酸类酶（Ribozyme RNAs）本身就是一段RNA，不需要额外的蛋白酶就可以对自身进行剪切。
提问：酶一定是蛋白质吗？2酶的发展史1.2.1酶在中国的发展史人们对酶的认识起源于生产与生活实践。
夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。
公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。
春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。
酶者，酒母也。
1.2.2酶在西方的发展史1878年, 给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个字来自希腊文，其意思“在酵母中”。
1896年,日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作消化剂,开创了有目的的进行酶生产和应用的先例。
西方国家19世纪对酿酒发酵过程进行了大量研究。
酶工程实验生物工程课件
外蔗糖酶
内蔗糖酶
细胞膜的外侧，占 蔗糖酶活力的大部 分，是含有50% 糖 成分的糖蛋白。
细胞膜内侧细 胞质，含有少 量的糖。
由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。
酶工程实验生物工程
2
实验一 酵母蔗糖酶的提取与纯化
酶工程实验生物工程
3
本实验以酵母为原料，通过破碎细胞、加热 除杂蛋白、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步骤， 分离纯化酵母蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝胶电泳 对其纯度进行初步检验。
（无色物质）
coloured substance
酶工程实验生物工程
18
DNS法精确检测
黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件 下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。 在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成 正比而葡萄糖生成量又与待测液的酶活力大小成正比。
酶工程实验生物工程
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有机溶剂分级的原理：有机溶剂分级是利用不同蛋白质在不同浓度的有 机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的一种方法。
其原理是： 1、有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子上不同电荷的引 力，使蛋白质溶解度下降； 2、有机溶剂与水作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质的溶解度下 降。
酶工程实验生物工程
本实验共有六个分实验 :
实验一 酵母蔗糖酶的纯化与纯度测定 实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯度 实验三 酵母蔗糖酶的结晶（选做） 实验四 蔗糖酶酶学性质的研究 实验五 酵母蔗糖酶的固定化 实验六 酵母蔗糖酶活性功能基团的化学修饰
酶工程实验生物工程
1
酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)
Sucrase（蔗糖酶）
酶工程教案
酶工程简介酶工程（enzyme engineering）是在1971年第一届国际酶工程会议上才得到命名的一项新技术。
酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。
根据研究和解决问题的手段不同将酶工程分为化学酶工程和生物酶工程。
第一章酶学概论（Enzyme）新陈代谢是生命活动的基础，是生命活动最重要的特征。
而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化和能量变化，都是在酶催化下进行的。
生命的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动都与酶的催化过程紧密相关，可以说，没有酶的参与，生命活动一刻也不能进行。
第一节酶的一般概念一、酶的概念及化学本质（一）酶的概念：酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质及核酸，又称为生物催化剂。
（二）酶的化学本质：绝大多数酶是蛋白质,少数是核酸RNA，后者称为核酶。
本章主要讨论以蛋白质为本质的酶。
二、酶的组成与分类（一）根据酶的组成成分，酶可分为：单成分酶（单纯酶）、多成分酶（复合酶）单纯酶(simple enzyme)是基本组成单位仅为氨基酸的一类酶。
它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。
脲酶、消化道蛋白酶、淀粉酶、酯酶、核糖核酸酶等均属此列。
复合酶(conjugated enzyme)的催化活性，除蛋白质部分(酶蛋白apoenzyme)外，还需要非蛋白质的物质，即所谓酶的辅助因子(cofactors)，两者结合成的复合物称作全酶(holoenzyme)，即：全酶酶蛋白辅助因子(结合蛋白质) (蛋白质部分)(非蛋白质部分)酶的辅助因子可以是金属离子，也可以是小分子有机化合物。
常见酶含有的金属离子有K+、Na+、Mg2+、Cu2+、(或Cu+)、Zn2+和Fe2+(或Fe3+)等。
它们或者是酶活性的组成部分；或者是连接底物和酶分子的桥梁；或者在稳定酶蛋白分子构象方面所必需。
《酶工程》课程实验教学大纲
《酶工程》课程实验教学大纲一、实验课程基本情况二、实验课程简介《酶工程》是制药工程的主要内容之一，是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科。
它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来，并随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。
酶工程实验课是制药工程等本科实验教学的一个重要组成部分，通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解，掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。
在实验过程中要求学生自己动手，分析思考并完成实验报告。
酶工程实验性质有基础性、综合性、设计（创新）性三层次。
三、实验教学目的和基本要求本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验，通过这些实验内容，使学生深入理解酶工程课程的基本知识；巩固和加深所学的基本理论；掌握酶工程中基本的操作技能。
同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素养。
四、实验内容与学时分配课堂教学与实验教学结合。
课堂教学合班上课，实验课分小班进行，每4人一组。
实验设计尽量从实际生产中提出问题，增加学生对实际动手操作的兴趣，安排每个人动手。
通过实际操作巩固掌握教材相关理论知识。
六、考核方法实验成绩占课程总成绩的20%。
主要考察学生每次实验的表现：动手操作能力，观察能力，解决问题的能力等。
其次检查实验报告的书写情况是否认真准确。
七、实验内容安排【实验一】淀粉酶动力学分析（4学时）一、实验目的：了解并掌握米氏常数的意义和测定方法。
二、实验要求：掌握米氏常数的意义和测定方法，掌握酶反应的动力学分析方法。
三、实验步骤：1、酶反应：取13支干燥的18×180 mm试管，按下表编号，实验组做两份平行实验，加入pH5.0的淀粉溶液和α-淀粉酶溶液，50℃反应10分钟2、酶反应速度测定：酶反应液稀释一定倍数（约5倍，取1 mL反应液，加4 mL蒸馏水，混匀），取1 mL稀释液加DNS试剂，于沸水浴中加热2 min进行显色，取出后在盛有冷水的500 mL烧杯中冷却（注意换冷水），各加入蒸馏水9.0 mL，摇匀，以空白管为调零点，在540 nm波长测定吸光度值，从标准曲线查出葡萄糖的含量，算出酶反应速度（mol/（L·min））。
酶工程-教学设计
再通过启发、讲解使学生理解：用不同的固定化酶可以制成不同类型的传感器， 用于化验和检测。例如：科学家利用固定化多酚氧化酶研制成多酚氧化酶传感器。这 种传感器可以快速检测出水中质量分数仅有百万分之二的酚。
4．酶制剂可用于生物工程其他分支领域。
通过回忆基因工程和细胞工程的相关知识使学生了解：基因工程离不开内 切酶和连接酶；植物细胞工程中体细胞杂交离不开纤维素酶和果胶酶；动物细胞 的培养过程中，防止细胞黏连离不开胰蛋白酶。这些酶都是用酶工程的方法来生 产的。
（1）用于食品加工：果胶酶可用于澄清果酒和果汁。用木瓜蛋白酶制成的嫩肉粉， 可以使肉丝肉片等烹调后吃起来嫩滑可口。
（2）用于生产一些Βιβλιοθήκη 品：青霉素酞化酶可用于生产氨卞青霉素。
3．酶制剂可用于化验诊断和水质监测。 有关这部分内容的讨论，教师可以先做如下的演示实验： 在几条尿糖试纸上分别滴上两滴不同浓度的葡萄糖溶液。并让学生对比几条试
提出问题并启发学生思考：从生物体的细胞或组织中提取出来的酶，能不能 直接用于催化化学反应呢？
通过启发讲解使学生了解：提取出来的酶还要经过分离、纯化，再加入适量 的稳定剂和填充剂，制成相应的酶制剂后才能用于催化化学反应。
提出问题引导学生思考：酶制剂的生产成本是较高的，很多酶制剂却只能用 一次，而且，如果将酶制剂直接用于催化化学反应，反应结束后酶制剂会和反应的 产物混合在一起。酶制剂既不能重复使用，也影响了产物纯度。怎样才能解决这个 难题呢？下面我们就来看看科学家们是如何解决的。教师活动：出示酶的固定方式 示意图，指导学生观察，井作适当的的讲解。
（三）各分支领域之间的关系
提出问题：到现在为止，我们先后讨论了基因工程、发酵工程、细胞工程、 酶工程，那么生物工程中的这些分支之间存在着怎样的联系呢？
酶工程电子教案
酶工程电子教案第二章酶工程基础（8学时）教学目标掌握酶工程的基础，即酶学的研究内容，为酶工程的研究奠定基础。
教学重点酶促反应动力学；酶的分类命名。
教学难点酶抑制剂；酶催化作用机制。
教学方法及内容自学结合教师讲授；围绕重难点内容安排了3次实验课。
自学的内容：影响酶活性的因素；酶促反应的数学推导公式。
一、酶化学本质（组成和结构特点）酶分为单纯酶和结合酶（全酶）。
全酶为酶蛋白加上辅因子。
单体酶（monomeric enzyme)一般一天肽链组成，分子量35 KDa以，不含四级结构，催化水解反应。
如牛胰核糖核酸酶（124 氨基酸组成）。
胰凝乳蛋白酶由三条肽链组成（A、B两链及B、C两链间通过二硫键形成共价整体，共241个氨基酸残疾组成）。
寡聚酶(oligomeric enzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基间以非共价键连接，单个亚基没有催化活性。
亚基之间以非共价键结合，易于分开。
如苹果酸脱氢酶；醇脱氢酶；1，6-二磷酸果糖酶；谷氨酸脱氢酶。
含有相同亚基的寡聚酶中，有的是多催化部位酶；相当数量含有相同亚基的寡聚酶是调节酶。
多酶复合物(multienzyme system)：几个酶共价键连接而成的复合物。
这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。
如大肠杆菌色氨酸合成酶复合体；大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体。
二、酶作为催化剂的显著特点催化能力(效率高)；专一性；调节性；不稳定性催化能力(效率高)：（催化转换数：每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。
）一般为103min-1，碳酸酐酶最高为3.6* 107min-1；有酶加入比无酶参加反应速度一般要高107-1013。
3222CO H O H CO ↔+每个碳酸酐酶（红细胞、肺泡细胞、肾小管细胞）分子1s 内可以催化6×105个CO 2水合，比非催化反应高107倍。
3222NH CO )CO(NH +→20℃脲酶（尿素酶）的催化常数为3×104 s -1，比非催化反应大1014倍。
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(二)、纤维素酶研究情况
2.1 纤维素酶简介
2.1.1纤维素
纤维素占植物干重的35%~50%，是地球上分布最广的碳水化合物。它无色、无味，呈白色丝状，不溶于水及一般的有机溶剂。纤维素分子是由葡萄糖苷通过β-1,4糖苷键连接起来的链状高分子，分子量50000~2500000，相当于300~15000个葡萄糖基，不形成螺旋构象，没有分支结构，易形成晶体。
徐州工程学院教案
2014年至2015年第1学期第周星期
课题名称（含教材章节）：《酶工程实验》
实验一产纤维素酶菌株筛选和产酶条件优化分析
教学目的和要求：1、熟悉功能性菌株筛选方法
2、掌握纤维素降解菌株的筛选方法
3、掌握菌株产酶条件优化方法
教学重点：酶工程研究开发的策略
教学难点：产酶条件优化方法
教学内容（要点）
2.1.2纤维素酶
纤维素酶是能将纤维素水解成还原糖的一类酶系的总称。目前普遍认为要完全降解纤维素，至少需要3种功能不同的酶协同作用。它们是 EG(内切葡聚糖酶)、CBH(外切葡聚糖酶)和 CB(β-葡萄糖苷酶)。
2.2 纤维素酶的应用
2.2.1在能源方面的应用
2.2.2在其他方面的应用
纤维素酶已被广泛的应用于食品、酿造、农业、纺织、洗衣等多个领域中。
2.2.3纤维素酶应用中存在的问题
纤维素酶作为能够有效降解纤维素的酶类，无论在动物生产还是环境保护中都确实起到了一定的作用，有非常好的应用前景。但是纤维素酶在大规模工业化生产应用中很大程度上受到其活性和成本的限制。目前，对于纤维素酶的研究也仍然存在菌株产酶效率低、生产成本高、作用于动物的机理尚未完全清楚等问题，这些问题严重制约着纤维素酶的推广应用。
(6)产生的酶便于分离和提取，得率高；
(7)微生物培养营养要求低。
(六) 最佳产酶条件的初步确定
(1)培养方式的确定；
(2)最佳培养条件组合；
(3)微生物产酶的特性(胞内酶、胞外酶)；
(4)微生物酶收集的时间顺序；
(七) 微生物产酶性能的进一步提高
(1)获得高产菌种的突变体；
(2)利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生物的酶产量；
纤维素酶的基因克隆为研究纤维素酶的生物合成和作用机制，以及了解纤维素酶遗传特性进而构建高效纤维素分解菌开辟了新的途径。国内外已开展了大量的相关研究，随着研究领域不断扩大，也取得了一定的新进展。随着生物技术的发展和酶应用技术研究的深入，纤维素酶一定会在各类大规模工业化生产中大放异彩。
2.3 产纤维素酶菌株的研究进展
(2)微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。
(3)为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。
(4)当基因工程介入时，动植物细胞中存在地酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。
因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。
(3)运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环境更适应性的微生物细胞之内，使其高效表达；
(八) 微生物酶的提取方法
(1)酶的粗提；
(2)酶的精制。
(九) 微生物产酶菌种的保藏
(1)斜面；
(2)沙土管；
(3)冷冻。
普通冷冻保藏技术(-20℃)
超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)
食品工业中利用纤维素酶处理植物性原料，可使植物细胞壁软化、崩溃，从而改变细胞壁的通透性，提高细胞内含物如蛋白质、糖等的释放与提取，便于加工。主要采用热烫或者酸碱处理，使得果蔬的香味和维生素大量损失，使产品的食用和营养价值下降。现在利用纤维素酶进行预处理就可以避免这些缺点。
自然界中存在着诸多天然的产纤维素酶的菌株，所以对产纤维素酶菌株的选育也是研究纤维素酶的一个热点。产纤维素酶的菌株主要可以分为以下几类：
1) 真菌类：
丝状真菌是目前研究最多的纤维素降解类群，该类微生物能产生大量的纤维素酶，研究较多的有木霉属、曲霉属、青霉属、根霉属和漆斑霉属。其中尤以木霉属的产量居上，里氏木霉(Trichoderma ressiei)、康氏木霉(Trichoderma koniggii)、拟康氏木霉(Trichodermapseudokoniggii)、绿色木霉(Trichoderma viride)、黑曲霉(Aspergillus niger)等是其中活性较高的代表菌种。
由于畜禽饲料中含有大量的纤维素，除某些反刍动物有分解纤维素的能力外，大部分畜禽没有此能力。纤维素酶能够分解复杂的纤维素，生成易消化物质葡萄糖，便于动物吸收。在饲料中添加了纤维素酶后，其提高家畜家禽生长性能、生产性能等效果显著。
纤维素酶已成为纺织和洗衣行业的第三大酶系。生物打磨和生物抛光是目前纤维素酶在纺织行业中的主要应用。纤维素酶也被用于家用洗涤剂中，因为它们可以增加去污能力，从织物表面去处小的碎纤维，增加织物表面的亮度和光泽。
2、微生物酶开发的一般程序
(一) 样品的采集
采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数量。
(二) 菌种的分离
培养基的确定、培养条件的确定。
(三) 菌种的初筛
(1)用简单的定性反应进行初筛；
(2)在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离。
酱油酿造主要利用蛋白酶、淀粉酶等酶类对原料进行酶解,若再使用纤维素酶, 使大豆等原料的细胞膜膨胀软化破坏, 使包藏在细胞中的蛋白质、碳水化合物释放, 这样就可以缩短酿造的时间、提高产率, 同时还提高品质, 使氨基酸还原糖含量增加。
在啤酒、葡萄酒的酿造过程中也使用到纤维素酶。在低质量大麦发芽的过程中加入纤维素酶可水解β-1,3和β-1,4葡聚糖从而帮助大麦发芽。纤维素酶还可以提高啤酒的过滤效率，并能增加葡萄酒的香味。
(四) 菌种的复筛
初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。复筛。
酶活的测定方法的建立尤其重要。
(五) 对复筛获得菌株的要求
(1)不是致病菌；
(2)菌株不易变易和退化；
(3)不易感染噬菌体；
(4)微生物产酶量高；
(5)酶的性质符合应用的需要，而且最好是胞外酶；
1、产纤维素酶菌株的筛选分析
2、菌株产酶条件优化
徐州工程学院教案纸
一、实验目的1、熟悉功能性菌株筛选方法
2、掌握纤维素降解菌株的筛选方法
3、掌握菌株产酶条件优化方法
二、实验原理
(一)、功能性菌株开发策略
1、应用微生物来开发酶的优点
(1)微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生物来生产酶产品，生产能力（发酵）几乎可以不受限制地扩大，能够满足迅速扩张的市场需求。