甘油菌活化和质粒提取
菌种保存大家谈。甘油的浓度。
菌种保存大家谈。
甘油的浓度。
2009-08-15 01:13大家好！我是保藏中心，最近发现基因酷保藏中心的共享菌株的保存出现了较严重的问题，06年07年酷友共享的菌株很多都活化不了，好些酷友想要，保藏中心却不能应助，对此我们很抱歉！因此，在此向大家赐教，菌株应如何保存呢？望大家能分享经验，多提出建议（保藏中心如何保藏菌株和管理菌株为佳），一起努力搭建好这个平台，让它能帮到更多酷友！作者: 保藏中心时间: 09-2-19 10:55有人说，冷冻干燥保藏法是菌种保藏最有效的方法之一。
因为没有做过，所以请教做过这方面的酷友，大肠杆菌的冷冻保藏应该注意的事项?甘油冷冻保藏及穿刺菌的保藏一般能保藏多久呢？作者: 我是好人时间: 09-2-19 21:34冷冻干燥法是国内外一致认为比较理想的菌种保藏方法。
冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。
它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。
并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。
常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。
除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。
保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。
不适合酷友频繁的求助菌种。
我们实验室保藏菌种，不管是细菌，放线菌还是霉菌和酵母，我们都是用的甘油管保藏。
就是划斜面得到单菌落，将单菌落置于液体培养基培养至对数期，在EP管中保存，菌液与甘油体积比为1：1，甘油要灭菌的。
质粒抽提原理及详细操作步骤精编版
质粒抽提,实验室必备技能之一质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
质粒抽提从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。
当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。
质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。
当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。
要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。
碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液溶液Ⅰ50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。
溶液Ⅱ0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。
溶液Ⅲ5 mol/L乙酸钾60.0 mL，冰乙酸11.5 mL，无菌水28.5 mL， 4℃保存，使用时置于冰浴中。
下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer，12000 rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜，提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。
质粒提取与分析 Protocol
质粒提取与分析是分子生物学实验中的基本技术之一，它是从细菌中提取和纯化质粒DNA，并对质粒DNA进行相关的分析和检测。
下面是质粒提取与分析的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理质粒是一种独立于细菌染色体之外的DNA分子，它不参与细胞的染色体复制，而是在细胞分裂时进行自我复制。
质粒提取的原理是通过物理和化学方法裂解细菌，释放出质粒DNA，然后通过离心、沉淀和洗涤等步骤将质粒DNA与细菌其他成分分离，最终得到纯化的质粒DNA。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o溶液Ⅰ：10mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1mmol/L EDTA （pH=8.0）、50mmol/L葡萄糖。
o溶液Ⅱ：0.1mol/L NaOH、1% SDS。
o溶液Ⅲ：3mol/L醋酸钾、20mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）。
o70%乙醇。
o TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1mmol/L EDTA （pH=8.0）。
2.耗材：o移液器。
o离心管和离心管盖。
o 1.5ml微量移液器。
o无菌水。
o0.22μm滤膜。
o培养板和涂布器。
o细菌培养液（如LB液体培养基）。
o氯仿。
o异戊醇。
三、实验仪器1.实验室搅拌器。
2.高速冷冻离心机。
3.水浴锅。
4.无菌工作台或超净工作台。
5.紫外线分光光度计。
6.电泳仪和电泳槽。
7.显微镜。
8.恒温摇床或振荡器。
9.烘箱或微波炉。
10.量筒和烧杯。
11.计时器。
12.手套和实验服。
四、准备工作1.阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。
2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。
6.设置离心机的高速和低速离心参数，以及水浴锅的温度等参数。
甘油菌菌种活化步骤,甘油菌怎么保存
甘油菌菌种活化步骤，甘油菌怎么保存1、LB培养基制备：准备10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，加入800ml去离子水，拌匀，直至完全溶解，然后用0.2ml氢氧化钠（5mol/L）将ph调节到7.4，并加入1L去离子水，高压蒸汽灭菌。
2、倒平板：培养基放置在60°C水浴锅中保温，取出后，轻轻转动培养基，让琼脂分布均匀。
一、甘油菌菌种活化步骤1、LB培养基制备（1）准备10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，然后加入800ml去离子水，搅拌均匀，直至完全溶解，接着使用0.2ml的氢氧化钠（5mol/L）将ph调节到7.4左右，并加入1L的去离子水，高压蒸汽灭菌20分钟左右。
（2）在高压灭菌之前，应当加入15g/L（铺制平板用）或7g/L （配制顶层琼脂糖用）的琼脂糖。
2、倒平板（1）超净台、接种环、培养皿，酒精灯等用紫外线灭菌30分钟左右。
（2）高压灭菌后的培养基放置在60°C的水浴锅中保温，等到溶液尚未冷却的时候，将培养基取出，轻轻转动，让琼脂均匀分布在培养基溶液中。
（3）等到冷却至50°C的时候，在超净台中加入抗生素，并旋转将培养基混合均匀，然后从烧瓶中倾出培养基铺制平板。
（4）将甘油菌冻存管放在冰上，直接用接种环在冻存管内的冰渣上蘸一下，然后涂上平板。
3、大量培养（1）将冷藏的液态培养基重新高温高压灭菌，等到冷却至50°C 的时候，加入抗生素，接着将菌落挑至已经加入抗生素的液态培养基中（2-5ml），37°C，200rpm培养8小时左右。
（2）按照1：500-1000的比例，将添加了抗生素的液态LB培养基稀释上一步骤所得菌液（20-25μL菌液+25ml液态LB培养基），37°C，200rpm培养12-16小时。
二、甘油菌怎么保存1、如果是20%甘油保存菌种（甘油：菌液=20：80），一般放置在零下70°C的环境下保藏。
质粒提取的原理
质粒提取的原理
质粒提取是分子生物学实验中常见的一项基本操作，它是指从
细菌中提取出质粒DNA的过程。
质粒是细菌细胞内的一种环状DNA
分子，它可以携带一些特定的基因，如抗性基因、荧光标记基因等，因此在基因工程和分子生物学研究中具有重要的应用价值。
质粒提
取的原理主要包括裂解、沉淀、洗涤和溶解等步骤。
首先，裂解是质粒提取的第一步，它的目的是破坏细菌细胞壁
和细胞膜，释放细胞内的质粒。
常见的裂解方法包括物理方法和化
学方法。
物理方法主要是利用高温、高压或超声波等手段破坏细胞
结构，使质粒DNA得以释放。
化学方法则是利用表面活性剂或蛋白
酶等化学试剂破坏细胞膜，使质粒DNA暴露在溶液中。
接着是沉淀步骤，通过离心或其他方法将裂解后的细胞碎片和
蛋白质沉淀下来，而质粒DNA则保持在上清液中。
这一步骤的目的
是去除细胞残渣和蛋白质，纯化质粒DNA。
然后是洗涤步骤，将沉淀下来的细胞碎片和蛋白质用洗涤缓冲
液洗涤，去除残留的污染物，进一步提高质粒DNA的纯度。
最后是溶解步骤，将经过洗涤的质粒DNA用适当的缓冲液溶解，得到质粒DNA的溶液。
溶解后的质粒DNA可以用于后续的分子生物
学实验，如PCR扩增、酶切、连接等。
总的来说，质粒提取的原理是通过裂解、沉淀、洗涤和溶解等
步骤，将细菌中的质粒DNA提取出来并纯化，为后续的分子生物学
实验提供高质量的DNA样品。
掌握质粒提取的原理对于分子生物学
实验具有重要的意义，能够有效地提高实验的成功率和结果的准确性。
质粒提取的原理操作步骤各溶液的作用
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各类质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情形下可持续稳固地处于染色体外的游离状态，但在必然条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞割裂传递到后代。
质粒已成为目前最经常使用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可取得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方式可用于质粒DNA的提取，本实验采纳碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为普遍的制备质粒DNA的方式，其大体原理为：当菌体在NaOH和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方式一般是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平稳离心、离子互换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方式，但这些方式相对昂贵或费时。
关于小量制备的质粒DNA，通过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可知足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中经常使用。
一、试剂预备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH ，10mM EDTA(pH ）。
1M Tris-HCl<!--[if !supportAnnotations]--><!--[endif]--> (pH ）， EDTA（pH ）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反映，第一要操纵好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
质粒提取步骤及原理
质粒提取是分子生物学中常用的实验技术，其目的是从细菌中提取出质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
下面是质粒提取的主要步骤和原理的详细解释。
一、质粒提取原理
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。
作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。
在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。
二、质粒提取步骤
培养细菌使质粒扩增：将含有目标质粒的细菌接种在适当的培养基上，提供适当的条件（如温度、湿度和营养）使细菌生长和繁殖，从而使质粒得到扩增。
收集和裂解细菌：通过离心等方法收集培养好的细菌，然后使用适当的裂解液裂解细菌，使细菌的细胞壁和细胞膜破裂，释放出内部的质粒DNA。
分离和纯化质粒DNA：通过离心、过滤或层析等方法，将裂解液中的蛋白质、细胞碎片等杂质去除，得到相对纯净的质粒DNA。
这个过程中可能需要使用一些特殊的试剂或柱子来提高分离和纯化的效率。
通过以上步骤，我们可以从细菌中提取出高质量的质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
质粒小提步骤[推荐]
![质粒小提步骤[推荐]](https://img.taocdn.com/s3/m/c8d5f3c6250c844769eae009581b6bd97f19bc97.png)
BIOMIGA质粒小提试剂盒II简明步骤（PD1213）（详细内容请参考英文说明书）I. 实验前准备 II. 注意事项RNase A: 使用前将提供的所有RNase A瞬时离心后加入Buffer A1, 使用后将Buffer A1/RNase A置于4oC保存。
质粒拷贝数:纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1,B1,N1, 相同体积的Wash Buffer 和Elution Buffer. DNA Wash Buffer*: 使用前请将8 mL (PD1213-00)或48 mL (PD1213-01)或216 mL (PD1213-02) or 90 mL (PD1213-转化菌:若为-70oC 甘油冻存的菌，请先涂布平板培养03)96-100% 乙醇加入DNA Wash Buffer。
后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。
Buffer B1: 在低于室温时会沉淀，请于50oC左右水浴加热至沉切勿直接取冻存的菌种进行培养。
淀完全溶解，溶液澄清，使用后保证Buffer B1瓶盖旋紧。
在室温下（22-25oC）进行所有离心操作。
III. 操作步骤若用于提取1-5 mL的菌落，请将Buffer A1, B1, N1的量降低至250 μL, 250 μL 及350 μL，DNA wash Buffer及Elution Buffer的量不变。
1. 接种新鲜的单个菌落到5-12 mL的LB培养基（含适量抗生素），37oC震荡培养14-16小时（勿超过16小时）。
2. 室温下10,000 x g离心1分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。
注：残留的液体培养基容易导致菌体裂解不充分，第5步离心后沉淀较松，不易吸取上清。
注：本说明书中的操作程序适用于标准LB （Luria Bertani）培养基培养12-16 小时后，OD600（细菌密度）在之间的菌液。
若采用的是富集培养基，如TB或2×YT，注意保证OD600不超过。
质粒提取原理和方法
质粒提取原理和方法质粒提取是从细菌基因组中提取出质粒DNA的一种方法。
它是分子生物学和遗传工程中常用的技术，可用于质粒的纯化和制备。
质粒提取的原理主要基于以下几个步骤：1.细菌培养：首先，我们需要将含有目标质粒的细菌培养在适当的培养基上，通过高速离心将细菌收集起来。
2.细菌溶解：将培养物进行离心，分离菌落。
然后采用一定的细胞破碎方法，如超声波震荡、冻融等，将细菌细胞壁破坏，使质粒DNA释放到溶液中。
3.质粒分离：通过离心将细菌碎片、蛋白质等杂质与质粒DNA分离。
一般是通过两次离心来完成，第一次较低速离心用于去除细菌碎片和细胞蛋白质，第二次较高速离心用于沉淀质粒DNA。
4.DNA纯化：将质粒DNA从上一步得到的沉淀物中提取出来。
可以使用酚/氯仿法、硅胶柱法、商用试剂盒等方法进行纯化。
其中酚/氯仿法是较为常用的方法，它可以将DNA溶于水相，而蛋白质和其他的污染物则溶于有机相。
5.DNA沉淀：将纯化得到的DNA溶液加入适量的酒精沉淀剂（如乙醇或异丙醇），再次进行高速离心，使DNA沉淀到离心管底部。
6.DNA洗涤：将离心管底部形成的DNA沉淀用70%乙醇洗涤，去除酒精沉淀剂和其他杂质。
然后用空气吹干，最后用一定体积的纯水或缓冲液溶解。
质粒提取的方法根据实验需求不同和实验室条件的不同可以有所差异，常用的方法有以下几种：1.酚/氯仿法：这是一种经典的DNA提取方法，它将质粒DNA溶于三氯甲烷和酚的混合物中，蛋白质和其他污染物则溶于酚相。
离心去除酚相，再用异丙醇沉淀DNA，最后用70%乙醇洗涤。
2.硅胶柱法：这是一种基于硅胶柱的离心柱技术，可用于高通量的质粒提取。
DNA样品在硅胶柱中被结合，杂质被洗掉，最后用纯水或缓冲液洗提质粒DNA。
3.磁珠法：这是一种基于磁性珠子的质粒提取方法，通过在磁性珠子表面修饰DNA结合物，使质粒DNA与磁性珠子结合。
通过外加磁场将磁性珠子与DNA一起沉淀，然后去除上清液，最后用纯水洗提DNA。
质粒的提取和制备(四)大提质粒
质粒的提取和制备(四)大提质粒1、从－20℃保存的甘油菌吸取50 µL菌液，接种到3~4 mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600大于1.6~1.8。
2、取0.5 mL的菌液于200 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600大于2.0以上。
再加入氯霉素至170 µg/mL，37℃振荡培养摇12~16 hr。
3、用摇好的菌液4000 rpm离心15 min。
4、弃上清，敞开管口，倒置，尽量让上清全部流尽。
5、用预冷的40 mL STE充分悬浮菌体沉淀。
6、4℃，4000 rpm离心15 min。
7、弃上清，敞开管口，倒置，让上清全部流尽。
8、用预冷的4 mL溶液Ⅰ充分悬浮菌体沉淀。
9、加入新鲜配制的8 mL溶液Ⅱ，上下颠倒数次，液体变得澄清，置于4℃10 min。
10、加入预冷的溶液Ⅲ 6 mL，上下颠倒充分混匀后，于4℃中放置10 min。
11、4℃，12000 rpm 离心10 min。
12、收集上清，加等体积的异丙醇，4℃中放置30 min。
13、4℃，10000 rpm离心10 min。
14、弃上清，用适量的70%的乙醇洗沉淀一次，室温吹干，溶于1 mL 1×TE中。
15、加50 µL RNase A，37℃作用2 hr。
16、加入1 mL新配制的13% PEG8000溶液（13% PEG8000，1.6 M NaCl），充分混匀，4℃中放置30 min。
17、4℃，12000 rpm离心15 min。
18、吸去上清，用400 µL 1×TE缓冲液溶解沉淀。
19、加1/4体积4 M LiCl，室温下放置5 min，12000 rpm离心5 min。
20、取上清，用酚、酚-氯仿-异戊醇各抽提一次。
21、将水相转入一新的Eppendorf管中，加入1/10体积4 M LiCl，2倍体积的无水乙醇，－20℃下放置30 min。
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA 分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH 和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl[t1] (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
EColi感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速 颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变 性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构
色，可确定DNA在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素：
DNA的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA构象； 电场强度； 碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。
三．实验材料与设备：
1、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养 箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速 离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝 胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰 上放置2～3min；
溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部 分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep 管中；
7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀， 室温放置2min. 8、 12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙 醇洗涤一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸 上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含20 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或 TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约 8min)，存于－20℃或直接用于酶切。
TOP实验室秘籍：质粒扩增及提纯的步骤详解
TOP实验室秘籍：质粒扩增及提纯的步骤详解小灵子，我，即将毕业的医学研三狗，分享一下从师姐以及大神那里学来的提质粒方法，第一次做，算比较成功，虽然其中过程非常曲折。
中间问了身边好多同学，都不是很会，研一上课的时候学实验，老师也只是简单讲了一下提纯的步骤，所以我这个科研小白还是打算来和大家分享一下，希望对有需要的同学有所帮助，也希望大家能够多多交流，万一有大神指点呢！Day1第一天最重要的是什么！当然是准备工作！准备工作1. 配液体 LB（这个东西我们这么叫，但是同科室专门做菌的小姐姐管它叫脑心脊液，也是我比较困惑的一点）蛋白胨 10g，酵母 7.5g，NaCl15g，去离子水定容到1000ml ——actually，用不了那么多，两个样最多用300ml，剩下的近期没有其他人用，扔掉我们还很心痛，所以暂时还放在我们4℃ 冰箱里保存着呜呜呜——所以，如果没有那么多样品的话，建议可以按比例减掉的哟！2. 配 CaCl 2 ：4.44g CaCl 2 + 500ml 去离子水（当然一次就用一点点，也可以按比例递减的）不过没用完，没结晶的话以后也可以用。
3. 配固体培养基：蛋白胨 1g ，酵母 0.5g， NaCl 1g ，琼脂1g，去离子水定容到 100ml。
4. 玻璃珠（这个是涂我们的小菌菌用的，我觉得用接种环、干净的棉签、小木棍都可以，实验室有啥用啥，能省就省！）5. 一套枪头（作为科研狗就别问我一套枪头是什么意思了！）6. 玻璃培养皿 (讲道理，塑料的10cm皿也可以)。
7. 离心管（ 15ml 的多来点！）8. 一盒Ep管（ 1.5ml 的就够了）9. 配抗生素：Ampicillin ：工作液100μg/ml ,可以先配成100μg/μl ,用时1:1000Kanamycin ：工作液25μg/ml ,可以先配成25μg/μl ,用时1:1000（不一定每个质粒都一样哦，记得看它带来的说明书）PS：固体培养基先不要高压，凉了就凝了！其他的速度高压，烘干放在超净台里等待我们接下来的实验hiahia~步骤一：摇菌将大肠杆菌（一点就够~具体我反正是加了10μl ）3~4ml LB 培养基中，37℃ 过夜，剧烈摇晃~ 150-200r 就可以啦。
质 粒 提 取 原理及步骤
质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
菌种保存大家谈。甘油的浓度。
菌种保存大家谈。
甘油的浓度。
2009-08-15 01:13大家好！我是保藏中心，最近发现基因酷保藏中心的共享菌株的保存出现了较严重的问题，06年07年酷友共享的菌株很多都活化不了，好些酷友想要，保藏中心却不能应助，对此我们很抱歉！因此，在此向大家赐教，菌株应如何保存呢？望大家能分享经验，多提出建议（保藏中心如何保藏菌株和管理菌株为佳），一起努力搭建好这个平台，让它能帮到更多酷友！作者: 保藏中心时间: 09-2-19 10:55有人说，冷冻干燥保藏法是菌种保藏最有效的方法之一。
因为没有做过，所以请教做过这方面的酷友，大肠杆菌的冷冻保藏应该注意的事项?甘油冷冻保藏及穿刺菌的保藏一般能保藏多久呢？作者: 我是好人时间: 09-2-19 21:34冷冻干燥法是国内外一致认为比较理想的菌种保藏方法。
冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。
它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。
并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。
常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。
除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。
保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。
不适合酷友频繁的求助菌种。
我们实验室保藏菌种，不管是细菌，放线菌还是霉菌和酵母，我们都是用的甘油管保藏。
就是划斜面得到单菌落，将单菌落置于液体培养基培养至对数期，在EP管中保存，菌液与甘油体积比为1：1，甘油要灭菌的。
质粒大量提取、纯化方法及相关溶剂的详细配方
PEG8000沉淀法大量制备和纯化质粒1质粒提取纯化步骤1.1 质粒提取步骤1) 在超净工作台上，将甘油管保种的质粒菌自然解冻后接种到含200 mL 液体LB（含100 μg/mL Kan）培养基的三角瓶中；2) 置于恒温摇床中，37℃、180 rpm条件下振荡培养16个小时；3) 用50 mL离心管在12,000 rpm、2 min条件下离心菌液，弃上清；4）重复步骤3，将200 mL菌体合并到2个50 mL离心管中；5) 菌泥重悬于3.6 mL 溶液I，加入400 μL新配的溶菌酶（10 mg/mL），涡旋震荡混匀，室温放置15-20 min，中间晃动2-3次；6) 加入8 mL现配的溶液II，盖紧管盖后轻柔颠倒10次混匀至溶液呈透明粘稠状；7) 加入4 mL预冷的溶液III，盖紧管盖后颠倒10次混匀至白色絮状沉淀呈均匀分散状；8) 12,000 rpm离心10 min，用尼龙滤膜过滤将上清液转移至新的50 mL离心管中；9) 加入0.6倍体积的异丙醇（9.6 mL），充分混匀后室温放置30 min；10) 12,000 rpm离心5 min，弃上清，加入5 mL 70%乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm 离心2 min；11) 弃乙醇，晾干后加400 μL TE（pH 8.0）溶解核酸，转入10 mL离心管中，再加200 μL TE洗管，合并后共600 μL于4℃保存。
（如果提取量较多，合并后TE应少于2.5 mL）1.2 大提质粒的纯化1) 在上述保存的每管中加等体积（600 μL）预冷的5 M LiCl，充分混匀后冰浴10 min，12,000 rpm离心10 min；2) 取上清加等体积（1.2 mL）异丙醇，充分混匀后放置20 min，12,000 rpm 离心10 min，弃上清；3) 70%乙醇洗涤，12,000 rpm离心2 min弃上清，晾干后加700 μL TE 溶解于1.5 mL离心管中，加10 μL RNaseA（10 mg/mL），37 ℃消化30 min；4) 加入0.5体积（350 μL）的含30 mM MgCl2的40% PEG8000，倒置混匀数次可观察到蛋清色絮状沉淀，静置20 min，12,000 rpm离心20 min，弃上清；5) 70%乙醇洗涤，12000 rpm离心2 min弃上清，晾干后加700 μL TE 溶解于1.5 mL离心管中；6) 加等体积（酚350 μL，氯仿/异戊醇350 μL）的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀5 min，12,000 rpm离心10 min，取上清再次用酚/氯仿/异戊醇抽提一次；7) 取上清，加入等体积（650 μL）氯仿/异戊醇（24：1）混匀5 min，12,000rpm离心10 min；8) 取上清600 μL于2 mL离心管中，加约1/10体积（60 μL）NaAc（3 M，pH 5.2），加2倍体积（1.2 mL）无水乙醇混匀，室温放置20 min。
甘油菌种活化方法
甘油菌种活化方法甘油菌是一种常见的微生物菌种，它在生物工程和食品工业中具有重要的应用价值。
甘油菌的活化方法对于保证其活性和应用效果至关重要。
下面将介绍几种常用的甘油菌种活化方法。
一、传统活化方法传统的甘油菌种活化方法包括液体培养和固体培养两种方式。
液体培养方法是将甘油菌种接种到含有适当营养成分的液体培养基中，通过搅拌和通气等操作，促进菌种的生长和繁殖。
这种方法操作简单，适用于大规模的菌种活化。
但是，液体培养存在菌种易受污染、生长速度较慢等问题。
固体培养方法是将甘油菌种接种到含有适当营养成分的固体培养基上，通过培养皿或培养瓶等容器进行培养。
这种方法可以提供更好的菌落观察和分离，适用于对菌种纯度要求较高的情况。
但是，固体培养需要较长的培养时间，且操作相对复杂。
二、改进活化方法为了提高甘油菌种的活化效果，人们不断探索和改进活化方法。
1. 预处理方法预处理方法是在活化前对甘油菌种进行一系列处理，以增强其活力和生长能力。
常用的预处理方法包括热处理、酸碱处理和胁迫处理等。
例如，可以将菌种暴露在高温环境中一段时间，以促进其生长和繁殖能力。
2. 添加生长因子添加适当的生长因子可以提高甘油菌种的活化效果。
生长因子可以是有机物质或无机物质，如氨基酸、维生素、微量元素等。
这些生长因子可以提供菌种所需的营养物质，促进其生长和繁殖。
3. 优化培养条件优化培养条件是通过调节培养基成分、pH值、温度、培养时间等因素，以提高甘油菌种的活化效果。
例如，可以调整培养基中碳源和氮源的比例，提供最适合菌种生长的环境条件。
4. 使用生物技术手段生物技术手段可以通过基因工程、发酵工程等方法，对甘油菌种进行改良和优化，提高其活化效果。
例如，可以通过基因工程手段引入外源基因，增强菌种的代谢能力和生长速度。
总结起来，甘油菌种的活化方法有传统方法和改进方法两类。
传统方法包括液体培养和固体培养两种方式，而改进方法则包括预处理、添加生长因子、优化培养条件和使用生物技术手段等。
甘油菌活化和质粒提取
一、甘油菌活化1.LB培养基制备：胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g加去离子水至800mL搅拌，使溶质完全溶解，用5mol/LNaOH（约0.2ml）调节PH至7.4，加入去离子水至1000ml，高压蒸汽灭菌20min。
●灭菌后注意密封，4℃能存放1个月。
●含琼脂的LB培养基：上述液体培养基高压灭菌前加入15g/L（铺制平板用）或7g/L（配制顶层琼脂糖用）琼脂糖，高压灭菌20min。
2.倒平板2.1 超净台，接种环，灭菌培养皿，酒精灯等紫外灭菌30min。
2.2 培养基高压后放在60℃水浴锅中保温。
溶液尚未冷却时，即应取出培养基，并轻轻转动以使溶解的琼脂或琼脂糖能均匀分布于整个培养基溶液中。
小心培养基过热，旋动液体产生暴沸。
2.3 冷却至50℃，在超净台中加入抗生素等不耐热的物质（现用现加），为避免产生气泡，混匀培养基时应采用旋动的方式，然后直接从烧瓶中倾出培养基铺制平板。
2.4 从冰箱中取出甘油菌冻存管放在冰上，不要等到融化（反复冻溶不利于长期保存），直接用（枪头）接种环在冻存管内的冰碴上蘸一下，然后马上涂平板即可。
37℃培养12-16h。
第二天挑单克隆大量培养。
3.大量培养3.1 冷藏的液态培养基重新高温高压湿热灭菌，待冷却至50℃左右加入抗生素。
3.2 在无菌操作台中将菌落挑至已加抗生素的液态培养基中（2-5mL），37℃，200rpm培养8h。
3.3 按1:500至1:1000的比例，用加抗生素的液态LB培养基稀释3.2所得菌液。
（25-50uL菌液+25mL液态含抗生素LB培养基）。
37℃，200rpm培养12-16小时。
●使密度达到3-4 10^9/mL。
●OD600在0.5左右。
（在可见分光光度计600nm处测菌液的光密度值，OD600在0.5左右时可判断细胞处于对数生长期，活力最佳。
）二、质粒提取1. 准备工作1.1 RNaseA用前瞬离。
一小瓶RNaseA加到1瓶buffer P1中，使终浓度为100ug/mL。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
一、甘油菌活化
1.LB培养基制备：
胰蛋白胨10g
酵母提取物5g
NaCl10g
加去离子水至800mL搅拌，使溶质完全溶解，用5mol/LNaOH（约0.2ml）调节PH至7.4，加入去离子水至1000ml，高压蒸汽灭菌20min。
●灭菌后注意密封，4℃能存放1个月。
●含琼脂的LB培养基：
上述液体培养基高压灭菌前加入15g/L（铺制平板用）或7g/L（配制顶层琼脂糖用）琼脂糖，高压灭菌20min。
2.倒平板
2.1 超净台，接种环，灭菌培养皿，酒精灯等紫外灭菌30min。
2.2 培养基高压后放在60℃水浴锅中保温。
溶液尚未冷却时，即应取出培养基，并轻轻转动以使溶解的琼脂或琼脂糖能均匀分布于整个培养基溶液中。
小心培养基过热，旋动液体产生暴沸。
2.3 冷却至50℃，在超净台中加入抗生素等不耐热的物质（现用现加），为避免产生气泡，混匀培养基时应采用旋动的方式，然后直接从烧瓶中倾出培养基铺制平板。
2.4 从冰箱中取出甘油菌冻存管放在冰上，不要等到融化（反复冻溶不利于长期保存），直接用（枪头）接种环在冻存管内的冰碴上蘸一下，然后马上涂平板即可。
37℃培养12-16h。
第二天挑单克隆大量培养。
3.大量培养
3.1 冷藏的液态培养基重新高温高压湿热灭菌，待冷却至50℃左右加入抗生素。
3.2 在无菌操作台中将菌落挑至已加抗生素的液态培养基中（2-5mL），37℃，200rpm培养8h。
3.3 按1:500至1:1000的比例，用加抗生素的液态LB培养基稀释3.2所得菌液。
（25-50uL菌液+25mL液态含抗生素LB培养基）。
37℃，200rpm培养12-16小时。
●使密度达到3-4 10^9/mL。
●OD600在0.5左右。
（在可见分光光度计600nm处测菌液的光密度值，OD600在0.5左右时可判断细胞处于对数生长期，活力最佳。
）
二、质粒提取
1. 准备工作
1.1 RNaseA用前瞬离。
一小瓶RNaseA加到1瓶buffer P1中，使终浓度为100ug/mL。
●Optional:按1:1000的比例，在bufferP1中加入LyseBlue。
1.2 检查buffer P2是否有沉淀（SDS,低温环境），如果有沉淀，将P2放置37℃条件下，以使沉淀溶解。
1.3 4℃预冷bufferP3。
2. 质粒提取
2.1上述菌液，6000 g，4℃离心15min，收集沉淀。
●若不马上进行实验，沉淀可-20℃保存
2.2 用QIAGEN质粒提取试剂盒中的4mL buffer P1重悬。
●为使裂解充分，容器要足够大，使充分混匀
●确保buffer P1中已加入RNaseA
●如果bufferP1中加了LyseBlue，重悬菌液之前，应将混合液（bufferP1+LyseBlue）用力混匀
●涡旋或上下颠倒混匀，使重悬菌液无团块
2.3加入4mL buffer P2，颠倒混匀4-6次，室温（15-25℃）静置反应5min。
●千万不可用振荡器混匀，会使DNA链断裂
●静置时间不要超过5min
●Buffer P2用后立即密封，以防空气中的CO2使其酸化
●此时裂解菌液应是粘稠的
●如果buffer P1中加入了LyseBlue，那么加入buffer P2并混匀后，应出现均匀的蓝色，如果出现局部无色或棕色团块，应继续颠倒混匀
2.4 加入4mL预冷bufferP3，立即用力颠倒混匀4-6次，冰上静置15min。
●注意低温操作（预冷，冰上静置），目的是促沉淀
●加入bufferP3后，出现白色蓬松状沉淀，沉淀为基因组DNA，蛋白质，细胞碎片，KDS。
此时，裂解液粘稠度应降低
●如果buffer P1中加入了LyseBlue，沉淀过滤后，溶液应该是无色的，表明SDS已经充分沉淀
2.5离心前混匀，≥20000⨯g，4℃离心30min。
快速吸取上清（含质粒）。
2.6上清≥20000⨯g，4℃离心15min。
吸取上清。
●Optional:取240uL上清，做凝胶电泳分析，以判断培养和分离是否合理
2.7平衡QIAGENtip-100，向QIAGENtip-100中加入4mL bufferQBT，重力作用自然流下。
2.8将2.6中的上清加入2.7平衡过的QIAGENtip-100中。
●提前平衡QIAGENtip-100，使得上清尽快加入，如果间隔时间太久，（蛋白沉淀变混浊）应再次离心以免堵塞QIAGENtip-100
●Optional:取240uL流出的液体，做凝胶电泳分析，质粒DNA与QIAGEN 树脂的结合效率
2.9用bufferQC洗QIAGENtip-100，一次10mL，洗2次。
●第一遍去除质粒提取试剂中的大部分杂质，如果菌液体积大或菌体产生大量碳水化合物时第二遍清洗则必要的
●Optional：
2.10 用5mLbufferQF洗脱DNA，用15mL管收集洗脱液。
●不可用聚碳酸酯离心管（不耐乙醇）
●如果重组质粒大于45-50kb，65℃预热bufferQF可洗脱效率
●Optional:
●洗脱下来的DNA可4℃暂存，但不建议过夜
2.11加
3.5mL（0.7倍洗脱液体积）室温异丙醇沉淀质粒DNA，混匀，≥15000⨯g，4℃离心30min，或者5000⨯g，4℃离心60min。
小心弃去液体。
●室温异丙醇：减少盐沉淀
●4℃离心：防止样品过热
2.12用2mL室温70%乙醇洗涤，≥15000⨯g，4℃离心10min，或者5000⨯g，4℃离心60min，小心弃去液体，室温晾干，用合适的缓冲液溶解（如TE buffer pH8.0，或10mM TrisCl，pH8.5）。