分子生物学讨论课-遗传病基因诊断
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分子生物讲义：第五章 基因诊断和基因治疗
第五章 基因诊断和基因治疗
基因诊断
应用分子生物学技术，从DNA/RNA水平 检测分析致病基因的存在、变异和表达 状态从而对疾病作出诊断的诊断技术
诊断技术进展
细胞学检查：第一代，早期 生化指标分析：第二代，50年代 免疫学诊断：第三代，60年代
以疾病的表型改变，如细胞形态结构 变化、生化代谢产物异常、特定蛋白质 分子识别差异等为依据进行疾病诊断 基因诊断：第四代，70年代
（一）原位（in situ）杂交
不须提取DNA或RNA。直接用培养/采集 的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固 定载玻片上）和细菌菌落（复印至泸膜 上）与标记核酸探针杂交。可测知特定 基因的存在或表达状况。还可观察被测 基因在细胞内或染色体上的定位。
（二）斑点印迹（Dot blot） 杂交
把提取的DNA/RNA样本，直接点到硝酸 纤维膜或尼龙膜（下同）上与标记核酸 探针杂交。可检测特定基因的存在或表 达情况。
Southern印迹杂交
系将DNA经限制性酶切、凝胶电泳后， 再转移至膜上与标记探针杂交的一种核 酸分子杂交技术。其分析的特异性、敏 感性、准确性俱佳。它可检出哺乳动物 总基因组中的单拷贝基因。主要用于检 测基因组中特定的基因或序列。
Northern印迹杂交
是把RNA经凝胶电泳转移至膜上与标记 核酸探针杂交的技术。是分析基因表达 水平的主要技术之一。它可定性、定量 测知某一特定基因的表达情况。
（三）PCR-SSCP
该技术是基于不同的单链DNA（即使只差一个碱基） 有不同的空间构象，即DNA单链构象多态性(Singer Strand conformation polymorphysim,SSCP)。
这些不同构象的单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 中的迁移率是不同的。据此，将PCR扩增产物变性成单 链DNA，经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可测知DNA碱基序 列有无变异。
基因诊断
应用分子生物学技术，从DNA/RNA水平 检测分析致病基因的存在、变异和表达 状态从而对疾病作出诊断的诊断技术
诊断技术进展
细胞学检查：第一代，早期 生化指标分析：第二代，50年代 免疫学诊断：第三代，60年代
以疾病的表型改变，如细胞形态结构 变化、生化代谢产物异常、特定蛋白质 分子识别差异等为依据进行疾病诊断 基因诊断：第四代，70年代
（一）原位（in situ）杂交
不须提取DNA或RNA。直接用培养/采集 的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固 定载玻片上）和细菌菌落（复印至泸膜 上）与标记核酸探针杂交。可测知特定 基因的存在或表达状况。还可观察被测 基因在细胞内或染色体上的定位。
（二）斑点印迹（Dot blot） 杂交
把提取的DNA/RNA样本，直接点到硝酸 纤维膜或尼龙膜（下同）上与标记核酸 探针杂交。可检测特定基因的存在或表 达情况。
Southern印迹杂交
系将DNA经限制性酶切、凝胶电泳后， 再转移至膜上与标记探针杂交的一种核 酸分子杂交技术。其分析的特异性、敏 感性、准确性俱佳。它可检出哺乳动物 总基因组中的单拷贝基因。主要用于检 测基因组中特定的基因或序列。
Northern印迹杂交
是把RNA经凝胶电泳转移至膜上与标记 核酸探针杂交的技术。是分析基因表达 水平的主要技术之一。它可定性、定量 测知某一特定基因的表达情况。
（三）PCR-SSCP
该技术是基于不同的单链DNA（即使只差一个碱基） 有不同的空间构象，即DNA单链构象多态性(Singer Strand conformation polymorphysim,SSCP)。
这些不同构象的单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 中的迁移率是不同的。据此，将PCR扩增产物变性成单 链DNA，经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可测知DNA碱基序 列有无变异。
遗传性疾病与分子生物学诊断课件
突变若发生在生殖细胞，可能引起各种遗传性疾病； 若发生在体细胞，则可导致肿瘤、心血管疾病等。
表达异常：有些内源基因（如原癌基因）的表达异常则可能导 致细胞增生失控而发生肿瘤或其他类型紊乱。
遗传性疾病与分子生物学诊断
6
外源基因的入侵：如各种病原体感染人体后， 其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起 各种疾病。
• 若受检者 DNA既能与M结合，又能与N结合， 说明受检者是这种突变基因的杂合子；
• 若受检者 DNA不能与M结合，但能与N结合， 表明受检者不存在这种突变基因；
• 患者DNA和M、N均不结合，提示其缺陷基因可 能是一种新的突变类型。
遗传性疾病与分子生物学诊断
16
（二）聚合酶链反应（PCR）
• PCR技术采用特异性的引物，能特异性地扩增 出目的DNA片段。
20
• PCR／ASO法、PCR／SSCP法、PCR/RFLP法、 PCR／限制酶谱法的联合应用可省去繁琐的杂 交步骤，避免了放射污染，直接从电泳凝胶上 即可读出结果。
遗传性疾病与分子生物学诊断
21
（三）基因测序
• 分离出患者的有关基因，测定出其碱基排列顺序，找出其变异所在，这 是最为确切的基因诊断方法。
遗传性疾病与分子生物学诊断
3
基因变异致病可分为两种主要类型： 内源基因的变异 外源基因的入侵
遗传性疾病与分子生物学诊断
4
内源基因的变异：由于先天遗传背景的差异和后天内、 外环境的影响，人类基因结构及其表达的各个环节都 可能发生异常，而导致疾病。
基因结构突变 表达异常
遗传性疾病与分子生物学诊断
5
基因结构突变：点突变、缺失或插入突变、染色体易位、基因 重排，基因扩增等。
表达异常：有些内源基因（如原癌基因）的表达异常则可能导 致细胞增生失控而发生肿瘤或其他类型紊乱。
遗传性疾病与分子生物学诊断
6
外源基因的入侵：如各种病原体感染人体后， 其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起 各种疾病。
• 若受检者 DNA既能与M结合，又能与N结合， 说明受检者是这种突变基因的杂合子；
• 若受检者 DNA不能与M结合，但能与N结合， 表明受检者不存在这种突变基因；
• 患者DNA和M、N均不结合，提示其缺陷基因可 能是一种新的突变类型。
遗传性疾病与分子生物学诊断
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（二）聚合酶链反应（PCR）
• PCR技术采用特异性的引物，能特异性地扩增 出目的DNA片段。
20
• PCR／ASO法、PCR／SSCP法、PCR/RFLP法、 PCR／限制酶谱法的联合应用可省去繁琐的杂 交步骤，避免了放射污染，直接从电泳凝胶上 即可读出结果。
遗传性疾病与分子生物学诊断
21
（三）基因测序
• 分离出患者的有关基因，测定出其碱基排列顺序，找出其变异所在，这 是最为确切的基因诊断方法。
遗传性疾病与分子生物学诊断
3
基因变异致病可分为两种主要类型： 内源基因的变异 外源基因的入侵
遗传性疾病与分子生物学诊断
4
内源基因的变异：由于先天遗传背景的差异和后天内、 外环境的影响，人类基因结构及其表达的各个环节都 可能发生异常，而导致疾病。
基因结构突变 表达异常
遗传性疾病与分子生物学诊断
5
基因结构突变：点突变、缺失或插入突变、染色体易位、基因 重排，基因扩增等。
基因诊断和基因治疗分子生物学课件
五.基因诊断的应用及意义
1. 遗传性疾病的基因诊断 2. 肿瘤的基因诊断 3. 传染病的基因诊断 4. 个体识别和物证分析
五.基因诊断的应用及意义
1. 遗传性疾病的基因诊断
➢ 辅助遗传病的临床诊断 单基因遗传病的基因诊断 ：已不存在任何技术障碍 产前诊断：高危人群，优生优育
1.1k b
五.基因诊断的应用及意义
四.基因诊断的常用技术方法
3. 核酸序列分析技术
正常对照
患儿
病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变
最直接、最确切的基因诊断方法
四.基因诊断的常用技术方法
4. 限制性酶谱分析技术
H
M
N
最经典的基因诊断方法
பைடு நூலகம்
四.基因诊断的常用技术方法
5. 基因芯片
多基因多位点，基因表达分析，药物敏感分析 基因芯片技术是应用前景广阔的基因诊断技术
一.基因诊断的基本概念和特点
目标疾病：与基因有关 内源性基因变异疾病（先天/后天）
单基因病 多基因病
获得性基因病
外源性基因（如病毒等）侵入机体引起的疾病
一.基因诊断的基本概念和特点
特点 针对性强：特定基因 特异性高：针对序列的定性定量 灵敏度高：实现单分子诊断 稳定性高：遗传物质的稳定性，相对于表型 应用范围广：早期诊断，全程诊断
FISH
FISH荧光染色体原位杂交应用最为广泛
四.基因N诊C膜断的常用技术方法
点杂交Dot hybridization
探针
野生型 突变型
A
T
C
G
探针杂交
正常人
突变纯合子
突变杂合子
四.基因诊断的常用技术方法
分子生物学课件：2016-基因诊断
（难点）
1. 样品抽提
DNA RNA cDNA
2. PCR扩增
PCR既是获得样品的手 段，也可作为诊断方法
3. 分子杂交或测序
基因诊断操作
4. 信号检测与分析
第二节 常用基因诊断技术
常用基因诊断操作方法（分类I）：
定性分析
分析DNA序列 信息
限制性酶切图谱分析 PCR DNA 测序
核酸分子杂交
定量分析
w/w w/m m/m 3种基因型的 DNA样品
此技术 : 一个杂交袋内进能用一种探针 ! 检测 多种突变（需要多种探针）时就显得很麻烦！
3). 应用 ASO 探针进行的反向点杂交
• 先将探针点到NC膜上
• 然后将人该基因PCR产物 和已经在膜上的探针进行
一次检查可以同时 筛查多种突变！
斑点杂交。
利用分子生物学技术，通过检测基因及其表达产物的存在 状态，对人体疾病、状态作出诊断的方法。具有以下特点：
1）直击源头，病因诊断；2）特异针对某基因； 3）PCR放大，灵敏度高；4）适用范围广。
基因诊断是从疾病的源头进行诊断！
第一节 基因诊断的概念
二、基因诊断的范围：
分子诊断（molecular diagnosis）：使用分子生物学技 术对DNA及产物（RNA、蛋白质）定量定性。基因诊断特指 对DNA和RNA的分子诊断。
2). 用等位基因特异性寡核苷酸探针进行的点杂交
检测基因的点突变
• 先将DNA的PCR产物如图纵向点2复孔； • 然后如图剪开，分别与合成的等位基因特异性寡核苷酸探针
(allele specific oligonucleotide, ASO): w Probe 和 m Probe杂交
分子生物学之基因诊断与基因治疗
选择治疗基因选择携带治疗基因的载体选择基因治疗的靶细胞在细胞和整体水平导入治疗基因治疗基因表达的检测目录一选择治疗基因许多分泌性蛋白质如生长因子多肽类激素细胞因子可溶性受体人工构建的去除膜结合特征的受体以及非分泌性蛋白质如受体酶转录因子的正常基因都可作为治疗基因
基因诊断和基因治疗
Gene Diagnosis and Gene Therapy
病基因的治疗方法。它针对的是疾病的根源，
即异常的基因本身。
目录
一、基因治疗的基本策略
（一）缺陷基因精确的原位修复
基因矫正 致病基因的突变碱基进行纠正 gene correction 基因置换 用正常基因通过重组原位替换致病基因 gene replacement
这两种方法属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破 坏整个基因组的结构，又可达到治疗疾病的目的，是最为 理想的治疗方法。
基因治疗用载体有病毒载体和非病毒载体两大类， 多选用病毒载体。 野生型病毒必须经过改造，剔除其复制必需的基 因和致病基因，消除其感染和致病能力。 目前用作基因转移载体的病毒有逆转录病毒 （ retrovirus ）、腺病毒（ adenovirus ）、腺相关病毒 （ adeno-associated virus, AAV ） 、 单 纯 疱 疹 病 毒 （herpes simplex virus，HSV）等。
目录
亟待解决的问题
① 缺乏高效、靶向性的基因转移系统
② 缺乏切实有效的治疗靶基因 ③ 对治疗基因的表达还无法做到精确调控， 也无法保证其安全性 ④ 缺乏准确的疗效评价
目录
因的表达状态可以用 PCR 、 RNA 印迹、
蛋白印迹及ELISA等方法去检测。对于导
入基因是否整合到基因组以及整合的部位，
基因诊断和基因治疗
Gene Diagnosis and Gene Therapy
病基因的治疗方法。它针对的是疾病的根源，
即异常的基因本身。
目录
一、基因治疗的基本策略
（一）缺陷基因精确的原位修复
基因矫正 致病基因的突变碱基进行纠正 gene correction 基因置换 用正常基因通过重组原位替换致病基因 gene replacement
这两种方法属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破 坏整个基因组的结构，又可达到治疗疾病的目的，是最为 理想的治疗方法。
基因治疗用载体有病毒载体和非病毒载体两大类， 多选用病毒载体。 野生型病毒必须经过改造，剔除其复制必需的基 因和致病基因，消除其感染和致病能力。 目前用作基因转移载体的病毒有逆转录病毒 （ retrovirus ）、腺病毒（ adenovirus ）、腺相关病毒 （ adeno-associated virus, AAV ） 、 单 纯 疱 疹 病 毒 （herpes simplex virus，HSV）等。
目录
亟待解决的问题
① 缺乏高效、靶向性的基因转移系统
② 缺乏切实有效的治疗靶基因 ③ 对治疗基因的表达还无法做到精确调控， 也无法保证其安全性 ④ 缺乏准确的疗效评价
目录
因的表达状态可以用 PCR 、 RNA 印迹、
蛋白印迹及ELISA等方法去检测。对于导
入基因是否整合到基因组以及整合的部位，
医学分子生物学原理：第8章 第1节 基因诊断
基因诊断适用于遗传性疾病、感染性疾病、 肿瘤等多种疾病的诊断，以及个体识别和亲子鉴 定等法病学领域。
2021/7/1
3
（二）特点--以已知基因作为检测对象
（l）特异性强：直接检测导致疾病发生的基因变化； （2）灵敏度高：所采用的分子杂交和聚合酶链反应
等技术都具有信号放大作用； （3）取样便利：一般不受组织或时相的限制；
2021/7/1
27
EcoR Ⅰ限制性内切酶位点的变化
-GAATTC-CTTAAG-
AB C
－
＋
2021/7/1
D
D E F C B A G
E
－
＋
FG
C +D E F
B A G
28
(六)显微切割(microdissection)技术
1.组织细胞的显微切割
是应用激光捕获显微镜，在高倍镜下选择几 个甚至一个细胞进行分析；可用于石蜡包埋组织 进行回顾性诊断。
2021/7/1
31
PICS Altra II流式细胞仪(分析分
选)
32
(七)DNA序列测定
该法是基因诊断所有的技术方法中最准确最 可靠的—种。
缺点：费时、费力、费用高。
三、常见的基因异常及其检测
(一)点突变的检测 (二)大片段核苷酸丢失或插入的检测
(三)基因重排的检测
(四)基因扩增的检测 (五)DNA多态性的检测 (六)基因表达异常的检测 (七)病原体基因的检测
DNA微阵列 (DNA microarray)——通过计 算机控制点样和图像扫描的高密度集成探 针的杂交技术。
应用： 基因表达谱、单核苷酸多态性(SNP)和遗传 性疾病的分析；病原微生物的大规模检测。
《分子遗传学》基因诊断 ppt课件
Hair, semen, etc. for criminal investigations.
Archived pathological specimens, for typing dead people when no
DNA has been stored, or testing tumors for genetic changes. Only
Heteroduplex analysis
Denaturing High Performance Liquid Chromatography
DNA chips
GWAS
Scanning technologies aim to find unknown mutations
in candidate or known disease genes.
核酸分子杂交
核酸分子杂交 ：
是指单链核酸分子 （DNA或RNA）在特定条件 下,与另一条互补的特异 核酸链形成稳定双链的过 程。
2021/8/27
主要依据： 碱基互补、 变性和复性
33
几种分子间杂交
DNA:DNA
5’ A T G C C G A T 3’ T A C G G C
DNA:RNA
5’ A T G C G T A 3’ U A C G C A U
终止密码处产生终止密码，即所谓，会使基因表达 产生的多肽链缩短，失去或大大减弱肽链的功能。
终止密码突变（termination codon mutation）：突变
在原来终止密码处产生非终止密码，变成编码氨基 酸密码，叫做则其表达产物多肽链会延长，也会失 去或大大减弱正常多肽链的功能。
2021/8/27
20
碱基缺失和插入突变
分子生物学讨论课-遗传病基因诊断
生物芯片技术：
根据生物分子间特异性相互作用，
将生化分析过程集成于芯片表面，从而实
现对DNA、RNA、多肽、蛋白质等各种生物
成分的高通量快速检测分析。
常见芯片种类：
疾病诊断芯片 个性化用药芯片
景 广 阔芯 的片 基技 因术 诊是 断应 技用 术前
DNA
基因诊断策略
在分子发病机制水平上对 不同疾病的区分 诊断策略各不相同
基因诊断常用的分子生物学技术
核酸分子杂交 聚合酶链反应（PCR） DNA序列测定 生物芯片/DNA芯片 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP
） 单核苷酸多态性（SNP）
进应
行用
核酸分子杂交基本原理：
基核
——核酸变性和复性理论 和因酸
分的分
核酸分子杂交 基本过程
5. (- 3.7 / --SEA ) 2.0kb; 1.3kb
6. (/--SEA )
1.8kb; 1.3kb
-珠蛋白基因型 PCR产物片段长度
•- 3.7 •
2.0kb 1.8kb
临床报告单－－样式
α-地中海贫血点突变基因检测
临床意义：
作为 -地中海 贫血三种缺失型的 补充，对怀疑 地中海贫血有漏诊 的患者进行 CS、 QS、 WS点突变 的诊断（课同时检 测），确定具体的 基因突变类型
临床β-地中海贫血基因诊断结果判读
654M/71-72M 17M/N βEM/βEM 41-42M/N
临床报告单－－样式
α-地中海贫血
α地中海贫血的 基因缺陷主要为缺失 型，α基因共有四个 (父源和母源各两个)， 缺失一个为静止型， 缺失两个为标准型， 缺失三个为HbH(β4) 病，缺失四个为 HbBarts(γ4)胎儿水肿 (死胎)。
基因诊断
诊断方法的选用
应用连锁分析诊断时应注意如下几个问题：①基因与DNA标记之间可能发生重组。因此连锁分析的准确性取 决于DNA与致病基因连锁的紧密程度，连锁愈紧密，可靠性愈高，故应采用尽量靠近致病基因，即连锁紧密的标 记，或采用多个遗传标记以尽可能排除重组。由于可能存在重组，连锁分析不能完全确定致病基因是否存在，而 是指出存在可能性或概率的大小。如果标记距基因有5cM，即重组率为5%，则作出诊断时尚有5%误差的可能，即 只有95%的把握作出肯定或否定的结论。②选用的遗传标记在人群中的杂合度。如果标记的杂合度在人群中很低， 即多数个体为纯合子，则这种标记用处不大。因为如家系中关键成员不能提供致病基因在哪一条染色体上的信息， 常使连锁分析无法进行，因此需选用人群中杂合度高的标记。③在连锁分析时，有时只分析一个多态位点还不能 把某一家系中带有致病基因的染色体与正常染色体区分开来。这通常是由于关键成员如待诊者的父母是纯合子， 不能提供必要的信息，这时可同时分析更多的多态位点，即作单倍型（haplotype）分析。单倍型是指一条染色 体上两个或两个以上多态位点的状态的组合。两条染色体多个位点上都纯合的概率毕竟是很小的，因此单倍型有 助于区分两条常染色体，并追踪致病基因的分离情况。
一、基因探针基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因， 也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。
基因诊断1．探针的来源 DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针 （genomic probe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNa探针（cDNa probe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。此外，还可在体外人工合成碱基数不多的与基 因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。2．探针的制备进行分子突变需要大量的探针拷贝，后者一般是通过 分子克隆（molecular cloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。
分子生物学12-2基因诊断
3′
（五）基因扩增 限制酶酶切待测基因的DNA或CDNA片段作为探 针（位臵改变）法光密度扫描（定量）。 基因扩增→拷贝数增加（分子量）→电泳行为改变→杂交条带 位臵改变→与标准/正常对照定性/量扫描。
（六）多态性分析 1、RFLP （１）基本方法：①PCR产物酶切产物电泳分析。②基因连锁分 析（PCR/RFLP连锁分析法）。 人群个体核苷酸序列的差异性、称为DNA的多态性。由此影响 限制酶切部位点而致RFLP（限制性片段长度多态性）。RFLP按照 孟德尔方式遗传。故： ①可检测人群中个体间存在的RFLP（限制酶酶谱分析） ②遗传病的基因诊断（连锁分析）。如果一特定家庭（系）中，某 一致病基因与特异性的多态性片段紧密连锁（连锁—是指同一条染 色体上相邻近的基因一起被被遗传），就可以用这种多态性片段作 为“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿基因组中是否携带有致病 基因。对于某一限制酶来说：酶切位点在人群中存在共性（可能一 样对核酶谱来说存在多态性（不一样）。 （２） DNA多态性位点普遍存在整个人类基因组，估计每100 个核苷酸便有一个发生突变，出现多态性。如果建立起一套以20CM 间隔平均分布于整个基因的RFLP位点，选用合适的探针，理论上可 以对所有的遗传病进行基因诊断。
（3）关于基因连锁分析 ①多数遗传病诊断途径， 因为：经基因突变检测途径，适用病种有限，原因是： a、致病的基因可在任何位点上产生突变，致使同一疾病有不同的突变类型。 b、不少致病基因仅仅知道在哪一号染色体位臵，尚未克隆出来，对其结构和 分子机制毫无能知。 c、有的致病基因尚未确定。 ②基因连锁分析必须具备的先决条件： a、家系中的关键成员（父母）为RFLP的杂合子，才能区分两条同源染色体。 连锁遗传病只要母亲为某一RFLP的杂合子即可。 b、子代存在患病的纯合子，这样才能确定致病基因与哪条染色体RFLP共同 遗传。 c、任何一种遗传病、单独使用一种RFLP、均有相当一部分父母染色体无法 区分、所以要联用若干种RFLP及相当探针，提交诊断。 d、待检亲代必须为生物学意义亲代。
分子生物学12基因诊断
4.原位杂交 可查明染色体中特定基因的位臵，用于染色体疾病的诊 断；原为杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位臵情况，因此可 检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检 出基因和基因产物的亚细胞定位。
(二）聚合酶链式反应（PCR） PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用 中，PCR常与其它技术如分子杂交，限制酶酶谱分析， 单链构象多态性检测，限制性片段长度多态性分析， DNA序列测定等联合应用。 （三）单链构象多态性 单链构象多态性（single strand conformation
（四）敏感性
探针可用“放标”或“非放 诊断灵敏度高，标本只需 微量，DNApg水平即可。 因为表型改变往往出现较晚， 难以早期诊断 在表型改变之前，基因 结构或表达已发生改变， 故往往可以早期诊断。
（五）早期诊断
（六）基因诊断范围广 因为：①探针可为任何来源和种类，序列可为已知或未知， 目标可为特定基因或 特定基因组合，外源性或内源性基因，所 以适应性强，诊断范围广。 ②被检查基因是否处于活化状态并不重要，故可对分化阶 段表达特异性基因及其异常进行检测和诊断，这对肿瘤（如 CML）疗效及预后尤为重要。 ③在感染性疾病的诊断，能检查正在生长或潜伏病原体， 能明确既往感染或现行感染，对不易诊断（如产毒性E.coli）和 不能安全培养（如立克次体）进行基因诊断，扩大了实验室诊 断范围。
polymorphism,sscp）检测是一种基于单链DNA构象差 别来检测点突变的方法，常与PCR联合应用，称为 PCR—SSCP技术。
（四）限制酶酶谱分析 基因突变可能导致基因上某一限制酶位点的丢失
或其相对位臵发生改变，以此酶消化待测DNA和野生 型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量 上的差异就可判断待测DNA的突变情况。 （五）DNA序列测定
遗传病的基因诊断
反向印迹杂交
之前所述PCR-ASO技术虽然灵敏准确，但是效率低 将多种ASO探针点在尼龙膜上，分别与每个样品杂交，即为反 向印迹杂交。
1.未酶解片段
2.βA / βA
3. βA / βT
4. βT / βT
54、114、72bp片段低于200bp太小，不易被观察
PCR-ASO分析
当基因的突变情况完全明了时，可以合成等位基因特异的 寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide,ASO）， 长度通常为20bp左右。一种探针与正常基因杂交，另一种 探针与突变基因杂交。 经PCR扩增后，将合成的各种突变和正常的寡核苷酸探针成 对点在尼龙膜上，分别与标记的ASO探针进行杂交，放射自 显影分析。 若两个等位基因均含有相应点突变时，则仅与突变探针杂 交；若均不含突变，则仅与正常探针杂交；一个等位基因 带有该突变而另一个等位基因正常时，则与两探针均可杂 交。据此作出诊断
β珠蛋白基因全长2053bp，含2个内含子（IVS －I和IVS-II），3个外显子。
PCR-RFLP
Β珠蛋白基因第17位碱基βA →T突变,产生一个新的 MaeI酶切位点（GAAG → C↓TAG）
-140~473nt的613bpDNA片段
正常 455bp片段 突变后 72bp和373bp
PCR-RFLP
遗传病：
由于遗传物质的改变（包括染色体 畸变和基因突变）而导致的疾病。
•单基因遗传病
•多基因遗传病
•染色体数目或结构改变所致的疾病
异常血红蛋白病：镰状细胞贫血病
血红蛋白病
α-珠蛋白生成障碍性贫血 地中海贫血 β-珠蛋白生成障碍性贫血
血红蛋白
每一条肽链和一个血红素连接，构成一个血红 蛋白单体。人类血红蛋白是由二对（4条）血 红蛋白单体聚合而成的四聚体。不同类型的血 红蛋白珠蛋白结构略有不同，但血红素均相同。
遗传病的基因诊断
例： 引物1：5’-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3’ 引物2：5’-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3’
扩增产物294bp
MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)
引物1
103bp 引物1
CCT GAG GAG
191bp 294bp
CCT GTG GAG
引物2
引物2
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Southern blot
是最经典的基因分析方法，不但能检出特 异的DNA片段，而且能进行定量和测定分子 量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突 变分析等。
Northern杂交
用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA 或mRNA进行定性和定量分析。
斑点杂交（Dot blot）
可用基因组中特定基因及其表达的定性及定 量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量 少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量， 特异性不高，有一定比例的假阳性。
遗传病的基因诊断
药学2班 辛鑫
一、基因诊断的概念 及常用技术
（一）基本概念
基因诊断—利用分子生物学技术， 从 DNA/RNA水平检测基因的存 在,分析基因的结构变异和表 达状态，从而对疾病作出诊断。
（二）基因诊断常用方法
核酸分子杂交 PCR DNA序列测定 DNA芯片技术
1、核酸杂交
基本原理-------核酸变性和复性理 论
（二）血红蛋白病的分类
异常血红蛋白病：Hb结构发生了变化 导致贫血病
如：镰刀状细胞贫血
地中海贫血：组成Hb的珠蛋白很成降低 或消失，Hb的结构不发生 变化 亦称：珠蛋白合成障碍性贫血
（三）镰状细胞贫血
红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫血。 患者多在成年以前死亡
扩增产物294bp
MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)
引物1
103bp 引物1
CCT GAG GAG
191bp 294bp
CCT GTG GAG
引物2
引物2
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Southern blot
是最经典的基因分析方法，不但能检出特 异的DNA片段，而且能进行定量和测定分子 量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突 变分析等。
Northern杂交
用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA 或mRNA进行定性和定量分析。
斑点杂交（Dot blot）
可用基因组中特定基因及其表达的定性及定 量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量 少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量， 特异性不高，有一定比例的假阳性。
遗传病的基因诊断
药学2班 辛鑫
一、基因诊断的概念 及常用技术
（一）基本概念
基因诊断—利用分子生物学技术， 从 DNA/RNA水平检测基因的存 在,分析基因的结构变异和表 达状态，从而对疾病作出诊断。
（二）基因诊断常用方法
核酸分子杂交 PCR DNA序列测定 DNA芯片技术
1、核酸杂交
基本原理-------核酸变性和复性理 论
（二）血红蛋白病的分类
异常血红蛋白病：Hb结构发生了变化 导致贫血病
如：镰刀状细胞贫血
地中海贫血：组成Hb的珠蛋白很成降低 或消失，Hb的结构不发生 变化 亦称：珠蛋白合成障碍性贫血
（三）镰状细胞贫血
红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫血。 患者多在成年以前死亡
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诊断依据
疾病或个体表型的本质 生物遗传学基本规律 分子生物学技术与方法
基因诊断的特点
• • • • • 高特异性：诊断目标 高灵敏度：分子生物学方法 结果稳定可靠：核酸的化学本质 早期诊断性：分子遗传学规律 应用广泛性：疾病与非疾病检查
基因诊断常用的分子生物学技术
• • • • • • • 核酸分子杂交 聚合酶链反应（PCR） DNA序列测定 生物芯片/DNA芯片 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP） 单核苷酸多态性（SNP）
必要条件：
①被检基因的突变类型与疾病发 病有直接的因果关系 ②被检基因的正常分子结构已被 确定； ③被检基因突变位点固定而且已 知。
直 接 诊 断 ： 检 测 已 知 致 病 基 因
应 用 ： 血 红 蛋 白 冰 为 例
镰状细胞贫血病
血红蛋白病
β-地中海贫血
α-地中海贫血
血红蛋白结构
血红蛋白是由4条 肽链（两个α和 两个β链）组成的。 每条肽链都类似 于肌红蛋白的肽 链，都结合一个 血红素。
β-地中海贫血：
β-地中海贫血 是一种由于 -珠蛋 白基因突变导致肽 链合成减少或缺乏 而产生的单基因遗 传血液病，多由 珠蛋白基因点突变 所致。
β-地中海贫血的分子基础
β珠蛋白生成障碍性贫血-β珠蛋白基因突变：
PCR-RE分析 MaeI CAAG-CTAG
β-地中海贫血反向斑点印迹杂交示意图
多重GAP-PCR检测分析
M 1 2 3 4 5 6 M
M DNA Marker 1. ( / ) 1.8kb 2. ( / - 4.2) 1.8kb; 1.6kb 3. ( / - 3.7) 2.0kb; 1.8kb 4. (- 4.2 / --SEA ) 1.6kb; 1.3kb 5. (- 3.7 / --SEA ) 2.0kb; 1.3kb 6. (/--SEA ) 1.8kb; 1.3kb
景 广 阔芯 的片 基技 因术 诊是 断应 技用 术前
DNA
基因诊断策略
在分子发病机制水平上对 不同疾病的区分 诊断策略各不相同
致病基因检测
基因表达 定量分析
不同的基因诊断策略
表型相关的系 列基因克隆
连锁遗传标志检测
遗传病的基因诊断
• 基因诊断技术途径：
• ①直接分析致病基因分子结构及表 达是否异常的直接诊断途径； • ②利用多态性遗传标志与致病基因 进行连锁分析的间接诊断途径。
镰状细胞贫血：
• 临床表现：除贫血外,还呈现周期性疼痛危象;而各种原因 引起的内脏缺氧使更多的红细胞镰变导致多发性肺、肾、 肝、脑栓塞等严重合并症。
血红蛋白病——镰刀形细胞贫血症
镰状红细胞贫血分子机制
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
镰状细胞贫血限制性酶切图谱
镰状红细胞贫血HBS-β珠蛋白基因突变：
临床β-地中海贫血基因诊断结果判读
654M/71-72M
17M/N
βEM/βEM
41-42M/N
临床报告单－－样式
α-地中海贫血
α地中海贫血的基 因缺陷主要为缺失型， α基因共有四个(父源 和母源各两个)，缺失 一个为静止型，缺失 两个为标准型，缺失 三个为HbH(β4)病， 缺失四个为 HbBarts(γ4)胎儿水肿 (死胎)。
遗传病的基因 诊断
遗传病基因诊断概念提出
• 1978年，华裔美国学者简悦威（Yuet-Wai Kan）首次采 用DNA重组技术成功进行镰状细胞贫血的产前基因诊断， 标因诊断早已进入欧美各国的临床应用，不仅针对 遗传性疾病，而且用于对一些感染性疾病和肿瘤的诊断。
• 基因诊断：
-珠蛋白基因型 PCR产物片段长度
•- 3.7 • • - 4.2 2.0kb 1.8kb 1.6kb
•--SEA
1.3kb
临床报告单－－样式
α-地中海贫血点突变基因检测
QSN CSN WSN
临床意义： 作为 -地中海贫 血三种缺失型的补 充，对怀疑 -地 中海贫血有漏诊的 患者进行 CS、 QS、 WS点突变 的诊断（课同时检 测），确定具体的 基因突变类型
PCR-RE分析 MstII CCTGAGG-CCTGTGG
镰状细胞贫血PCR-ASO检测分析
5’ - CTC CTG AGG AGA AGT CTG C – 3’ 5’ - CTC CTG TGG AGA AGT CTG C – 3’
地中海贫血：
• 临床表现：
• • • • • • • • 小细胞低色素性溶血型贫血(中、重度) 黄疸 肝脾肿大 (脾大明显) 骨髓扩增 发育迟缓 合并感染 Bart’s 水肿胎 (α地贫,宫内或出生后半小时内死亡)
QSM
CSM
WSM
Wild type
CSM
WSM
QSM
用分子生物学的理论和技术，通过直接探查基因的存在状 态或缺陷，从基因结构、定位、复制、转录或翻译水平分析基 因的功能，从而对人体的状态与疾病做出诊断的方法。
• 目标分子：是DNA或RNA。
• 优点：直接与明确。
基因的基本结构
基因诊断的重要依据
DNA或RNA水平变化 遗传物质改变 基因结构变化即突变
核酸分子杂交基本原理： ——核酸变性和复性理论
样品和探针的制备
核酸分子杂交 基本过程
预杂交和杂交
结果的检测与分析
进应 行用 基核 和因酸 分的分 析特子 异杂 识交 别可
因P 诊C 础断 R 技的技 术一术 种是 基基
PCR在基因诊断中的作用
从极少样品即可扩增出肉眼 可见的产物。 放大待诊信号，提高检测 灵敏度
DNA序列测定是 最直接、最准确的 因诊断技术
目的：
直接对致病突变基因的测序分析达 对疾病准确诊断和早期诊断
生物芯片技术：
根据生物分子间特异性相互作用， 将生化分析过程集成于芯片表面，从而实 现对DNA、RNA、多肽、蛋白质等各种生物 成分的高通量快速检测分析。
常见芯片种类：
疾病诊断芯片 个性化用药芯片