植物组织器官培养生产代谢产物
植物组织培养的六大步骤
植物组织培养的六大步骤植物组织培养是指通过体外不断培养植物细胞、组织和器官，以研究其发育过程和生物学特性，也包括人工繁殖植物和生产植物次生代谢产物。
在植物组织培养的过程中，需要进行一系列的步骤，下面将详细介绍植物组织培养的六大步骤。
第一步：选择适宜的材料植物组织培养需要选取适宜的材料作为起始材料，这通常是从植物体中选择健康、无病虫害并具有较高再生能力的组织部分，如茎、叶片、种子等。
同时，还应注意选择具有较高再生能力的植物品种或种质资源，以提高培养成功率。
第二步：消毒处理为了减少外界微生物的污染，必须对选取的材料进行消毒处理。
常用的消毒方法有酒精消毒、双氧水消毒、高温高压消毒等。
消毒后的材料在无菌操作下移到无菌培养室，准备进行下一步的操作。
第三步：组织分离和培养经过消毒处理的材料，可以通过组织分离的方法来获得组织的单个细胞或小块组织。
常用的组织分离方法有切割法、振荡法、酶解法等。
分离得到的组织或细胞可以直接进行培养，也可以在培养基中添加适当的生长调节剂，以促进组织的增殖和分化。
第四步：培养基的选择和配置培养基是植物组织培养中重要的因素之一，它为植物细胞提供养分和生长因子，同时调控其生长和分化。
培养基通常由无机盐、有机物质、糖类、维生素、生长调节剂等组成。
根据需要，培养基可以分为基础培养基和不同类型的专用培养基。
基础培养基通常为MS培养基或白培养基，而专用培养基则针对不同的组织和目的进行调配。
第五步：培养条件的调控和优化在植物组织培养的过程中，培养条件的调控和优化对细胞和组织的生长和分化起着至关重要的作用。
光照、温度、湿度、pH值以及培养物的搅拌等因素都需要合理控制和调节。
此外，根据不同类型的组织和目的，还需要添加适量的生长调节剂、抗生素和其他辅助因子。
第六步：再生植株的分离和繁殖最后一步是将培养的组织或细胞分离出来，得到再生植株。
这需要将培养物转移到含有较稀释生长因子的培养基上，以便干扰物的去除和适度延长培养时间。
植物组织细胞培养技术生产此生代谢产物
植物组织细胞培养技术生产次生代谢产物的应用摘要：植物组织细胞培养是现代生物技术应用最重要的一个方面，它是一个应用广泛和快速发展的技术。
植物组织细胞培养技术已应用于植物次生代谢产物的生产，并取得很大成效。
本文讲述组织细胞培养技术在药物、食品、化妆品等方面的次生代谢产物生产的一些应用，以及总结了现在主要植物组织培养技术、植物组织培养技术在实践中的应用。
关键词：次生代谢产物细胞培养代谢产物植物的次生代谢产生的活性物质成分已被人类广泛应用，主要集中在研究制药(如如抗癌药物紫杉醇、疗伤药物紫草宁、保健药物人参皂甙等)、食品添加剂(如生姜、香子兰等)、调味剂(如胡椒、留兰香等)、食用色素(如花青素等)、油料(如如豆寇油、春黄菊油等)、饮料(如咖啡、可可等)、树胶(如阿拉伯胶等)、化妆品、生物杀虫剂和农用化学品等方面。
尽管有些植物次生代谢物质并不是很多，但它们与人类健康密切相关，已成为当前生物领域研究关注的重点。
因此许多植物代谢产物以组织细胞培养技术的方法开发利用，进行大规模生产，使植物次生代谢物质产量和活性提高。
1 植物组织培养技术在实践中的应用[1]21世纪是生物技术迅速发展的世纪，而植物组织培养技术是生物技术中的重要内容，可以用于：植物育种已被越来越广泛的用于扦插难生根植物、引种材料少的植物。
除常规的用器官进行培养，也可以用花药进行花粉单倍体植株育种，这种方法技术简单，对一些植物种来说易于诱导未成熟花粉的分裂，可以进行大群体研究，可以迅速而大量的产生单倍体，具有迅速纯合、选择效率高、排除杂种优势干扰、突变体筛选、消除致死基因等优点。
用于脱毒和离体快繁获得脱除病毒的材料和用于植物材料快速繁殖这方面是目前植物细胞组织培养应用最多最有效的一方面. 世界上受病毒危害的植物很多，而园艺植物受病毒危害更为严重，当植物被病毒侵染后，常常造成生长迟缓、品质变劣、产量大幅度降低等危害，目前，已经在马铃薯、甘薯、草莓、大蒜、苹果、香蕉等多种作物上大规模应用;离体培养的优点就是快速，而且材料来源单一，遗传背景一致，不受季节和地区的限制，重复性好，所以离体快速繁殖已经广泛应用于果树，中药材等的栽培。
植物的组织培养原理
植物的组织培养原理植物组织培养是一种体外培养植物组织、器官和细胞的技术方法，它可以实现对植物的快速繁殖、遗传改良和次生代谢产物的大规模生产。
植物组织培养的基本原理是利用植物胚胎、幼体、组织或细胞在体外地条件下生存和生长的能力，通过提供适当的培养基和生长条件，促进其不定分裂和分化，从而实现组织或细胞的增殖和发育。
植物组织培养的关键环节包括组织获取、表面消毒、培养基配制、组织定植、培养和生长、再生和壮苗培养等。
首先，需要从植物体中获取所需的组织、器官或细胞。
通常情况下，可以采用幼体、胚胎、种子、茎、叶片等组织作为起始材料。
不同植物材料的获取方法有所不同，常用的方法包括子叶分离法、胚轴分离法、茎尖分离法和愈伤组织分离法等。
接下来，需要进行对组织的表面消毒处理，以杀灭外源性的细菌、真菌和病毒等微生物，以防止其对培养过程的干扰。
一般常用的消毒剂包括酒精、漂白粉和过氧化氢等。
然后，需要配制适宜的培养基。
培养基是模拟植物生长所需的养分、激素和适宜环境的一种营养物质。
它通常包括基础培养基、有机添加剂和生长调节剂等。
基础培养基通常由含有氮、磷和钾等的无机盐和碳源组成，有机添加剂如维生素和氨基酸可以提供植物生长所需的微量元素和有机物质，生长调节剂如植物激素则可以促进分裂、分化和再生等过程。
接下来，将经过消毒处理的组织、器官或细胞定植到已经配制好的培养基上，并提供适宜的光照和温度等生长条件。
通过适当的培养基和生长条件的调控，可以促进组织的增殖和生长。
然后，经过一段时间的培养，组织开始分化和再生。
在组织分化阶段，细胞会发生分化和特化，形成不同类型的组织和器官。
在再生阶段，组织和器官通过形成新的分生组织和器官来实现自我修复和再生。
最后，经过一系列的培养和生长操作，可以得到健康的幼苗。
幼苗的壮苗培养则包括幼苗的营养供应、疾病防治和适宜环境的提供等，以保障幼苗的生长和发育。
总的来说，植物组织培养通过提供适宜的培养基和生长条件，促进植物组织和细胞的增殖、分化和再生，实现对植物的快速繁殖和遗传改良。
【生物技术】第五讲(3)植物代谢产物的生产
2 植物细胞规模化培养体系的建立 2.1 种子细胞的选择
(1)准确选择能产生目的化合物的植物种类; )准确选择能产生目的化合物的植物种类; (2)尽量选择自然状态下产生天然产物的组织器官 ) 为外植体; 为外植体; (3)高产种子细胞克隆的方法:单细胞培养后, (3)高产种子细胞克隆的方法:单细胞培养后,将 高产种子细胞克隆的方法 单细胞扩增形成的愈伤组织分2份 单细胞扩增形成的愈伤组织分 份,1份成分含 份成分含 量分析, 份保留培养. 量分析,另1份保留培养. 份保留培养
长春花碱 治疗白血病 奎宁 致热素 毛地黄 治疗疟疾 杀虫剂 心脏病药
植物细胞大规模培养的技术要求: 植物细胞大规模培养的技术要求:
从工程的角度讲必须要进一步研究和开 发适宜于植物细胞生长和次生代谢产物生产 的生物反应器,建立最佳的控制和调节系统. 的生物反应器,建立最佳的控制和调节系统.
从细胞生长与培养技术方面讲必须满
4 利用细胞培养生产有用物质
4.1 利用细胞培养生产有用物质的一般程序 4.1 (1)选材 应注意以下条件: 应注意以下条件: 药效肯定; ①药效肯定; 对其有效成分有充分的了解; ②对其有效成分有充分的了解; 有测定有效成分和药理的可靠方法; ③有测定有效成分和药理的可靠方法; 市场短缺或价格昂贵; ④市场短缺或价格昂贵; 取有药效成分的部位, ⑤取有药效成分的部位,且该部位较 易形成愈伤组织. 易形成愈伤组织.
筛选出的高效, 高产细胞株系, 筛选出的高效 , 高产细胞株系 , 有 的植物细胞系其高效, 的植物细胞系其高效 , 高产性能稳定 多年, 但有的植物细胞系不稳定, 多年 , 但有的植物细胞系不稳定 , 因 此 , 还需要定期检测 , 更新细胞株系 . 还需要定期检测, 更新细胞株系.
植物组织培养在现代农业中的具体应用
三、植物新品种培育
3、细胞融合 通过原生质的融合可部分客服有性杂交不亲和，从而获得体细
胞杂种，创造新物种或优良品种。
三、植物新品种培育
4、选择细胞突变体 离体培养过程中会发生变异，从中可以筛选出对人们有用的突
变体，进而育成新品种。
四、生产植物次生代谢物
利用植物组培技术生产一些价格高、产量低、需求量大的次 生代谢产物，其具有一些特定的功能，对人类有重要的影响和作用。
五、植物种质资源离体保存
1、常规的植物种植资源保存方法耗资巨大，种 质资源流失的情况时有发生。
2、通过抑制生长或超低温贮存的方法离体保存 植物种质资源，可节约大量的人力、物力和财 力，还可挽救那些濒危物种。
3、离体保存还可避免病虫害侵染和外界不利气 候及栽培因素的影响，可长期保存，有利于种 质资源材料的远距离交换。
江西野生金线莲
六、人工种子
1、人工种子是利用人工种皮包被植物组织培养中得到的体细胞胚。 2、人工种子可为某些珍稀物种的繁殖、转基因植物、自交不亲和植物、远缘 杂种的繁殖提供有效的手段。
任务二 植物组织培养在农业 生产中应用
目录
01
植物离体快速繁殖
02
植物种苗脱毒
03
植物新品种培育
04
植物次生代谢物生产
05
Hale Waihona Puke 植物种植资源保存06人工种子
一、植物离体快速繁殖
1、植物快繁是植物组织培养在生 产中应用最广泛，产生较大经济效 益的一项技术。
2、植物快繁具有不受季节和气候 等条件限制、可周年生产、生长周 期短、繁殖速度快、种苗整齐一致 等优点。
4、植物组培种苗脱毒广泛应用于花卉、果树、 蔬菜、苗木等植物。
植物组织器官培养生产代谢产物
植物组织器官培养生产代谢产物
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在通常状态下, Ri质粒上Vir区基因处于抑制 状态, 当发根农杆菌感染寄主植物时, 受损伤 植物细胞合成低分子苯酚化合物乙酰丁香 酮使Vir区处于抑制状态基因被激活, 产生一 系列限制性核酸内切酶, 在酶切割作用下产 生T-DNA链, T-DNA进入植物细胞核内, 整合进 植物细胞基因组。其整合和表示结果造成 了大量毛状根产生。
植物组织器官培养生产代谢产物
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冠瘿组织形成
与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）上 Ti质粒相关。Ti质粒上也有一段特殊T-DNA, 编码细胞分裂素合成酶基因ipt(trnsr)以及生长 素合成酶基因 iaaM(trns1)、iaaH(trns2)。
植物组织器官培养生产代谢产物
植物组织器官培养生产代谢产物
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三 毛状根培养生产药用次级代谢产物 讨论分析
植物组织器官培养生产代谢产物
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1.长春花碱毛状根培养制备
长春花（Catharanthus roseus (L.) Don）: 夹竹桃科长春花属。
长春花姿态优美, 花期长, 适合布置花坛、花 境, 也可作盆栽观赏。还是一个防治癌症药 源植物。长春花中含55种生物碱。其中长春碱 和长春新碱对治疗绒癌等恶性神瘤、淋巴肉瘤 及儿童急性白血病等都有一定疗效（长春新碱 抗癌比长春碱高强）。
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植物组织器官培养生产代谢产物
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植物组织器官培养生产代谢产物
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2.雪莲花毛状根培养制备黄酮
植物细胞培养技术和次级代谢产物的生产
植物细胞培养技术和次级代谢产物的生产一、实验目的与要求1、掌握植物组织培养基的配置、快速繁殖技术、植物脱毒技术；2、掌握悬浮培养技术的原理、培养方法及应用；3、了解利用细胞培养生产有用物质的一般程序及技术因素；4、设计以植物细胞次级代谢产物作为目标代谢产物的分离纯化。
二、实验原理植物细胞培养是将离体的植物器官、组织或细胞，置于液体培养基中进行震荡培养，在培养了一段时间后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。
根据培养对象，植物细胞培养主要有单细胞培养，单倍体培养，原生质体培养等。
按照培养系统可分为悬浮培养、液体培养、固体培养、固定化培养等。
由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。
脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。
再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。
依据的原理是植物细胞的全能性。
植物组织在培养生长的过程中，随着新城代谢的进行，长生很多种初级代谢产物和次级代谢产物。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料从菜市场购买的新鲜的大白菜。
2．仪器（1）锥形瓶（2）量筒（3）移液管（4）小刀（5）烧杯（6）高压灭菌锅（7）摇床等。
3．试剂（1）70%-75%酒精（2）无菌水（3）2-5%次氯酸钠4.MS培养基四、实验步骤1. 外植体的选择和准备我们这次试验所用的植物是大白菜，我组选用了大白菜的劲。
将新鲜的白菜劲用小刀切成长1厘米、宽0.5厘米左右的小块，叶片切割成0.5×1.0cm。
2. 外植体的灭菌消毒原则是既彻底消灭外植体表面的微生物，又要保持外植体的正常活力。
消毒方法：首先70-75%酒精，30秒，表面杀菌→无菌水洗2-3次→2-5%次氯酸钠10-15分→无菌水洗3-5次，待用。
2. 培养基的配制和灭菌将配置好的各种溶液，按比例混合，取150毫升装入500毫升的锥形瓶里，用八成纱布将瓶口封好。
细胞工程资料复习
生物工程复习第一讲一、模块：动植物人工繁殖技术、新品种培育技术、生物制品技术、干细胞与组织工程。
二、细胞工程（Cell engineering）是指主要以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。
三、研究对象：动植物细胞（原生质体），也包括细胞器、染色体、细胞核、胚胎。
四、细胞工程研究内容：a)动植物快速繁殖：植物组织培养、人工种子、试管动物、克隆动物等。
b)细胞重组与新品种培育：细胞水平上的原生质体诱变、细胞融合技术；细胞器水平上的细胞重组；染色体水平上的多倍体、单倍体育种等。
c)细胞工程生物制品：：以杂交瘤细胞培养大量制备单克隆抗体、动物细胞培养生产疫苗、转基因动植物生物反应器等。
d)细胞疗法与组织修复：利用培养的细胞或者离体再造的组织修复受损细胞、组织或器官的技术，属于细胞工程最新发展领域之一。
植物人工繁殖一、1.植物组织培养的理论基础是什么？a)细胞全能性。
二、2.植物经组织培养的再生途径有哪两种？a)器官发生途径：成熟细胞→愈伤组织→出根出芽→完整植株。
b)体细胞胚发生途径：成熟细胞→分生细胞→胚状体→完整植株。
c)概念：•体细胞胚（Somatic embryo）又叫胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。
体细胞胚发生途径：是指体细胞在离体培养过程中经过了胚胎发育过程。
体细胞胚起源于非合子细胞，因此不同于合子胚。
三、3.激素在细胞分化中是如何调节器官分化？a)生长素主要用来刺激细胞分裂和诱导根的分化。
b)分裂素的生理作用主要是诱导芽的分化促进侧芽萌发生长、促进细胞分裂与扩大。
多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。
c)四、1。
细胞全能性、细胞分化与脱分化a)细胞全能性(totipotency)：是指分化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息，具有发育成完整个体的潜能。
植物组织培养技术及其在生产中的应用
植物组织培养技术及其在生产中的应用植物组织培养技术是指利用植物体内的一些生物学特性，在不同培养基作用下，实现植物组织的再生、分化、增殖等过程，从而获得与母体相同或不同的植株或植株部分。
植物组织培养技术是植物学研究中一个比较重要的分支，具有多种应用价值，可广泛应用于植物生产、环境修复、药用植物等领域。
本文将介绍植物组织培养技术及其在生产中的应用。
一、植物组织培养技术的分类按照植物组织来源的不同，植物组织培养技术可以分为离体培养和原位培养两大类。
离体培养是指将植物体内某些片段或细胞分离出来，放入含适量营养物质的培养基中，通过不同的激素和营养盐的应用，诱导这些细胞分化、增殖等，最终得到与母体细胞相同或不同的植株或植株部分。
原位培养是指将特定植物组织放置在特定培养基上，并间歇进行刺激，促进细胞的再生和修复。
二、植物组织培养技术在生产中的应用1.植物繁殖和育种植物组织培养技术可以用于植物繁殖和育种。
在离体培养过程中，组织培养技术可以通过不同的组合培养基和适当的生长调节剂来诱导植物组织快速分化，从而实现大规模繁殖。
同时，植物组织培养技术也可以用于育种过程中的胚性诱导和突变筛选。
2.植物次生代谢产物的生产很多药用植物的生产过程依赖于某些特定的生物活性成分。
通过植物组织培养技术，可以控制植物能量代谢和次生代谢产物的合成，实现高产、高品质药材的生产。
3.植物病毒检测植物病毒对植物生长和繁殖产生极大影响，会直接导致植物的死亡或减产。
利用植物组织培养技术，可以大量培育无病毒植株，用于保障植物生产的健康和稳定。
4.水生植物生产水生植物在水体中生长和繁殖，为水产养殖产业提供各种服务。
通过组织培养技术，可以将水生植物离体培养后再长到水体中，从而实现大规模水产强化生草。
5.环境修复植物生长对环境具有改善作用。
通过植物组织培养技术，可以获得不同类型的植物体细胞和组织，从而用于植物生态修复，修复各种污染的环境。
三、植物组织培养技术的创新目前，植物组织培养技术的应用已经非常广泛，但一些新兴领域和技术仍需要不断发展。
植物细胞培养生产次级代谢产物的影响因素与对策
植物细胞培养生产次级代谢产物的影响因素与对策植物细胞培养技术是将植物体的某一部分经过无菌处理，置于人工培养基上使其细胞增殖，进而按需要进行培养的技术。
利用植物细胞培养技术生产有用代谢产物，已成为继微生物技术以后当代生物技术重要的发展领域。
据不完全统计，我国已对400多种植物建立了组织和细胞培养体系，并从中分离出600多种代谢产物。
1外植体的影响同一植株不同部位的组织进行培养时，其产物或产物积累量不同。
银杏叶来源的愈伤组织黄酮含量为1.5%，茎段来源的愈伤组织为1.0%，而子叶来源的愈伤组织仅为0.3%。
Mischenko等[3]在茜草愈伤组织培养过程中发现，来源于叶柄和茎的愈伤组织蒽醌累积量比来源于茎尖和叶的愈伤组织高。
徐咏梅等对杜仲乔林与叶林2种栽培模式下树皮中次生代谢物的含量差异研究发现，乔林树皮中杜仲醇、总黄酮和杜仲胶的含量均比叶林树皮中的高，而叶林树皮中绿原酸、京尼平甙酸和桃叶珊瑚甙比乔林树皮中的高。
因此，利用植物细胞培养生产次生代谢物时，选择能诱导出疏松易碎、生长快速且具有较高次生代谢物合成能力的愈伤组织的外植体非常重要。
2培养基的影响2.1培养基种类在细胞培养中，愈伤组织生长和次生代谢物产生的最佳培养基一般是不一致的。
钟青平等研究不同培养条件下的栀子愈伤组织生长和栀子黄色素的产生时发现，B5、MG-5基本培养基有利于愈伤组织生长；M-9基本培养基有利于黄色素合成。
甘烦远等认为MC培养基对红花愈伤组织生长和生育酚的形成最有效。
因此在组织培养时可以采用二步培养法，根据生长及代谢的需要，调整基本培养基。
2.2培养基组分2.2.1碳源不同的培养细胞适合生长和次生代谢物积累的碳源种类不同。
郑穗平等，在研究玫瑰茄细胞生长和花青素生成时发现，蔗糖作为碳源，细胞的生长量高，葡萄糖作为碳源，细胞花青素的含量高。
赵德修等研究发现，5%蔗糖+1%葡萄糖组合对雪莲愈伤组织生长不仅有利，而且细胞中总黄酮的含量也最高。
植物组织培养技术的主要类型与应用范围
植物组织培养技术的主要类型与应用范围植物组织培养技术是一种通过体外培养植物细胞、组织和器官的方法，以实现植物无性繁殖、基因转化、品种改良等目的。
该技术已经被广泛应用于植物科研、种质资源保护与利用、植物病害防治和植物繁殖等领域。
本文将介绍植物组织培养技术的主要类型与应用范围。
一、植物组织培养技术的主要类型1. 植物离体培养植物离体培养是指将植物组织或器官从体内分离出来，放置在富含营养物质的培养基中进行培养。
这种技术可以用于植物无性繁殖、基因转化、种质资源保存和研究等方面。
根据培养的组织类型不同，植物离体培养可分为愈伤组织培养、胚性组织培养、根尖培养等。
2. 植物悬浮细胞培养植物悬浮细胞培养是指将植物组织中的一部分细胞分离出来，通过悬浮培养技术使其在液体培养基中保持悬浮状态进行培养。
这种技术主要用于生产植物次生代谢产物、基因转化等方面。
3. 植物器官培养植物器官培养是指将植物体中的器官（如茎、叶、种子等）分离出来进行培养。
通过植物器官培养技术，可以快速繁殖优良品种、实现植物基因转化、筛选抗病性植株等。
二、植物组织培养技术的应用范围1. 植物无性繁殖植物无性繁殖是指通过植物组织培养技术，将植物组织或器官培养后产生新的植株。
这种方法可以实现高效繁殖植物种质资源，解决传统繁殖方式低效率的问题。
2. 品种改良植物组织培养技术可以用于品种改良。
通过离体培养技术，可以进行基因转化，导入抗病、抗逆性等优良基因，从而提高植物的品质和抗性。
3. 植物次生代谢产物的生产植物组织培养技术可以用于大规模生产植物次生代谢产物。
通过悬浮细胞培养技术，可以实现大量的细胞生产，从而获得丰富的植物次生代谢产物。
4. 种子无菌化和种子贮藏植物组织培养技术可以实现植物种子的无菌化和长期保存。
通过种子胚性培养技术，可以去除种子内的微生物，保证种子的无菌性。
同时，也可以通过离体胚培养技术，将种子胚胎保存在液体培养基中，延长种子的储藏寿命。
5. 植物病害防治植物组织培养技术可以用于植物病害的防治。
高中生物精品资源第四章 植物细胞培养与次生代谢产物的生产课件高中生物竞赛
的速度蓬勃发展。
药用植物及其制成保健食品、化妆品等每年进,药用植物细胞大量培养技术正成为 国际上名贵珍稀天然药物开发的新目标,目前已经从400多种植物建立了组 织和细胞培养体系,从中分离出600多种代谢产物,其中40多种化合物在数量 上超过或等于原植物
玫瑰鲜花在清晨摘下后24小时内即取出黄褐色的玫瑰精油，大约五吨 重的花朵只能提炼出两磅的玫瑰油，所以是全世界最贵的精油之一
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悬浮培养基本分为：分批式、流加式、连续式、半连续式培养
1)分批培养(batch culture) 是指在培养过程中，既不向系统中补加培养基， 也不从系统中排出培养物（包括培养基和细胞），也就是说一次性加入培养 基，在一定条件下培养一段时间后，一次性收获。
国内外细胞培养的研究进展
1）重点放在细胞培养上（过去） 细胞培养的优点是生物量生长快，但也有次生代谢产物的含量不稳定
和不易与大田栽培接轨等明显的缺点。
2）植物组织和器官培养具有更重要的意义。
初级代谢物、次生代谢物对细胞、植物的意义 植物合成次生代谢产物的目的是其自身生理代谢的需要，在细胞阶段，往往不 需要合成，但到了组织和器官阶段，合成的需要就会加强。因此，培养药用植 物的组织和器官，更容易获得次生代谢产物。
第四章 植物组织培养生产次生代谢产物
一、植物组织培养生产次生代谢物质的目的意义 二、植物细胞培养生产次生代谢产物
植物组织培养
绪论植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。
外植体：愈伤组织：一、植物组织的主要特征：（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
三．植物组培的应用1.植物离体快繁。
2.无病毒苗木培养。
3.培育新品种或创制新物种。
4.次生代谢物生产。
5.植物种质资源的离体保存。
6.人工种子。
第一章1.）实验室包括：准备室，无菌操作室，培养室，温室。
2.）器具的灭菌：1、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。
（1）干热灭菌：铝箔包好后，放于恒温干燥箱内，150 ℃保温2小时，成本较高。
（2）高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌锅内120 ℃15－20分钟。
（3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95％乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。
2、培养基灭菌：采用高压蒸汽灭菌。
植物细胞培养及次生产物代谢生产
细胞固定化培养技术按照其支持物不 同可以分为两大类：
包埋式固定化培养系统：支持物多采 用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等 ；
附着式固定化培养系统：支持物采用 尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。
（四）、利用细胞培养生产有用物质
第四章
植物细胞培养及次生产物代谢生产
一、悬浮培养
二、单细胞培养 三、植物细胞的规模化培养及有
用物质生产
一、悬浮培养（cell suspension culture）
悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个 游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖 的技术。
1、愈伤组织诱导
要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外 观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状， 松散易碎。
Circulation through an external loop
旋转式培养系统 一般用于产品中试或某些必需裂解细
胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制 精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。
②固定化培养系统
这一技术的优点在于： 可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研
究特定的代谢途径，并便于调节； 细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所
平板培养中细胞密度和培养基成分是培养成功的关键，而细胞密度 和培养基成分互相依赖（负相关）。
2、看护培养
看护培养（nurse culture）：是由Muir1954年设计的。
操作方法： 在固体培养基上置入一块 活跃生长的愈组织，再在愈 伤组织上放一小片滤纸，待 滤纸湿润后将细胞接种于滤 纸上。当培养细胞长出微小 细胞团以后，将其直接转至 琼脂培养基上让其 迅速生长
第五章植物细胞培养及次级代谢产物制备
细胞的同步化培养
细胞工程
细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同 时通过细胞周期的某一特定时期。
同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、 代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化，所以人们一直 希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能 保持相对一致的细胞学和生理学状态。
细胞工程
①体积选择法：用大、小孔径筛网过滤、收集单细胞。 ②冷/低温处理法：4℃低温下处理几天使细胞同步化 后，再添加新的培养液培养。 ③饥饿法：控制营养液浓度，通过饥饿使细胞达到同 步化，再添加营养液培养。 ④抑制法：使用抑制剂如尿苷、5-氟脱氧尿苷、秋水 仙素等使细胞达到同步化。
核。 • 细菌只有核糖体一种细胞器。 • 植物细胞比微生物细胞大。 • 生命活动与细胞分裂
细胞工程
第二节 植物细胞培养技术
1、植物细胞培养基
无机盐（大量、微量） 碳源（蔗糖） 有机氮源（水解酪蛋白） 有机酸、维生素 植物生长激素等
细胞工程
植物单细胞分离与小规模培养
（1）单细胞分离
细胞生长各个时期的特点： 滞后期（延迟期）: 细胞很少分裂，其长短与接种量、大小和 继代时原种细胞所处的生长期有关； 对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变 直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期 缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多， 氧气减少； 静止/平台期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚 至开始死亡。 衰亡期：细胞死亡速度加快，细胞开始快速自溶，死亡。
长期以来，植物一直是许多化学品的主要资源，特 别在制药和食品加工业中更是不可缺少； 据不完全统计，至少有20%左右的药物是由植物衍 生而来，而且每年都有发现许多植物来源的新化合物。
《植物生物技术导论》
《植物生物技术导论》自学指导中国农业大学继续教育学院内容体系本课程内容主要涵盖植物细胞组织培养技术、植物分子标记技术以及植物基因克隆技术等核心知识。
重点介绍植物组织器官培养；茎尖分生组织培养；细胞培养；体细胞杂交；种质保存的方法、原理及应用；植物遗传转化的方法、原理及应用；植物分子标记技术以及植物基因克隆技术。
内容要点课程共分十个章节讲述，每章内容及要求如下：绪论讲授植物生物技术的一般概念、发展简史及在农业中的作用。
要求掌握基本概念。
第一章植物细胞组织培养的基本技术主要内容包括基本设备，培养基的主要成分及制备，外植体的种类、消毒及培养，培养条件，继代培养。
要求掌握培养基的制备，外植体的选择、消毒与培养及适宜培养条件的选择。
第二章植物组织器官培养主要内容包括植物组织培养的关键环节、植物组织和器官培养的影响因素和人工种子的制备。
重点讲授器官分化及体细胞胚胎发生的影响因素及实验方法和人工种子制备的具体方法。
要求掌握植物组织培养的关键环节、植物组织和器官培养的影响因素及人工种子的制备。
第三章花药、花粉培养主要内容包括花药培养和花粉培养基本概念、培养方法和培养意义。
要求掌握花药、花粉的培养方法。
第四章细胞培养主要内容包括植物细胞培养方法及植物细胞培养的应用。
要求掌握细胞培养的方法。
第五章原生质体的分离、培养和体细胞杂交主要内容包括原生质体的分离、培养技术及体细胞杂交方法。
要求掌握原生质体分离机体细胞杂交方法。
第六章植物遗传转化主要内容包括植物基因工程的基本原理，农杆菌介导法、基因枪法、电击法等常用的几种遗传转化方法。
要求掌握农杆菌介导法、基因枪法转化的基本原理及方法。
第七章种质离体保存主要内容包括种质离体保存的意义、原理及方法。
要求掌握冷冻保存、低温保存的方法及原理。
第八章植物基因克隆主要内容包括植物基因克隆的方法。
要求掌握常用的克隆基因的方法及步骤。
第九章DNA分子标记主要内容包括DNA分子标记的概念及分子标记的种类。
第8章 植物细胞培养及次生代谢物质生产
植物细胞培养过程中的氧传递
氧对植物细胞的生长来说是很重要的，但是CO2的含量水平对 细胞的生长同样相当重要。研究发现，植物细胞能非光合地固 定一定浓度的 CO2 ，如在空气中混以 2%-4%的 CO2能够消除 高通气速率对长春花细胞生长和次级代谢物产率的影响。因此， 对植物细胞培养来说，在要求培养液充分混合的同时， CO2 和氧气的浓度只有达到某一平衡时，才会很好地生长，所以植 物细胞培养有时间需要通入一定量的CO2等气体。四、植物单细胞培养方法植物细胞培养的特性有：
1植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁．细胞 耐拉不耐扭，抵抗剪切力差； 2培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素 ； 3细胞生长的中期及对数期．易凝聚为直径达350JJm一400 Pm的团块，悬浮培养较难； 4培养时需供氧，培养液粘度大，能耐受湿力通风搅拌： 5具有群体效应、无锚地依赖性及接触抑制性；
8.1 植物的单细胞培养
一、外植体的选择 （一）用于直接分离细胞的外植体的选择 • 选择细胞之间粘结程度较少的植物组织、器官。 • 叶片组织是直接分离单细胞的最好材料。 • 1965年Ball首次从花生成熟叶片中分离了离体细胞。
二、外植体的预处理
（一）消毒处理 （二）外植体的其它处理 1、预培养 • 可以减轻醌类物质等其他有害物质对培养物的毒害作用。 • 天刺黑莓茎尖培养，接种后1-2后转入新培养基，褐变现象基 本不发生。 • 正常培养几种生长的草莓试管苗幼叶，酶解仅能产生少量原生 质体，如果在分离前将试管苗转入降低了蔗糖浓度的培养基中 预培养2～3周，则原生质产量和活力均大大提高。
平板培养法：
将含有游离细胞和细胞团的悬浮培养物过滤，除去组织块和大的 细胞团，保留游离细胞和小细胞团。将液体培养基加入0.6%~1% 的琼脂，使其融化，冷却到35℃时，将培养基与上述细胞悬浮培 养液等量混合，迅速注入并使之铺展在培养皿（约1mm厚）。在 35 ℃温度下，培养基能保持液体状态，也不会杀死细胞。用封 口膜封严培养皿，置于25°C黑暗中培养。该方法培养细胞可以 定期镜检观察细胞的生长。
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分裂形成愈伤组织，在无激素培养基上可产生毛 状根。
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3.毛状根培养优点
由Ri质粒转化的毛状根生长快、激素自养型、生 长周期短，在培养时不需要添加外源激素，易于 培养。
细胞分化程度的提高与次生代谢产物含量
有一定的相关性。例如：
许多植物次生代谢产物的合成与叶绿体的
分化有关。 可编辑版
3
2.细胞聚集和组织水平上的分化
在聚集的细胞团块中，位于表面和中央的 细胞处于不同的分化状态，从而常表现出 与游离细胞不同的次生代谢能力。 例如：小果咖啡培养物中嘌呤环生物碱的 合成取决于细胞团块的大小。因此，固定 化培养利于提高可编辑生版 产次生代谢产物含量4 。
3.器官水平上的分化
有些植物的某种次生代谢产物在某个器官中含量 较高，在悬浮培养细胞中含量较低或没有。
例如：柴胡根中含有效成分柴胡皂苷，其愈伤组 织一般不能合成这类化合物。
有些植物的培养物在合成次级代谢产物时要求有 芽的形成。
例如：长春花的脱分化培养细胞中很难获得具有
抗癌活性的长春花碱，而在培养的长春花簇芽中
一些植物的次级代谢产物在根里大量合成 ，但是正常根的培养非常困难，生长缓慢 ，收获困难。
毛状根(hairy roots)是发根农杆菌（ Agrobacterium rhizogenes）感染双子叶 植物后，形成的类似头发一样的根组织。
许多植物的毛状根在离体培养条件下表现
出次生代谢产物的合成能力，产物产量较
能测定出长春花碱。
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大多数植物次级代谢产物与细胞分化有关。
离体培养的植物细胞存在不稳定、目标产物含量 低、需要激素等不足。
因此，分化程度较高、遗传更稳定的植物组织器 官培养在有价值次级代谢产物生产上展现了应用 潜力。
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二 植物组织器官培养 生产次级代谢产物
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（一）毛状根培养生产次级代谢产物
源于新疆雪莲根段外植体的毛状根系。其20d的
生长速率可达到鲜重接种量的24倍。其中黄酮含
量是野生雪莲根的8.6倍，是野生雪莲叶片的2.9
倍。
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生物碱类(alkaloids)：孙敏等以长春花
(Catharanthus roseus)无菌苗叶片为外植体诱导 毛状根，其中长春碱含量是原植物根和叶中含量 的27.4倍和23.5倍。长春新碱的含量是原植物根 是23.5倍。
继代培养，转化的植物细胞产生愈伤组织，并可
产生毛状根。
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（2）茎杆接种法
无菌植株生长到一定时候，将植株的茎尖、叶片 切去，剩下茎杆和根部，在茎杆上划出伤口，将 带Ri质粒的发根农杆菌接种在伤口处和茎的顶部 切口处，经过一段时间培养，在接种部位产生毛 状根。
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（3）原生质体—农杆菌共培养法
第8讲 植物组织器官培养 制备代谢产物
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一 本节主要内容 毛状根培养制备次级代谢产物
二 本节关键问题 1.毛状根的诱导机制与方法、应用 2.毛状根培养制备次级代谢产物的影响因素
3.植物组织器官、细胞培养制备次级代谢产物的 各自优缺点
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一 分化与次级代谢产物关系
1 1.细胞分化与次生代谢产物
inducing)质粒（约250kb的大质粒））,
是位于发根农杆菌染色体之外的独立的
双链环状DNA。具有2个主要的功能区：
T-DNA区(Transferred DNA region，
转移区)和Vir区(Virulanee region，
致病区)。
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在通常状态下，Ri质粒上Vir区的基因处于抑制 状态，当发根农杆菌感染寄主植物时，受损伤 的植物细胞合成的低分子苯酚化合物乙酰丁香 酮使Vir区处于抑制状态的基因被激活，产生一 系列限制性核酸内切酶，在酶的切割作用下产 生T-DNA链，T-DNA进入植物细胞核内，整合进 植物细胞的基因组。其整合和表达的结果导致 了大量毛状根的产生。
T-DNA上有生长素合成基因tms 1和tms 2，指导
IAA(吲哚乙酸)的合成，因此转化产生的毛状根
，在培养时不需要添加外源生长激素，为激素
自养型。
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2.毛状根诱导方法 （1）外植体接种法
取植物的叶片、茎段、叶柄等无菌外植体，与发 根农杆菌共同培养2～3 天，将植物的外植体移到
含有抗生素的选择培养基上进行培养，经过多次
冠瘿组织（Crown gall tissue）是由根癌农杆菌
蒽醌类(anthraquinones):对何首乌(Polygonium multiflorum Thunb)的研究表明：以再生植株的 叶柄、茎段和叶片为外植体可诱导毛状根，毛状 根中大黄酸的含量为2.49μg/L(干重)。是无菌幼 苗的2.85倍。
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皂苷类(saponins)：对人参的研究表明：以无菌 苗带叶幼茎为外植体诱导的毛状根中人参总皂苷 含量为2.486％(干重)。高于原药材总皂苷含量 1.403％(干重)。
苯丙素类( 类(phenyIpropanoids)：雪莲毛状根中丁 香苷和高车前素的含量分别约是野生植株的40倍 和3倍。
萜类(terpenoids)：对短叶红豆杉的研究表明： 以无菌苗的芽为外植体可诱导出毛状根。毛状根 中紫杉醇的含量为可愈编辑版伤组织的1.3--8 8.0 0倍。17
（二）冠瘿组织培养生产次级代谢产物
正常植物及悬浮培养可细编辑胞版 的要高。
8
1.毛状根产生机制
发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)是一种革兰氏阴性菌，能 侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶 植物及个别的裸子植物，诱发被感染植 物的受伤部位长出毛状根。
发根农杆菌具有致根性，是因为它具有 能诱导毛状根产生的Ri(Root
毛状根分化程度高，产生次级代谢产物能力强， 合成较为稳定，能大量合成某些悬浮培养的细胞 不能或者很少合成的次级代谢产物。
通过T-DNA改造，易于采用基因工程途径提高次级 代谢产物产量。
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Hale Waihona Puke 4.毛状根在药用次生代谢产物中的应用
毛状根应用于药用植物次生代谢产物的生产已有 近30年的历史。
黄酮类(flavonoids)：付春祥等的研究表明。来