实验八、转基因生物的GUS检测资料讲解

染色方法
– 将准备好的试材浸泡在染液，于25—37℃ 保温1小时至过夜。
– 叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2—3 次，至阴性对照材料呈白色。
– 肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色 小点即为Gus表达位点。
实验步骤
• 将准备好的拟南芥植株放入小EP管中，加 入染色液浸没试材，封好盖子；
• 37℃培养箱中温育1小时至过夜； • 将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱
• gus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体
细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。
药品配方
• 1）X－Gluc母液：X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺 (DMF)配成20mM的贮存液，分装成每管100µL，保 存于-20℃。
• 2）X－Gluc基液（50mM PBS， pH7.0）。 • 配制方法：50mM NaH2PO4·0.78g/100ml；50mM
protein)等.
利源自文库报告基因表达载体的研究技术的优点：
• 其一，避开内源和外源基因表达水平的影响：对于报告基 因编码产物的检测水平可以精确地反映基因启动子的转录 活性，不会受到内源性基因表达产物水平的影响.
• 第二，易于检测：如果研究不同基因启动子的转录活性， 采取本身基因表达产物的检测方法，必须建立各种基因表 达产物的检测方法，有些基因的表达产物的检测技术还不 具备，或者很难建立，而采用报告基因的研究策略就很容 易解决这一问题，只要建立稳定的报告基因表达的检测技 术就可以用于不同基因启动子转录活性的检测和研究。
材料： 转化的植物组织、器官、原生质体、 种子的胚及萌发的幼苗等。 非转化的相同材料（阴性对照）。
试剂： 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯 （X－Gluc） ；N-N-二甲基甲酰胺(DMF) ； NaH2PO4； Na2HPO4 ； Na2EDTA ；Triton100； K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）；K4 [Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）
gus基因简介
• gus基因是目前常用的一种报告基因，是β－D－ 葡 萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶
(GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸 ，它可以 将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc） 分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β-D葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。 其检测方法简 单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料 呈白色为止。
• 观察结果。
实验八、转基因生物的GUS检测
实验目的：通过GUS(β- 葡萄糖苷酸酶)活性测定， 了解报告基因在基因工程中的应用。
要求：了解通过显色反应检验外源基因的表达情况 的方法，了解报告基因的概念。
技术应用：1. Gus基因与目的基因连接构建融合基 因进行组织定位； 2. gus基因与启动子连接来研究启动子的表达的组织 特异性。
检测。
常见的报告基因：
• 在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有 以下几种：
常用的报告基因包括β—葡萄糖苷酸酶报告基因
(gus), 胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基 因(ocs)、新霉素磷酸转移酶(NPTll)、氯霉素乙酰 转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶(β-gal，βgalactosidase)、萤光素酶(luc，luciferase)、和 绿色荧光蛋白基因(gfp，green fluorescence
原理
•
适宜的反应条件下，β- 葡萄糖苷酸酶
（GUS）可将X－Gluc水解成蓝色物质，因
此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或
蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。
相关知识链接——标记基因
•
标记基因是帮助对转基因生物体进行
筛选和鉴定的一类外源基因，包括选择标
记基因和报告基因。
• 常用的选择标记基因包括有抗生素抗性基 因和除草剂抗性基因（Bar 基因）。标记 基因通常与目的基因构建在同一表达载体
Na2HPO4 1.79g/100ml共同溶解； Na2EDTA （10mM， 372mg），Triton-100（0.1％，100μl）, K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）（0.5mM，16.5mg）K4 [Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）（0.5mM，21.1mg） • 染色液：50μl X-Gluc母液＋450μl基液
上，一起转入生物，但有时，标记基因本 身就是目的基因，如除草剂抗性基因。
报告基因必须具备的条件
• (1)已被克隆和全序列已测定; • (2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被
转染的细胞中无相似的内源性表达产物; • (3) 报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵
敏度高而且重现性好，表达产物能进行定量测定。 • (4) 细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的