亲子鉴定DNA提取标准操作规程

DNA提取标准操作规程

1. 目的：规范不同检材的DNA提取操作程序，确保DNA质量，保证STR分型结果准确性。

2. 原理：

Chelex-100 是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合多价离子，特别是对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去Chelex颗粒，使其结合的物质与DNA 分离。

磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。

3. 操作者：具有法医物证检验资格的广西区妇幼司法鉴定所技术人员。

4. 标本：5％EDTA抗凝全血、8-10ml胎儿羊水、5％EDTA抗凝脐血、FTA纸血斑、口腔拭子、5-10根带毛囊的毛发、绒毛细胞。

5 试剂：

5.1 试剂的厂家及规格：

5.1.1 DNA抽提试剂 Chelex-100 伯乐公司（Bio-Rad Laboratories, Inc. CA U.S.A）。

5.1.2 DNA抽提试剂 Promega PP18或PP21 DNA System抽提试剂盒。

5.1.3 DNA抽提试剂口腔棉签制备基因组DNA试剂盒（G&T，U.S.A）

5.1.4 无水乙醇分析纯

5.1.5 异丙醇分析纯

5.1.6 无菌的超纯水由实验室技术人员制备。

5.2 试剂的配制：

5.2.1 5％Chelex-100的配制：称取5克粉状Chelex-100于试剂瓶中，加入灭过菌的超纯水至100ml。

5.2.2 灭菌超纯水的制备：用干净的试剂瓶装超纯水1升左右，经121℃灭菌30分。

6 仪器及设备：

6.1 生物安全柜。

6.2 高速离心机。

6.3 超速冷冻离心机。

6.4 移液器，单道微量移液器（0.5-10 ul单道）、单道微量移液器（10-100 ul单道）、单道微量移液器（100-1000 ul单道）、八道移液器（0.5-10 ul八道）和八道移液器（10-100 ul八道）。

6.5涡旋混匀器。

6.6半导体温控混匀器。

6.7超纯水制造系统。

7 操作程序：

7.1 全血或脐血的DNA抽提（Chelex-100法）

7.1.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。

7.1.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管，加无菌超纯水980ul。

7.1.3核对血样，用移液器混匀，吸取 1.5ul标本于EP 管中（-80℃存放超过一个月的血样取2-3.5ul）。

7.1.4颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。

7.1.5 加无菌超纯水980ul，颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。

7.1.6取混匀的5% Chelex-100溶液200 ul于EP管中（吸取时注意先摇匀5% Chelex-100），盖紧EP 管，振荡约15～20sec后， 56℃孵浴0.5～2h。

7.1.7 孵浴结束后振荡约15～20sec， 99℃孵浴8 min。

7.2羊水或绒毛A抽提（Chelex-100法）

7.2.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。

7.2.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管，加无菌超纯水700l。

7.2.3核对标本，用移液器混匀，吸取300l于EP 管中。

7.2.4颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。

7.2.5 加无菌超纯水1000ul，颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。

7.2.6取混匀的5% Chelex-100溶液200 ul于EP管中（吸取时注意先摇匀5% Chelex-100），盖紧EP 管，振荡约15～20sec后， 56℃孵浴0.5～2h。

7.2.7 孵浴结束后振荡约15～20sec， 99℃孵浴8 min。

7.2.8 孵浴结束后趁热振荡约15～20sec，12600rpm离心3.5min，上清即为DNA溶液。

7.3 毛发的DNA抽提（Chelex-100法）

7.3.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。

7.3.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管，加无菌超纯水980ul。

7.3.3核对血样，用移液器混匀，吸取 1.5ul全血于EP 管中（-80℃存放超过一个月的血样取2-3.5ul）。

7.3.4颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。

7.3.5 加无菌超纯水980ul，颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。

7.3.6取混匀的5% Chelex-100溶液200 ul于EP管中（吸取时注意先摇匀5% Chelex-100），盖紧EP 管，振荡约15～20sec后， 56℃孵浴0.5～2h。

7.3.7 孵浴结束后振荡约15～20sec， 99℃孵浴8 min。

7.3.8 孵浴结束后趁热振荡约15～20sec，12600rpm离心3.5min，上清即为DNA溶液。

7.4 血斑的DNA抽提（磁珠法）

7.4.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。

7.4.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管，核对样本，

7.4.3剪取合适大小的样品（2-3mm2）放置EP管中。

7.4.4加入Lysis Buffer 150ul盖紧盖子70℃孵育30min。

7.4.5室温下，12000rpm离心2min，吸取上清至一新1.5ml离心管中。

7.4.6将漩涡震荡10s，将resin混匀，取7ul resin加入到样品中。

7.4.7高速漩涡震荡样品/Lysis Buffer/resin混合液3秒钟，室温孵育5min，并且每孵育1min 震荡3秒。

7.4.8高速漩涡震荡2秒，将离心管放置磁力架，resin与溶液分开（注1）。

7.4.9小心吸弃溶液不要碰到聚集成块的resin（注2）

7.4.10加100ul 准备好的Lysis Buffer洗涤，将离心管移出磁力架，高速漩涡震荡2秒。

7.4.11将磁力架再次置于磁力架，将Lysis Buffer吸弃干净。

7.4.12加入100ul准备好的1X Wash Buffer，移出磁力架，高速漩涡震荡2秒立即放回磁力架，吸弃Wash Buffer，连续洗涤3次，最后1次洗涤将Wash Buffer移除干净。

7.4.13将离心管盖子打开，室温下干燥5-20min。

7.4.14加100ul Elution Buffer，盖上盖子漩涡震荡2秒，65℃孵育5min。

7.4.15孵育后，漩涡震荡2秒后再次放入磁力架。小心吸取DNA溶解液至一新离心管中，保存（注3）。

注1：如果resin不能形成明显的一团与溶液分开，则重新震荡迅速放置磁力架上。