第五章 工程酶 固定化酶
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第五章 固定化酶和细胞
制备固定化酶的依据
1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、 1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化 固定化酶必须能保持酶原有的专一性 能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 固定化酶应能回收 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作 固定化酶应用于机械化和自动化操作， 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体 常有一定的机械强度。 常有一定的机械强度。 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性 固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。即 要保护活性中心基团。 要保护活性中心基团。 5.固定化酶应能最大程度与底物接近 固定化酶应能最大程度与底物接近， 5.固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产 具有最小的空间位阻。 量。具有最小的空间位阻。 6.固定化酶应有最大的稳定性 固定化酶应有最大的稳定性。 6.固定化酶应有最大的稳定性。 7.固定化酶应易与产物分离 固定化酶应易与产物分离。 7.固定化酶应易与产物分离。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 1973年 随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年，日 本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨 酸酶，由反丁烯二酸连续生产L 天门冬氨酸。 酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 固定化细胞技术 技术。 1976年 固定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞 生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀 生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀 粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 1982年 日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 固定化原生质体生产谷氨酸 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 更有利于胞内物质的分泌， 更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的 变革提供了新的方向。 变革提供了新的方向。
酶与细胞的固定化课件.ppt
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶的热稳定性
固定化果胶酯酶的pH稳定性
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶作用的最适温度
固定化果胶酯酶作用的最适pH值
5、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。
Cefaclor(R1=H,R3=Cl) Cephalexin(R1=H,R3=Me) Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)
酶促合成头孢类抗生素
CHCOOCH3 + H2N
NH2
O
S
Synthetase
N CH3
COOH
Esterase
CHCOOH +
NH2
CHCONH
NH2 O
S
N CH3
交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、 血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质 1、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间
位阻。
2、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。
酶工程-酶的固定化
（2）酶与载体必须有一定的结合程度，利于反复使用。 （3）用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不易
破坏或受损。 （4）固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高
催化效率和产物的量。 （5）所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反
应。 （6）固定化酶的成本适中，以利于工业使用。
定义：利用电离辐射引发产生自由基的能力，在 室温或低温下诱发有机单体合成生物高分子材料 来包埋酶的方法。
如辐射聚合的水凝胶包埋酶。
（2）纤维包埋法
大规模生产。 把酶溶液在高聚物（醋酸纤维素、聚乙烯）的有机
溶剂（二氯甲烷）中乳化，然后通过多孔喷丝头把 上述乳化液挤压进入凝结液中，即形成丝状的纤维 包埋体，酶包埋在纤维束内。 包埋量高、包埋牢固。
载体：离子交换剂。 阴 离 子 交 换 剂 ： 二 乙 氨 基 乙 基 (DEAE)- 纤 维 素 、 混 合 胺 类 (ECTEOLA)- 纤 维 素 、 四 乙 氨 基 乙 基 (TEAE)- 纤 维 素 、 DEAE葡聚糖凝胶等； 阳 离 子 交 换 剂 ： 羧 甲 基 (CM)- 纤 维 素 、 纤 维 素 柠 檬 酸 盐 、 Amberlite CG-50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。
载体：有机载体：纤维素、胶原、淀粉等； 无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、
二氧化钛、羟基磷灰石等。 纳米材料载体：聚苯乙烯、金纳米颗粒等；比表面积
大、生物相容性好，但难于分离、易产生团聚。
（2）离子吸附法 (ion adsorption)
定义：将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力 相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定 化方法。
分为： 聚丙稀酰胺凝胶包埋法 海藻酸钙凝胶包埋法 琼脂凝胶包埋法 辐射包埋法
破坏或受损。 （4）固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高
催化效率和产物的量。 （5）所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反
应。 （6）固定化酶的成本适中，以利于工业使用。
定义：利用电离辐射引发产生自由基的能力，在 室温或低温下诱发有机单体合成生物高分子材料 来包埋酶的方法。
如辐射聚合的水凝胶包埋酶。
（2）纤维包埋法
大规模生产。 把酶溶液在高聚物（醋酸纤维素、聚乙烯）的有机
溶剂（二氯甲烷）中乳化，然后通过多孔喷丝头把 上述乳化液挤压进入凝结液中，即形成丝状的纤维 包埋体，酶包埋在纤维束内。 包埋量高、包埋牢固。
载体：离子交换剂。 阴 离 子 交 换 剂 ： 二 乙 氨 基 乙 基 (DEAE)- 纤 维 素 、 混 合 胺 类 (ECTEOLA)- 纤 维 素 、 四 乙 氨 基 乙 基 (TEAE)- 纤 维 素 、 DEAE葡聚糖凝胶等； 阳 离 子 交 换 剂 ： 羧 甲 基 (CM)- 纤 维 素 、 纤 维 素 柠 檬 酸 盐 、 Amberlite CG-50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。
载体：有机载体：纤维素、胶原、淀粉等； 无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、
二氧化钛、羟基磷灰石等。 纳米材料载体：聚苯乙烯、金纳米颗粒等；比表面积
大、生物相容性好，但难于分离、易产生团聚。
（2）离子吸附法 (ion adsorption)
定义：将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力 相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定 化方法。
分为： 聚丙稀酰胺凝胶包埋法 海藻酸钙凝胶包埋法 琼脂凝胶包埋法 辐射包埋法
酶工程 第五章 酶、细胞、原生质体固定化
酶工程（Enzyme Engineering）
——让工厂高效、安静、美丽如画的工程
强生稳豪倍易血糖仪
工作原理: 利用试纸上的固定化酶 (葡萄糖氧化酶, Glucose oxidase , GOD) 与血液中的葡萄糖反应产生 的电流来测血糖值。
葡萄糖氧化酶电极
半透膜 酶胶层
感应电极
酶电极示意图
优点
① 活性中心不易被破坏，高级结构保持完整；
② 操作简单，固定化和纯化过程可能同时实现；
③ 酶失活后载体仍可再生。
缺点
① 最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不 一定呈平行关系； ② 酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活 下降并污染产物。
物理吸附法固定化酶举例
载体 活性炭 多孔玻璃 固定化酶
本章主要内容
第一节 酶固定化 第二节 细胞固定化 第三节 原生质体固定化
第一节 酶的固定化
一、固定化酶的制备
早期： 水不溶酶（water insoluble enzyme） 固相酶（solid phase enzyme） 水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶（固定化酶）
2. 酶的组成
单纯酶 酶
结合酶
（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子
辅酶 辅基
酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分。 辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。
3. 酶的活性中心（active center）
结合基团 活性中心 必需基团 活性中心外 必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变， 则酶的活性丧失。 活性中心：酶分子中直接与底物结合，并和酶 催化作用直接相关的部位。
适用于带芳香氨基载体。
——让工厂高效、安静、美丽如画的工程
强生稳豪倍易血糖仪
工作原理: 利用试纸上的固定化酶 (葡萄糖氧化酶, Glucose oxidase , GOD) 与血液中的葡萄糖反应产生 的电流来测血糖值。
葡萄糖氧化酶电极
半透膜 酶胶层
感应电极
酶电极示意图
优点
① 活性中心不易被破坏，高级结构保持完整；
② 操作简单，固定化和纯化过程可能同时实现；
③ 酶失活后载体仍可再生。
缺点
① 最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不 一定呈平行关系； ② 酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活 下降并污染产物。
物理吸附法固定化酶举例
载体 活性炭 多孔玻璃 固定化酶
本章主要内容
第一节 酶固定化 第二节 细胞固定化 第三节 原生质体固定化
第一节 酶的固定化
一、固定化酶的制备
早期： 水不溶酶（water insoluble enzyme） 固相酶（solid phase enzyme） 水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶（固定化酶）
2. 酶的组成
单纯酶 酶
结合酶
（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子
辅酶 辅基
酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分。 辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。
3. 酶的活性中心（active center）
结合基团 活性中心 必需基团 活性中心外 必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变， 则酶的活性丧失。 活性中心：酶分子中直接与底物结合，并和酶 催化作用直接相关的部位。
适用于带芳香氨基载体。
第五章 工程酶 固定化酶
包括单元操作、化学反应工程、传
递过程、化工热力学、化工系统工 程、过程动态学及控制等方面
单一的物 理、化学 方法
生物工程 和化学工 程相结合
借助计算 机优选数 据，辅助
设计
•如合成酶、印迹酶主要采用化学合成方法
•抗体酶、杂合酶、进化酶常采用蛋白质工 程技术研制
酶制剂催化反应后，和产物是混合在一起的， 产物的纯度不高，并且酶制剂不能重复使用。
微囊化包埋法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的 小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透 膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等
凝胶包埋法之（1）琼脂凝胶包埋法
将一定量的琼脂加入到一定体积的水 中，加热使之溶解，然后冷却至 48~55°C，加入一定量的酶液，迅速 搅拌均匀后，趁热分散在预冷的甲苯或 四氯乙烯溶液中，形成球状固定化细胞 胶粒，分离后洗净备用。
凝胶包埋法总结
天然凝胶
凝胶
包埋条件 酶活性
琼脂、海藻酸钙、温和 角叉菜胶、明胶
不变
强度 差
合成凝胶 聚丙烯酰胺、光 聚合反应 部分失活 高 交联树脂
半透膜（微囊化）包埋法
是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球 内，制成固定化酶。半透膜的孔径只有几Å 至几十Å ，所以也称为微囊化法。 适用于底 物和产物都是小分子物质的情况
要避免用高温、强酸碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会 使酶变性失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。
原则 • 保持酶原有的专一性、高效催化能力和在常温常压下能
一
起催化反应的特点
原则 • 应该有利于生产自动化、连续化，有一定的机械强度，
二
不能因机械搅拌而破碎或脱落
原则 三
原则
• 固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物
酶工程制药—固定化酶技术
固定化技术 海藻酸钙包埋法装置 将水溶性的海藻酸钠配成水溶液， 并把酶或细胞分散在其中，然后 将其滴入凝固浴中（常用CaCl2 溶液），使海藻酸钠中的Na+， 部分被Ca2+所取代而形成由多 价离子交联的离子网络凝胶。
（3）角叉菜胶包埋法 角叉菜，属褐藻门，杉藻科，角叉菜属， 自然分布于大西洋沿岸和我国东南沿海 以及青岛、大连等海域，是中国的一种 重要经济海藻。角叉菜不仅是卡拉胶生 产的重要原藻，而且近年来越来越多地 应用于医药领域，引起人们的广泛关注。
交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作 用，制成网状结构的固定化酶的方法。 常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺 丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广 泛的是戊二醛。 戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶 或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫 （Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联， 制成固定化酶或固定化菌体。
固定化技术 （1）琼脂凝胶包埋法 将一定量的琼脂加入到一定体积的水中，加热使之溶解，然后冷却至48~55°C，加入 一定量的酶液，迅速搅拌均匀后，趁热分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球 状固定化细胞胶粒，分离后洗净备用。 缺点：机械强度较差，底物、产物扩散困难，故使用受限制
（2）海藻酸钙凝胶包埋法 称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓度的海藻酸钠溶液，经杀菌冷却后，与一定 体积的酶液或细胞混合均匀，然后用注射器或滴管将冷凝悬液滴到一定浓度的氯化钙溶液中。 优点：操作简便、条件温和，对细胞无毒害，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径。 使用时注意控制培养基中磷酸盐的浓度，维持一定的钙离子浓度。
课堂总结
固定化酶的特点
固定化技术与固定化酶概述
引入
固定化生物技术 通过化学或物理的手段将酶或游 离细胞定位于限定的空间区域内， 使其保持活性并可反复利用。
第五章 酶工程制药技术
抗炎净创类：目前在治疗上发展最快。 多数为蛋白水解酶，分解发炎部纤维蛋白的凝结物，
消除伤口周围坏疽、腐肉和碎屑。 有些可以分解脓液中核蛋白，达到净洁创口、消炎
目的。 主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶。
➢ 血凝和解凝类：这类从血液中提取。 凝血酶 使血液凝固，防止微血管出血
纤维蛋白溶解酶 溶解血块，治疗血栓静脉炎、 冠状动脉栓塞。
➢ 作用力：离子键
➢ 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖 凝胶、CM-纤维素
优点：条件温和，操作简便，酶活力损 失少。
缺点：结合力弱，易解吸附。
➢ 2.共价偶联法
借助共价键将酶 的活性非必需侧 链基团和载体的 功能基团进行偶 联。
➢ （1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
➢ （3）水解酶：
催化由水分子介入使基质共价键水解反应，切断键有酯键、糖苷键、醚键、 肽键。
➢ （4）裂解酶：
催化用水解以外的方法使原子团和基质分离，在基质上生成双键反应，
➢ （5）异构酶：
催化不伴有基质分子水解、转移、氧化还原的分子异构反应。
➢ （6）连接酶：
催化将ATP或类似三磷酸化合物的焦磷酸键切断，使连个分子连接反应。
第五章 酶工程制药技术
重点内容：酶固化技术；
第一节 酶工程概述
➢ 一、酶工程简介（Enzyme Engineering） 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合和
发展而成的一门新的技术学科。它是从应 用的目的出发研究酶、应用酶的特殊催化 性能，并通过工程化将相应原料转化成有 用物质的技术。
➢ 酶工程这个名字出现在20世纪20年代，主 要指自然酶制剂在工业上的规模应用。
纤维素
葡聚糖凝胶
消除伤口周围坏疽、腐肉和碎屑。 有些可以分解脓液中核蛋白，达到净洁创口、消炎
目的。 主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶。
➢ 血凝和解凝类：这类从血液中提取。 凝血酶 使血液凝固，防止微血管出血
纤维蛋白溶解酶 溶解血块，治疗血栓静脉炎、 冠状动脉栓塞。
➢ 作用力：离子键
➢ 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖 凝胶、CM-纤维素
优点：条件温和，操作简便，酶活力损 失少。
缺点：结合力弱，易解吸附。
➢ 2.共价偶联法
借助共价键将酶 的活性非必需侧 链基团和载体的 功能基团进行偶 联。
➢ （1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
➢ （3）水解酶：
催化由水分子介入使基质共价键水解反应，切断键有酯键、糖苷键、醚键、 肽键。
➢ （4）裂解酶：
催化用水解以外的方法使原子团和基质分离，在基质上生成双键反应，
➢ （5）异构酶：
催化不伴有基质分子水解、转移、氧化还原的分子异构反应。
➢ （6）连接酶：
催化将ATP或类似三磷酸化合物的焦磷酸键切断，使连个分子连接反应。
第五章 酶工程制药技术
重点内容：酶固化技术；
第一节 酶工程概述
➢ 一、酶工程简介（Enzyme Engineering） 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合和
发展而成的一门新的技术学科。它是从应 用的目的出发研究酶、应用酶的特殊催化 性能，并通过工程化将相应原料转化成有 用物质的技术。
➢ 酶工程这个名字出现在20世纪20年代，主 要指自然酶制剂在工业上的规模应用。
纤维素
葡聚糖凝胶
酶工程原理及应用-04 05 酶的工程化改造(分子修饰和固定化)
-OH
20K
100
10
mPEGCOOH5
-COOH
5K
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mPEGCOOH10
-COOH
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100
10
mPEGCOOH20
-COOH
20K
100
10
MPEG-NHS5
-N-羟基琥珀酰亚 胺
5K
100 10
5
MPEGNHS10
-N-羟基琥珀酰亚 胺
10K
100 10 5
MPEGNHS20
-N-羟基琥珀酰亚 胺
20K
100 10 5
3500 700
7000 1400
7000 1400
10000 2000
15000 3000
20000 4000
20000 4000 2000
30000 6000 3000
35000 7000 3500
IEF和SDS-PAGE鉴定PEG修饰蛋白
Comassie blue stain Iodine stain
b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合 剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成 螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从 酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。
c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子， 酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经 过金属离子置换后的酶。
1 2 34 5
45
1
2
3
4+
94.0 66.2 43.0
31.0
-
20.1
《固定化酶》课件
《固定化酶》课件
目
CONTENCT
录
• 酶的介绍 • 固定化酶的原理与技术 • 固定化酶的制备与表征 • 固定化酶的实际应用 • 固定化酶的发展前景与挑战
01
酶的介绍
酶的定义与特性
酶的定义
酶是由生物体产生的一种具有催化作 用的有机物，能够加速化学反应的速 率而自身不发生化学变化。
酶的特性
高效性、专一性和作用条件温和的特 性。
在化学工业中的应用
固定化酶在化学工业中广泛应用于有机合成和手性合成。通过固定化酶技术，可 以将酶固定在载体上，实现高效、环保的有机合成，降低生产成本和环境污染。
固定化酶还可以用于药物的生产和研发，通过酶促反应实现药物的合成和修饰， 提高药物的疗效和降低副作用。
在环境保护中的应用
固定化酶在环境保护中广泛应用于废水处理和污染物降解。通过固定化酶技术，可以将酶固定在载体上，实现高效、稳定的 废水处理和污染物降解，降低环境污染和生态风险。
固定化酶的技术方法
总结词
固定化酶的技术方法
详细描述
固定化酶的技术方法主要包括吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等。这些方法各有特点，可根据不同的应用 需求选择适合的方法。
固定化酶的应用领域
总结词
固定化酶的应用领域
详细描述
固定化酶的应用领域广泛，包括生物传感器、生物反应器、药物制造、环境保护等领域。通过固定化 酶技术，可以实现酶的重复利用，提高反应效率，降低生产成本，为相关领域的发展提供有力支持。
智能化
通过与人工智能技术的结合，实现固定化酶的智能 化调控和优化，提高酶的利用效率和生产效益。
固定化酶面临的挑战
80%
稳定性问题
固定化酶在使用过程中可能会受 到环境因素的影响，如温度、pH 值等，导致酶的活性降低或失活 。
目
CONTENCT
录
• 酶的介绍 • 固定化酶的原理与技术 • 固定化酶的制备与表征 • 固定化酶的实际应用 • 固定化酶的发展前景与挑战
01
酶的介绍
酶的定义与特性
酶的定义
酶是由生物体产生的一种具有催化作 用的有机物，能够加速化学反应的速 率而自身不发生化学变化。
酶的特性
高效性、专一性和作用条件温和的特 性。
在化学工业中的应用
固定化酶在化学工业中广泛应用于有机合成和手性合成。通过固定化酶技术，可 以将酶固定在载体上，实现高效、环保的有机合成，降低生产成本和环境污染。
固定化酶还可以用于药物的生产和研发，通过酶促反应实现药物的合成和修饰， 提高药物的疗效和降低副作用。
在环境保护中的应用
固定化酶在环境保护中广泛应用于废水处理和污染物降解。通过固定化酶技术，可以将酶固定在载体上，实现高效、稳定的 废水处理和污染物降解，降低环境污染和生态风险。
固定化酶的技术方法
总结词
固定化酶的技术方法
详细描述
固定化酶的技术方法主要包括吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等。这些方法各有特点，可根据不同的应用 需求选择适合的方法。
固定化酶的应用领域
总结词
固定化酶的应用领域
详细描述
固定化酶的应用领域广泛，包括生物传感器、生物反应器、药物制造、环境保护等领域。通过固定化 酶技术，可以实现酶的重复利用，提高反应效率，降低生产成本，为相关领域的发展提供有力支持。
智能化
通过与人工智能技术的结合，实现固定化酶的智能 化调控和优化，提高酶的利用效率和生产效益。
固定化酶面临的挑战
80%
稳定性问题
固定化酶在使用过程中可能会受 到环境因素的影响，如温度、pH 值等，导致酶的活性降低或失活 。
酶工程固定化酶
本科学生实验报告学号124120462 姓名学院生命科学学院班级12级生物技术班实验课程名称酶工程学实验指导教师及职称吴倩老师开课时间2014 至2015 学年下学期填报时间2015 年 5 月28 日实验五淀粉酶的固定化及其性质测定一、目的要求1、了解酶制剂的固定化方法。
2、学会固定化酶酶学特性的测定方法。
二、实验原理1、酶的固定化把游离的水溶性酶限制在某一局部空间或固体载体上，酶固定后既不会流失，也不会污染产品，而且稳定性得到提高，可长期反复使用。
2、最常用的固定化的方法是包埋法。
3、海藻酸钙包埋法：通常是在其钠盐溶液中加入二价离子（如Ca2+），通过Ca2+取代Na+来形成凝胶网络。
三、实验材料与仪器（一）实验材料1.淀粉酶发酵粗酶液2.0.1moL,3.pH5.0的缓冲液4. 2%（w/v）可溶性淀粉溶液（现配现用）：称取2.0克可溶性淀粉，用约80mL缓冲液调匀，加热煮沸直到淀粉完全溶解；冷却，调pH值，并用缓冲液定容至100mL。
5.DNS试剂6.2%、3%、4%、5%的海藻酸钠7.2%的CaCl2溶液。
（二）实验仪器1.试管及试管架2.10mL离心管3.离心机4.移液器5.电子天平6.恒温水浴锅7.注射器8.涡旋混合器9.紫外可见分光光度计、比色皿、记时器10.电磁炉、搪瓷缸四、实验方法（一）、酶液的制备将发酵液量取10mL于离心管中——离心——离心上清液用缓冲液稀释到合适浓度——待测酶液。
（二）、淀粉酶的固定化1、配制海藻酸钠，高压灭菌后取出，静置一昼夜（待气泡消失）；2、将不同浓度的海藻酸钠与1mL酶液混合（约3:1），得到的混合液应为粘稠状；3、以均匀的速度用注射器将混合液滴入装有2%CaCl2溶液的烧杯中，交联成球体后，在CaCl2溶液中继续浸泡约20min。
（三）、固定化淀粉酶性质的测定1、固定化酶与游离酶稳定性比较将得到的固定化淀粉酶（海藻酸钠浓度为3%）与等量的游离淀粉酶分别在60℃下保温10min、15min、20min、25min、30min，保温后按标准方法进行酶活测定，并比较吸光值和酶活性（分别做两个平行）。
第五章酶的固定化
溶液酶总活力数-残留酶活力数
3. 固定化酶的性质 （1）固定化后酶活力的变化——酶活力降低，反应速度下降 原因：
1）构象改变：酶分子在固定化过程中，空间构象会 有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸。
2）空间位阻：固定化后，酶分子空间自由度受到限 制（空间位阻），会直接影响到活性中心对底物的 定位作用。
实验 木瓜蛋白酶的固定化
酶的固定化步骤： （1）每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6% CaCl2溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室温下 保温10s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。取出 后用水冲去污物，用吸水纸吸干。 （2）将尼龙布用3.65mol/L HCl溶液在室温下水解 45min，用水洗至pH值中性。 （3）将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联 20min。
热处理法
吸附法
1. 吸附作用力 2. 固体吸附剂包括活性炭、氧化铝、硅藻土、
多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石 3. 优缺点
（3）包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定
化的方法称为包埋法。
包埋法
凝胶包埋法（网格型） 半透膜包埋法（微囊型）
只适合作用于小分子底物和产物的酶。
2➢）影载响体酶性的质催对化最基适团p的H的解影离响； 一般用带负电荷载体（阴离子聚合物）制备的固定 ➢ 影响酶的结合基团的解离
化酶，其最适pH↑。 ➢ 改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合 一般用带正电荷载体（阳离子聚合物）制备的固定
化后不酶能，生其成最产适物pH。↓。
3）产物性质对最适pH的影响； 产物酸性，其最适pH↑。 产物碱性，其最适pH↓。 产物中性，其最适pH不变。
固定化酶的最适温度 ——可能提高
➢载体性质
固定化酶的最适pH ——发➢产生✓✓物变带带性➢负正化作质电电用荷 荷于： ：小固 固分定 定子化 化底酶 酶物pp的HH↑ ↓酶－ 固定化酶的底物特异性 ——可✓产能不物变改酸变性：固定化酶pH↑ 固定化酶的米氏常数（Km）✓✓—产产➢—物物可碱中改作➢－性性载用K变m：：体于降固固与小低底定定分化化物子酶酶电及荷pp大HH相↓不分反变子
3. 固定化酶的性质 （1）固定化后酶活力的变化——酶活力降低，反应速度下降 原因：
1）构象改变：酶分子在固定化过程中，空间构象会 有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸。
2）空间位阻：固定化后，酶分子空间自由度受到限 制（空间位阻），会直接影响到活性中心对底物的 定位作用。
实验 木瓜蛋白酶的固定化
酶的固定化步骤： （1）每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6% CaCl2溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室温下 保温10s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。取出 后用水冲去污物，用吸水纸吸干。 （2）将尼龙布用3.65mol/L HCl溶液在室温下水解 45min，用水洗至pH值中性。 （3）将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联 20min。
热处理法
吸附法
1. 吸附作用力 2. 固体吸附剂包括活性炭、氧化铝、硅藻土、
多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石 3. 优缺点
（3）包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定
化的方法称为包埋法。
包埋法
凝胶包埋法（网格型） 半透膜包埋法（微囊型）
只适合作用于小分子底物和产物的酶。
2➢）影载响体酶性的质催对化最基适团p的H的解影离响； 一般用带负电荷载体（阴离子聚合物）制备的固定 ➢ 影响酶的结合基团的解离
化酶，其最适pH↑。 ➢ 改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合 一般用带正电荷载体（阳离子聚合物）制备的固定
化后不酶能，生其成最产适物pH。↓。
3）产物性质对最适pH的影响； 产物酸性，其最适pH↑。 产物碱性，其最适pH↓。 产物中性，其最适pH不变。
固定化酶的最适温度 ——可能提高
➢载体性质
固定化酶的最适pH ——发➢产生✓✓物变带带性➢负正化作质电电用荷 荷于： ：小固 固分定 定子化 化底酶 酶物pp的HH↑ ↓酶－ 固定化酶的底物特异性 ——可✓产能不物变改酸变性：固定化酶pH↑ 固定化酶的米氏常数（Km）✓✓—产产➢—物物可碱中改作➢－性性载用K变m：：体于降固固与小低底定定分化化物子酶酶电及荷pp大HH相↓不分反变子
第五章酶学
标记试剂。这种试剂象底物一样进入活性部位，接 近结合位点，并以其活泼的化学基团与活性部位的 某一基团共价结合，而指示出酶活性部位的特征。
+
X-Y
酶原与酶原激活
酶原：细胞中合成的不具催化活性的
酶前体形式，称为~。
酶原激活：将无活性的酶原转变活性
酶的过程称为~。
肠激酶（激活作用）
缬 缬 缬 天 天 天 天 赖 异 缬 甘 组 S S 活性中心 缬 缬 天 天 天 天 赖 缬 缬 甘 组 S S S 胰 蛋 白 酶 S 胰 蛋 白 酶 原
5、活性部位微环境的影响
（酶活性中心是低介电区域）
酶活性中心处于一个非极性环境中， 其介电常数较在水介质（极性介质）中 的介电常数低，在非极性环境中两个带 电基团之间的静电作用比在极性环境中 显著增高。从而有利于同底物的结合。
酶催化作用机理： 综上所述：
酶与底物结合时，由于酶的变形（诱导契 合）或底物变形使二者相互适合，并依靠离 子键、氢键、范德华力的作用和水的影响， 结合成中间产物，在酶分子的非极性区域内， 由于酶与底物的邻近、定向，使二者可以通 过亲核\亲电催化、一般酸\碱催化或金属离 子催化方式进行多元催化，从而大大降低反 应所需的活化能，使酶促反应迅速进行。
分子水平上对酶的催化活性进行调节 共价修饰、变构调节、同功酶调节等 在酶分子合成水平上对酶量进行调节 酶量调节
共价修饰调节：
共价调节酶通过酶对其多肽链上某些基因进 行可逆的共价修饰使处于活性和非活性之间 的互变状态，从而调节酶活性
变构调节：
酶分子的非催化部位与某些化合物可逆的非 共价结合后发生构象的改变，从而改变酶活 性状态
第四节 酶分子的组成与结构
简单蛋白质酶
+
X-Y
酶原与酶原激活
酶原：细胞中合成的不具催化活性的
酶前体形式，称为~。
酶原激活：将无活性的酶原转变活性
酶的过程称为~。
肠激酶（激活作用）
缬 缬 缬 天 天 天 天 赖 异 缬 甘 组 S S 活性中心 缬 缬 天 天 天 天 赖 缬 缬 甘 组 S S S 胰 蛋 白 酶 S 胰 蛋 白 酶 原
5、活性部位微环境的影响
（酶活性中心是低介电区域）
酶活性中心处于一个非极性环境中， 其介电常数较在水介质（极性介质）中 的介电常数低，在非极性环境中两个带 电基团之间的静电作用比在极性环境中 显著增高。从而有利于同底物的结合。
酶催化作用机理： 综上所述：
酶与底物结合时，由于酶的变形（诱导契 合）或底物变形使二者相互适合，并依靠离 子键、氢键、范德华力的作用和水的影响， 结合成中间产物，在酶分子的非极性区域内， 由于酶与底物的邻近、定向，使二者可以通 过亲核\亲电催化、一般酸\碱催化或金属离 子催化方式进行多元催化，从而大大降低反 应所需的活化能，使酶促反应迅速进行。
分子水平上对酶的催化活性进行调节 共价修饰、变构调节、同功酶调节等 在酶分子合成水平上对酶量进行调节 酶量调节
共价修饰调节：
共价调节酶通过酶对其多肽链上某些基因进 行可逆的共价修饰使处于活性和非活性之间 的互变状态，从而调节酶活性
变构调节：
酶分子的非催化部位与某些化合物可逆的非 共价结合后发生构象的改变，从而改变酶活 性状态
第四节 酶分子的组成与结构
简单蛋白质酶
酶工程固定化酶的性质PPT讲稿
可以得用外到定宏扩性观的散语体实言系来际相描上同述。水包平括的分底子物扩，因散而和观对测流到扩的实散效两反部
①应速底物度和，其常它低效于应物理分论子预量测对的扩散水速平率。的对影于响分这析种表影明响，，一通般情
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活酶涌A化纤2比酶pp而6的最SHH30•••酶1，维量力明用％适胰8移另.℃的例3向.素为回等戊，0温蛋向活影由9一，变活碱8如经每收F(二而度酸白中响下力而种i1力为性，化1m达9对不醛侧酶性克且的式9回方％回p区李学93分变的固和蛋复0H即年情求收法收移增法％子的。7糜＝定白合使)况得率率是动.吉共；量，0用蛋酶于物在—分了下 ：等价，：以为例壳白9、8脱7别0(固.，.也聚5V如00酶聚1胰4．乙Vm0为9℃定0(固乙壳叫’0的.糖9隋蛋m4酰4m3仍（化g0烯聚个定V固7最年德白和作.0壳’％后有B糖pB基0化定适)新m酶1载－iH、聚的报，6较m固吡.酶温等和.化单体B7直糖B道8对高定啶’4度胃m，i的位效，％m链），g载分的化与则蛋时1，酶戊率、淀用子体活胃9聚比白，（活9二5×粉、D量蛋性后甲01E酶游酶为％力醛的A残为)白。，基E。进离1活p和催作回—80酶存H用最丙另行酶力纤005化8交收。%C活50烯适外固回．高维％活M0联率力酸p也定9收的5素—。性剂H马可～纤复等有化分直下范，林1以维合实别，链。接降5围等分素物通℃验可在淀吸在8加，别5包叠。过证达最粉附不％宽1对埋氮也明佳8的天实9考一7，木9同衍有固条催％冬验虑81由瓜一生固定件化和氨7)测。扩％液蛋酶物定化下活9酸得4散。相白固，酶化，性酶％胰限酶酶当最定固下，蛋。制加适降定的白酶化姜、 式•中符号与Fi上m ％式相＝同，B’为固定化处×理1后00，% 回收的未固定的酶蛋白的 量•。实际上这种方法，只Vm考.虑B 了在固定化处理过程中，固定化方法对 酶虑•。蛋式B白im中构为F型制im、为得活活的性力固中回定心收化等率酶的(湿％影体)响，积，B；为把V固m未为定被固化固定前定化所化前用的的的酶酶游蛋的离白最酶作大溶为反液回体应收积考速；
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• 使反应速度达到 某一稳定水平， 与底物反应，间 隔取样，终止反 应并测定
第一节 概述
第二节 固定 化酶的制备
第三节 固定 化酶的性质
what
how
when
工程
酶
which
why
1984年，英国剑桥大学学者Alan Fersht
在其所著《酶的结构和作用机制》一书中， 首次采用了工程酶engineering enzymes
一词，来表达由基因工程技术制备的基因 克隆酶和基因诱导酶
热处理法也可以与交联法或其他固定 化方法联合使用。
各种固定化酶方法的优缺点比较
特性 制备
物理吸 离 子 结 包埋法
附法 合法
易
易
易
共价结 合法
难
交联法 易
结合力 中
弱
强
强
强
酶活力 高
高
高
中
中
底物专 无变化 无变化 一性
再生 可能 可能
无变化 不可能
有变化 不可能
有变化 不可能
固定化 低
低
中
中
低
费用
要避免用高温、强酸碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会 使酶变性失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。
原则 • 保持酶原有的专一性、高效催化能力和在常温常压下能
一
起催化反应的特点
原则 • 应该有利于生产自动化、连续化，有一定的机械强度，
二
不能因机械搅拌而破碎或脱落
原则 三
原则
• 固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物
凝胶包埋法总结
天然凝胶
凝胶
包埋条件 酶活性
琼脂、海藻酸钙、温和 角叉菜胶、明胶
不变
强度 差
合成凝胶 聚丙烯酰胺、光 聚合反应 部分失活 高 交联树脂
半透膜（微囊化）包埋法
是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球 内，制成固定化酶。半透膜的孔径只有几Å 至几十Å ，所以也称为微囊化法。 适用于底 物和产物都是小分子物质的情况
十二烷基硫酸钠 SDS
了解目标酶
评估固定化酶的 实用价值
固定化酶的活力、固定化
物理化学性质、 选择适当方法和 效率、酶活力回收率、最
结构等
操作
适反应条件、使用稳定性
活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团 固有的高级结构不受到损害
功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基等，当这些功 能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合
核心问题就是酶 固定化后的催化 活性和稳定性的 变化，以及最适 反应条件的变化
基本评估指标
固定化酶 固定化酶 酶的固定 的活力回 固定化酶 的活力 化效率 收率和相 的半衰期
对活力
（一）固定化后酶活性变化
固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，专一性也可能发 生变化。
①酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性 中心的氨基酸；
这些试剂 也常用于 色谱分离
包埋法
将酶包埋在各种多孔载体中，使 酶固定化的方法。
根据载体材料和方法的不同，可分为：
凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微 孔中，制成一定形状的固定化酶。大多数为球状或片 状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝 胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及 聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。
凡是应用某种技术操作，对天然酶进行性 能优化和其他人为研制的生物催化剂，都 统称为工程酶
酶对环境条件敏感，高温、过酸过碱易变性 游离酶只能使用一次，不经济 酶催化反应的产物与酶分离不便 所催化的反应只有六类 含量太少，产量不够，而且不具广谱性
氧还 转移 水解 裂合 异构 连接 酶酶酶酶酶酶
未发现天然存在的DNA酶
角叉菜，属褐藻门，杉藻科，角叉菜属，自然分布于 大西洋沿岸和我国东南沿海以及青岛、大连等海域， 是中国的一种重要经济海藻。角叉菜不仅是卡拉胶生 产的重要原藻，而且近年来越来越多地应用于医药领 域，引起人们的广泛关注。
将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水中，加热溶 解。灭菌后冷却到30-50°C，与一定量的酶液等混合 均匀后，趁热滴到预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到 冷的植物油中，成型后再置于氯化钾溶液中的到球状 固定化颗粒。
例如把红细胞置于含目的酶的高渗液中，使 红细胞失水皱缩，漏出内容物而酶扩散进入， 然后在等渗溶液中回复球状而成
在酶的固定化过程中，酶与载体之间或酶与交联剂 之间发生共价结合反应
分为载体偶联法和交联法
载体偶联固定化法
概念：非水溶性载 体与酶以共价键 的形式结合
可以形成共价键的
基团：
游离氨基，
酶直接交联法
• 在酶液中加入适量双功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度 和反应时间之间的平衡
吸附交联法
• 先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其 他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交 联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶
交联包埋法
（5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法
先配置一定浓度的丙烯酰胺arc和甲
叉双丙烯酰胺bis与一定量的酶液等
混合均匀后加入一定量的过硫酸钙
和四甲基乙二胺，混合后让其静置
聚合即可获得。
优点：机械强度高，可调节凝胶孔径
缺点：丙烯酰胺单体有毒性
arc和bis的比 例
arc的浓度
（6）光交联树脂包埋法
例：相对分子量为1000-3000的光 交联聚氨酯预聚物等，加入1%左 右的光敏剂，加水配成一定浓度， 加热至50℃，然后与一定浓度的细 胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度 的薄层，用紫外照射3min，就可 制得
包括单元操作、化学反应工程、传
递过程、化工热力学、化工系统工 程、过程动态学及控制等方面
单一的物 理、化学 方法
生物工程 和化学工 程相结合
借助计算 机优选数 据，辅助
设计
•如合成酶、印迹酶主要采用化学合成方法
•抗体酶、杂合酶、进化酶常采用蛋白质工 程技术研制
酶制剂催化反应后，和产物是混合在一起的， 产物的纯度不高，并且酶制剂不能重复使用。
②固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影 响到活性中心对底物的定位作用；
③内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻
④包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能过膜与酶接 近。
（二）酶稳定性的变化
1、热稳定性提高 2、对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高 3、固定化酶对不同pH稳定性提高 4、抗蛋白酶的稳定性提高 5、操作稳定性和贮藏稳定性提高
载 • 载体带负电，pH向碱性方向移 体 动载体带正电，pH向酸性方向
移动
产 • 催化反应的产物为酸性时，固定 物 化酶的最适pH值比游离酶的pH
评价固定化酶的指标：
固定化酶的活力：每（克）干固定化酶所具有
的酶活力单位。 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、 酶管、酶板）。 或：单位液体体积的酶活力单位表示（湿酶）
非 水
游离羧基，
巯基，
溶 性
咪唑基， 酚基， 载
羟基， 甲硫基， 体
吲哚基，二硫键
保护酶的 活性中心
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
载体上 引进活
泼基团
活化该 活泼基
团
此活泼 基团再 与酶分 子上某 一基团 形成共
价键
重氮法
载体活 化的方 法
叠氮法
烷基化 反应法
硅烷化 法
溴化氰 法
交联法
最适温度提高，以交联法用壳
聚糖固定胰蛋白酶最适温度要 比固定化前提高了30 ℃。也有 报道最适温度不变或下降的。
（四）固定化酶的最适pH变化 • 酶固定化后，对底物作用的最适pH和活性-pH曲线常常 发生偏移 • 影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个，一个是载体 的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质
优点：通透性能好，对细胞无毒害。
（4）明胶包埋法
将一定量的明胶悬浮于一定体积的 水中，加热溶解。灭菌后冷却到 35°C以上，与一定量的酶液等混 合均匀后制成所需形状的胶粒。机 械强度不够可用戊二醛等双功能试 剂交联。
分子结构中具有两个或多个反应活泼基团的试剂 功能基团相同则为同型试剂，不同则为杂型试剂
1、包埋、共价结合、共价交联三种 虽结合力强、但不能再生、回收； 2、吸附法制备简单，成本低，能回 收再生，但结合差，在受到离子强 度、pH变化影响后，酶会从载体上 游离下来。 3、包埋法各方面较好，但不适于大 分子底物和产物。
酶在固定化前后 的性质变化包括 酶本身的 变化和
载体或交联剂带 来的影响
微囊化包埋法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的 小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透 膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等
凝胶包埋法之（1）琼脂凝胶包埋法
将一定量的琼脂加入到一定体积的水 中，加热使之溶解，然后冷却至 48~55°C，加入一定量的酶液，迅速 搅拌均匀后，趁热分散在预冷的甲苯或 四氯乙烯溶液中，形成球状固定化细胞 胶粒，分离后洗净备用。
如果将分离纯化后的酶固定到一定的载体上， 使用时将被固定的酶投放到反应溶液中，催化 反应结束后又能将被固定的酶回收
那么这种固定化的酶就可以象一般化学反应的 固体催化剂一样，既具有酶的催化特性，又具 有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点， 并且生产工艺可以连续化、自动化
例如，将葡萄糖异构酶吸附到离子 交换树脂上，或者包埋在明胶中， 制成的固定化葡萄糖异构酶，不仅 可以用于使葡萄糖转化成甜度更高 的高果糖浆、而且可以在生产中反 复使用。
使用时注意控制培养基中磷酸盐的浓度， 维持一定的钙离子浓度。
海藻酸钙 包埋法装置