甘油菌活化和质粒提取

一、甘油菌活化

1.LB培养基制备：

胰蛋白胨10g

酵母提取物5g

NaCl10g

加去离子水至800mL搅拌，使溶质完全溶解，用5mol/LNaOH（约0.2ml）调节PH至7.4，加入去离子水至1000ml，高压蒸汽灭菌20min。

●灭菌后注意密封，4℃能存放1个月。

●含琼脂的LB培养基：

上述液体培养基高压灭菌前加入15g/L（铺制平板用）或7g/L（配制顶层琼脂糖用）琼脂糖，高压灭菌20min。

2.倒平板

2.1 超净台，接种环，灭菌培养皿，酒精灯等紫外灭菌30min。

2.2 培养基高压后放在60℃水浴锅中保温。溶液尚未冷却时，即应取出培养基，并轻轻转动以使溶解的琼脂或琼脂糖能均匀分布于整个培养基溶液中。小心培养基过热，旋动液体产生暴沸。

2.3 冷却至50℃，在超净台中加入抗生素等不耐热的物质（现用现加），为避免产生气泡，混匀培养基时应采用旋动的方式，然后直接从烧瓶中倾出培养基铺制平板。

2.4 从冰箱中取出甘油菌冻存管放在冰上，不要等到融化（反复冻溶不利于长期保存），直接用（枪头）接种环在冻存管内的冰碴上蘸一下，然后马上涂平板即可。

37℃培养12-16h。第二天挑单克隆大量培养。

3.大量培养

3.1 冷藏的液态培养基重新高温高压湿热灭菌，待冷却至50℃左右加入抗生素。

3.2 在无菌操作台中将菌落挑至已加抗生素的液态培养基中（2-5mL），37℃，200rpm培养8h。

3.3 按1:500至1:1000的比例，用加抗生素的液态LB培养基稀释3.2所得菌液。

（25-50uL菌液+25mL液态含抗生素LB培养基）。37℃，200rpm培养12-16小时。

●使密度达到3-4 10^9/mL。

●OD600在0.5左右。（在可见分光光度计600nm处测菌液的光密度值，OD600在0.5左右时可判断细胞处于对数生长期，活力最佳。）

二、质粒提取

1. 准备工作

1.1 RNaseA用前瞬离。一小瓶RNaseA加到1瓶buffer P1中，使终浓度为100ug/mL。

●Optional:按1:1000的比例，在bufferP1中加入LyseBlue。

1.2 检查buffer P2是否有沉淀（SDS,低温环境），如果有沉淀，将P2放置37℃条件下，以使沉淀溶解。

1.3 4℃预冷bufferP3。

2. 质粒提取

2.1上述菌液，6000 g，4℃离心15min，收集沉淀。

●若不马上进行实验，沉淀可-20℃保存

2.2 用QIAGEN质粒提取试剂盒中的4mL buffer P1重悬。

●为使裂解充分，容器要足够大，使充分混匀

●确保buffer P1中已加入RNaseA

●如果bufferP1中加了LyseBlue，重悬菌液之前，应将混合液（bufferP1+LyseBlue）用力混匀

●涡旋或上下颠倒混匀，使重悬菌液无团块

2.3加入4mL buffer P2，颠倒混匀4-6次，室温（15-25℃）静置反应5min。

●千万不可用振荡器混匀，会使DNA链断裂

●静置时间不要超过5min

●Buffer P2用后立即密封，以防空气中的CO2使其酸化

●此时裂解菌液应是粘稠的

●如果buffer P1中加入了LyseBlue，那么加入buffer P2并混匀后，应出现均匀的蓝色，如果出现局部无色或棕色团块，应继续颠倒混匀

2.4 加入4mL预冷bufferP3，立即用力颠倒混匀4-6次，冰上静置15min。

●注意低温操作（预冷，冰上静置），目的是促沉淀

●加入bufferP3后，出现白色蓬松状沉淀，沉淀为基因组DNA，蛋白质，细胞碎片，KDS。此时，裂解液粘稠度应降低

●如果buffer P1中加入了LyseBlue，沉淀过滤后，溶液应该是无色的，表明SDS已经充分沉淀

2.5离心前混匀，≥20000⨯g，4℃离心30min。快速吸取上清（含质粒）。

2.6上清≥20000⨯g，4℃离心15min。吸取上清。

●Optional:取240uL上清，做凝胶电泳分析，以判断培养和分离是否合理

2.7平衡QIAGENtip-100，向QIAGENtip-100中加入4mL bufferQBT，重力作用自然流下。

2.8将2.6中的上清加入2.7平衡过的QIAGENtip-100中。

●提前平衡QIAGENtip-100，使得上清尽快加入，如果间隔时间太久，（蛋白沉淀变混浊）应再次离心以免堵塞QIAGENtip-100

●Optional:取240uL流出的液体，做凝胶电泳分析，质粒DNA与QIAGEN 树脂的结合效率

2.9用bufferQC洗QIAGENtip-100，一次10mL，洗2次。

●第一遍去除质粒提取试剂中的大部分杂质，如果菌液体积大或菌体产生大量碳水化合物时第二遍清洗则必要的

●Optional：

2.10 用5mLbufferQF洗脱DNA，用15mL管收集洗脱液。

●不可用聚碳酸酯离心管（不耐乙醇）

●如果重组质粒大于45-50kb，65℃预热bufferQF可洗脱效率

●Optional:

●洗脱下来的DNA可4℃暂存，但不建议过夜

2.11加

3.5mL（0.7倍洗脱液体积）室温异丙醇沉淀质粒DNA，混匀，≥15000⨯g，4℃离心30min，或者5000⨯g，4℃离心60min。小心弃去液体。

●室温异丙醇：减少盐沉淀

●4℃离心：防止样品过热

2.12用2mL室温70%乙醇洗涤，≥15000⨯g，4℃离心10min，或者5000⨯g，4℃离心60min，小心弃去液体，室温晾干，用合适的缓冲液溶解（如TE buffer pH8.0，或10mM TrisCl，pH8.5）。