医学免疫学检验-酶免疫技术1PPT课件
合集下载
《酶免疫分析技术》课件
生物工程
酶免疫分析技术在生物工程中广泛应用，如蛋 白质表达、酶催化反应和抗体筛选等。
优点与局限
1 优点
酶免疫分析技术具有高灵敏度、高特异性、 广泛适应性和操作简便等优点。
2 局限
酶免疫分析技术的局限主要包括影响因素较 多、标记物抗原性和稳定性的要求高等限制。
总结
《酶免疫分析技术》是一种重要的生物分析方法，其原理和应用领域广泛。通过本课件的学习，我们对酶免疫 分析技术有了更深入的了解，并了解到其优点和局限。谢谢大家的聆听！
为什么选择酶作为标记物？
酶具有活性强、稳定性好、催化效率高等特点，可以产生放大效应，大幅提高测定的灵敏度。
酶免疫分析技术的发展历程
酶免疫分析技术自20世纪70年代初提出以来，经过不断创新和发展，已成为生物医学和环 境检测领域的重要分析方法。
酶免疫分析技术的原理
酶底物反应原理
酶标记的免疫试剂与待检测物结 合后，通过酶底物的催化反应产 生可检测的信号，如颜色、发光 或电流。
《酶免疫分析技术》PPT 课件
这是一份《酶免疫分析技术》的PPT课件，通过本课件，我们将深入介绍酶 免疫分析技术的原理、主要实现步骤、应用、优点与局限等内容。让我们开 始学习吧！
绪论
什么是酶免疫分析技术？
酶免疫分析技术是一种高灵敏度、高特异性的生物分析方法，通过酶标记的免疫试剂与待检 测物发生特异性反应，再利用酶对底物的催化作用产生信号。
3
信号产生
通过酶底物反应或其他方式，产生与待检测物浓度相关的可检测信号。
酶免疫分析技术的应用
医学诊断
酶免疫分析技术在临床医学中广泛应用，如血 液病、感染性疾病和肿瘤标志物的检测。
环境监测
酶免疫分析技术可用于水质、土壤和空气中有 害物质的监测，对环境污染的快速筛查具有重 要意义。
酶免疫分析技术在生物工程中广泛应用，如蛋 白质表达、酶催化反应和抗体筛选等。
优点与局限
1 优点
酶免疫分析技术具有高灵敏度、高特异性、 广泛适应性和操作简便等优点。
2 局限
酶免疫分析技术的局限主要包括影响因素较 多、标记物抗原性和稳定性的要求高等限制。
总结
《酶免疫分析技术》是一种重要的生物分析方法，其原理和应用领域广泛。通过本课件的学习，我们对酶免疫 分析技术有了更深入的了解，并了解到其优点和局限。谢谢大家的聆听！
为什么选择酶作为标记物？
酶具有活性强、稳定性好、催化效率高等特点，可以产生放大效应，大幅提高测定的灵敏度。
酶免疫分析技术的发展历程
酶免疫分析技术自20世纪70年代初提出以来，经过不断创新和发展，已成为生物医学和环 境检测领域的重要分析方法。
酶免疫分析技术的原理
酶底物反应原理
酶标记的免疫试剂与待检测物结 合后，通过酶底物的催化反应产 生可检测的信号，如颜色、发光 或电流。
《酶免疫分析技术》PPT 课件
这是一份《酶免疫分析技术》的PPT课件，通过本课件，我们将深入介绍酶 免疫分析技术的原理、主要实现步骤、应用、优点与局限等内容。让我们开 始学习吧！
绪论
什么是酶免疫分析技术？
酶免疫分析技术是一种高灵敏度、高特异性的生物分析方法，通过酶标记的免疫试剂与待检 测物发生特异性反应，再利用酶对底物的催化作用产生信号。
3
信号产生
通过酶底物反应或其他方式，产生与待检测物浓度相关的可检测信号。
酶免疫分析技术的应用
医学诊断
酶免疫分析技术在临床医学中广泛应用，如血 液病、感染性疾病和肿瘤标志物的检测。
环境监测
酶免疫分析技术可用于水质、土壤和空气中有 害物质的监测，对环境污染的快速筛查具有重 要意义。
【医学PPT课件】酶免疫测定技术
ß-半乳糖苷酶： 4-甲基伞基-ß-半乳糖苷：荧光
4. 酶结合物的制备： ⑴ 戊二醛交联法 ⑵ 过碘酸盐氧化法
二、反应条件的选择 1. 酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标
二抗，取OD=0.8者。 2. 包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法 3. 3. 温度、时间等
4. 三、操作标准化 5. 1 加样 6. 2 保温 7. 3 洗涤 8. 4 比色 9.
五. ELISA出现“一片黄”的原因： ⑴酶结合物浓度过高 ⑵底物不新鲜 ⑶洗涤不干净 六.ELISA出现“一片白”的原因： ⑴载体吸附性能差 ⑵底物错 ⑶稀释液作包被液 ⑷加错试剂 ⑸包被时间过短 ⑹酶活力低或下降 ⑺样品含有NaN3。
第三节 酶标记技术的发展
一、斑点ELISA 二、免疫印迹法 三、重组免疫结合试验 四、亲和素-生物素系统
二、反应条件的选择 ㈠ 酶标二抗浓度选择 ㈡ 包被抗原浓度的选择
三、操作标准化
一、试剂制备：
㈠ 免疫吸附剂
1. 固相载体
2. ⑴ 要求：① 吸附力强
3.
② 能保持Ag或Ab活性
4.
③ 不参与化学反应
5. ⑵ 载体性能比较
6. ① 载体材料：+、- 结果差别大
7. ② ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG， 显色后，测20孔的OD，要求CV<10%。
底增 加。 5. 标本用NaN3防腐，可出现假“-”。
试剂的准备：
注意不同地区冬、夏温差，可造成达到 37℃的时间差异，对弱阳性结果有很大 影响。
加样：
总体积约360ul，包被和封闭均为100ul， 未封闭部分可吸附非特异蛋白
温育：
1 4℃过夜最佳， 37℃2h较好， 2 43℃20min可造成弱“+”假“-” 3 2 水浴较温箱等空气浴均匀
4. 酶结合物的制备： ⑴ 戊二醛交联法 ⑵ 过碘酸盐氧化法
二、反应条件的选择 1. 酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标
二抗，取OD=0.8者。 2. 包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法 3. 3. 温度、时间等
4. 三、操作标准化 5. 1 加样 6. 2 保温 7. 3 洗涤 8. 4 比色 9.
五. ELISA出现“一片黄”的原因： ⑴酶结合物浓度过高 ⑵底物不新鲜 ⑶洗涤不干净 六.ELISA出现“一片白”的原因： ⑴载体吸附性能差 ⑵底物错 ⑶稀释液作包被液 ⑷加错试剂 ⑸包被时间过短 ⑹酶活力低或下降 ⑺样品含有NaN3。
第三节 酶标记技术的发展
一、斑点ELISA 二、免疫印迹法 三、重组免疫结合试验 四、亲和素-生物素系统
二、反应条件的选择 ㈠ 酶标二抗浓度选择 ㈡ 包被抗原浓度的选择
三、操作标准化
一、试剂制备：
㈠ 免疫吸附剂
1. 固相载体
2. ⑴ 要求：① 吸附力强
3.
② 能保持Ag或Ab活性
4.
③ 不参与化学反应
5. ⑵ 载体性能比较
6. ① 载体材料：+、- 结果差别大
7. ② ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG， 显色后，测20孔的OD，要求CV<10%。
底增 加。 5. 标本用NaN3防腐，可出现假“-”。
试剂的准备：
注意不同地区冬、夏温差，可造成达到 37℃的时间差异，对弱阳性结果有很大 影响。
加样：
总体积约360ul，包被和封闭均为100ul， 未封闭部分可吸附非特异蛋白
温育：
1 4℃过夜最佳， 37℃2h较好， 2 43℃20min可造成弱“+”假“-” 3 2 水浴较温箱等空气浴均匀
酶免疫测定技术PPT课件
测食品中的残留农药：迄今为止，应用ELISA检测食品中的残留农药主要是除 草剂、杀菌剂和杀虫剂。ELISA 法测定农药残留以其特异性强、灵敏度高及 快速准确而得到广泛的应用，尤其是现场控制水果、蔬菜、食品中的农药残 留，对发展无污染农产品，保障人体健康起到积极作用。
检测食品中的微生物：制备单克隆抗体分析食品中伤寒沙门氏菌，结果准确 可靠，比常规方法缩短了 3~4ｄ，而且与其它沙门氏菌交叉反应率很低，与 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。
ELISA广泛应用于内分泌、血液、肿瘤、传染病、免疫化学等方面， 例如：用于检测雌性激素、胰岛素等，检查凝血因子、红细胞抗原等； 用于检查甲胎蛋白，其敏感性已达到放射免疫试验相当的水平。
ELISA在抗体检测中优势突出，尤其对病毒检测明显优于常规检测方 法。例如：对流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒、狂犬病毒和脊髓灰 质炎病毒等的检测。同时用作自身免疫病抗体测定以及对过敏的诊断， 例如检测过敏原的抗体。
编辑版ppt
18
一、治疗药物监测一药物血浓度测定 有地高辛、奎尼丁、利多卡因、双异丙、普鲁卡因酞胺、
N 一乙酞普鲁卡因酞胺(前者的有活性代谢物)、庆大霉素、 妥布霉素、丁胺卡那霉素、乙基西梭霉素、氨甲喋吟等。 二、药物滥用的尿检验— 半定量分析 有苯丙胺、巴比妥类、苯甲二氮草类、大麻类、可卡因、 乙醇、美沙酮、安眠酮、阿片类 、丙氧吩等。半定量分 析是以阴性、低、中等三种浓度的标准品为三点制作一条 标准曲线, 测定样品的光吸收值变化率与标准曲线比较, 可以计算样本中存在的药物与代谢物总量。 三、血清三环类抗抑郁药的定性分析 阿米替林、去甲替林、丙咪啧、去甲丙咪嗦、氯丙咪嗦、 三甲丙咪嗓、多虑平、普鲁替林等及其4 种代谢物。 定性分析是应用一个一定浓度的标准品作对照, 如样品的 光吸收值变化率超过标准品, 即为阳性;否则算作阴性。据 此可作快速毒物鉴定。 四、血清巴比妥类及苯甲二氮草类的半定量分析 7 种巴比妥类及13 种苯甲二氮草类药物的半定量分析。 测定方法亦系以阴性、低、编辑版中ppt等三种浓度的标准品作对照19 比较, 以测算样本中存在的药物量。
检测食品中的微生物：制备单克隆抗体分析食品中伤寒沙门氏菌，结果准确 可靠，比常规方法缩短了 3~4ｄ，而且与其它沙门氏菌交叉反应率很低，与 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。
ELISA广泛应用于内分泌、血液、肿瘤、传染病、免疫化学等方面， 例如：用于检测雌性激素、胰岛素等，检查凝血因子、红细胞抗原等； 用于检查甲胎蛋白，其敏感性已达到放射免疫试验相当的水平。
ELISA在抗体检测中优势突出，尤其对病毒检测明显优于常规检测方 法。例如：对流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒、狂犬病毒和脊髓灰 质炎病毒等的检测。同时用作自身免疫病抗体测定以及对过敏的诊断， 例如检测过敏原的抗体。
编辑版ppt
18
一、治疗药物监测一药物血浓度测定 有地高辛、奎尼丁、利多卡因、双异丙、普鲁卡因酞胺、
N 一乙酞普鲁卡因酞胺(前者的有活性代谢物)、庆大霉素、 妥布霉素、丁胺卡那霉素、乙基西梭霉素、氨甲喋吟等。 二、药物滥用的尿检验— 半定量分析 有苯丙胺、巴比妥类、苯甲二氮草类、大麻类、可卡因、 乙醇、美沙酮、安眠酮、阿片类 、丙氧吩等。半定量分 析是以阴性、低、中等三种浓度的标准品为三点制作一条 标准曲线, 测定样品的光吸收值变化率与标准曲线比较, 可以计算样本中存在的药物与代谢物总量。 三、血清三环类抗抑郁药的定性分析 阿米替林、去甲替林、丙咪啧、去甲丙咪嗦、氯丙咪嗦、 三甲丙咪嗓、多虑平、普鲁替林等及其4 种代谢物。 定性分析是应用一个一定浓度的标准品作对照, 如样品的 光吸收值变化率超过标准品, 即为阳性;否则算作阴性。据 此可作快速毒物鉴定。 四、血清巴比妥类及苯甲二氮草类的半定量分析 7 种巴比妥类及13 种苯甲二氮草类药物的半定量分析。 测定方法亦系以阴性、低、编辑版中ppt等三种浓度的标准品作对照19 比较, 以测算样本中存在的药物量。
《酶免疫检验》PPT课件
免疫学检验
标记免疫技术
广东药学院公共卫生学院 赵晓蓉
完整版ppt
1
基本概念
一、免疫标记与标记免疫的概念
免疫标记技术： 标记物与免疫活性物质的联接技术
标记免疫技术： 以标记免疫物质检测相应靶物质的技术
标记的目的…….?
完整版ppt
2
二、常用的免疫标记物质
类别
标记物
荧光素
FITC、RB200、TRITC
④加入酶底物，底物被酶催化变为有色产
物，产物的量与标本中受检物质的量直
接相关，故可根据颜色反应的深浅对标
本中的抗原或抗体定性或定量分析完整。版ppt
23
完整版ppt
24
方法类型及基本原理
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
双抗体夹心法 双位点一步法 间接法 竞争法 捕获法 双抗原夹心法 中和法
完整版ppt
25
一、双抗体夹心法
属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA，适 用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而 不能用于小分子半抗原的检测。
用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检 测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原酶标抗体免疫复合物。
由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原 是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。 测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量 (OD值)，即可确定待测抗原含量。
21
酶免疫技术的分类
根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的 酶标记物，可分为：
1. 均相法：不需要分离结合和游离的酶标记物，直接 进行测定。
2. 异相法：需要分离结合和游离的酶标记物后才能进 行测定。 固相酶免疫：ELISA 液相酶免疫
标记免疫技术
广东药学院公共卫生学院 赵晓蓉
完整版ppt
1
基本概念
一、免疫标记与标记免疫的概念
免疫标记技术： 标记物与免疫活性物质的联接技术
标记免疫技术： 以标记免疫物质检测相应靶物质的技术
标记的目的…….?
完整版ppt
2
二、常用的免疫标记物质
类别
标记物
荧光素
FITC、RB200、TRITC
④加入酶底物，底物被酶催化变为有色产
物，产物的量与标本中受检物质的量直
接相关，故可根据颜色反应的深浅对标
本中的抗原或抗体定性或定量分析完整。版ppt
23
完整版ppt
24
方法类型及基本原理
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
双抗体夹心法 双位点一步法 间接法 竞争法 捕获法 双抗原夹心法 中和法
完整版ppt
25
一、双抗体夹心法
属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA，适 用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而 不能用于小分子半抗原的检测。
用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检 测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原酶标抗体免疫复合物。
由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原 是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。 测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量 (OD值)，即可确定待测抗原含量。
21
酶免疫技术的分类
根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的 酶标记物，可分为：
1. 均相法：不需要分离结合和游离的酶标记物，直接 进行测定。
2. 异相法：需要分离结合和游离的酶标记物后才能进 行测定。 固相酶免疫：ELISA 液相酶免疫
免疫组织化学检验技术—酶免疫组织化学检验技术(免疫学检验课件)
（二）技术类型 1.直接法
形成抗原一抗体一酶复合物 2.间接法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物 3.酶标抗体三步染色法 为间接法的改良法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物
（三）方法评价
三、非标记抗体酶免疫组化染色法
（一）原理 该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特
异性强的抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结 合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab2） 作桥，Ab2既可与 Ab3的Fc段结合，又可与 结合在组织抗原上的第一抗体（Ab1）的Fc 段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对 抗原的检测。
4.APAAP法 APAAP法就是以碱性磷酸酶代替HRP建立
的碱性磷酸酶（AP）- 抗碱性磷酸酶（AAP） 法，简称APAAP法。技术要点与PAP法相似。
（三）方法评价
该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于 酶不是标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗 体反应与抗酶抗体结合，避免了酶标抗体的 缺点，提高了方法的敏感性。尤其是双桥 PAP法，是当今免疫组化技术中敏感性较高 的方法。
通过桥抗体（Ab2）将特异性识别组织抗原 的抗体（Ab1）与PAP复合物的抗酶抗体连 接起来Ag-Ab1-Ab2-PAP
3.双桥PAP法 该法是PAP法的改良，通过两次连接桥抗体
和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了比 PAP法更多的酶分子，大大增强了方法的敏 感性。
酶标记抗体免疫组织化学染色法 非标记抗体酶免疫组织化学染色法
二、酶标记抗体的免疫组化染色法
（一）原的共价键作用将酶直接连接在抗体 （或抗抗体）上，酶标抗体（或抗抗体） 与组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应 后，通过酶对底物的催化作用，生成不溶 性有色产物并沉淀在特定位置，达到对抗 原定性、定位、定量检测的目的。
临床免疫学检验-课件-第9章 酶免疫技术1
• 酶标记物的标记原则
• 保有酶的催化活性和抗体（或抗原）的活性。 • 结合物有良好的稳定性。 • 标记方法简单、产率高、且重复性好。
制备酶结合物的方法
戊二醛交联法：以双功能交联剂为“桥”，分别 与酶和抗体（抗原）连接而形成结合物。
要求：交联剂至少含有两个可与蛋白质分子通过化 学反应而结合的反应基团。
HRP催化TMB
HRP催化
– 终止反应； –提高显色的稳定性，退色慢！以TMB为例
不加终止液：2小时内反应产物退色，蓝色产物 在450nm有最大吸收峰，但峰值较低
加终止液：反应产物变成黄色，在450nm处具有 最大吸收峰，峰值比蓝色产物峰值高。
–不同显色体系里可能使用的终止液不同（酸或碱）。
– 定义：通过化学反应将酶与抗体或抗原形成结合物 – 作用：酶免疫测定技术的核心组成部分，它的稳定性
决定EIA试剂盒的有效使用日期。
（一）酶标记抗体或抗原的制备 （p50）
• 抗原和抗体的要求：
• 抗原：纯度高，抗原性完整; • 抗体：效价高、亲和力强、特异性强，能批量生产，易于分
离纯化。常用单克隆抗体
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）： β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, β-Gal）
辣根过氧化酶（HRP）
• HRP的性质: • 主酶（糖蛋白）+ 辅基（亚铁血红素）蔬菜作物辣根中含 量很高。 • 最高吸收峰:主酶(275nm)与酶活性无关；辅基(403nm)酶活 性基团
• HRP的纯度： • 纯度数(Reinheit zahl, RZ)表示：A403/A275 • 用于标记的HRP, RZ ≥ 3.0。 • 仅表示辅基在HRP中的含量，RZ越大不意味着酶活性越高， 酶变性后RZ不变但活性降低 。
• 保有酶的催化活性和抗体（或抗原）的活性。 • 结合物有良好的稳定性。 • 标记方法简单、产率高、且重复性好。
制备酶结合物的方法
戊二醛交联法：以双功能交联剂为“桥”，分别 与酶和抗体（抗原）连接而形成结合物。
要求：交联剂至少含有两个可与蛋白质分子通过化 学反应而结合的反应基团。
HRP催化TMB
HRP催化
– 终止反应； –提高显色的稳定性，退色慢！以TMB为例
不加终止液：2小时内反应产物退色，蓝色产物 在450nm有最大吸收峰，但峰值较低
加终止液：反应产物变成黄色，在450nm处具有 最大吸收峰，峰值比蓝色产物峰值高。
–不同显色体系里可能使用的终止液不同（酸或碱）。
– 定义：通过化学反应将酶与抗体或抗原形成结合物 – 作用：酶免疫测定技术的核心组成部分，它的稳定性
决定EIA试剂盒的有效使用日期。
（一）酶标记抗体或抗原的制备 （p50）
• 抗原和抗体的要求：
• 抗原：纯度高，抗原性完整; • 抗体：效价高、亲和力强、特异性强，能批量生产，易于分
离纯化。常用单克隆抗体
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）： β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, β-Gal）
辣根过氧化酶（HRP）
• HRP的性质: • 主酶（糖蛋白）+ 辅基（亚铁血红素）蔬菜作物辣根中含 量很高。 • 最高吸收峰:主酶(275nm)与酶活性无关；辅基(403nm)酶活 性基团
• HRP的纯度： • 纯度数(Reinheit zahl, RZ)表示：A403/A275 • 用于标记的HRP, RZ ≥ 3.0。 • 仅表示辅基在HRP中的含量，RZ越大不意味着酶活性越高， 酶变性后RZ不变但活性降低 。
《酶免疫技术》PPT课件
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计 测 量。
精品医学
13
二、酶标记抗体或抗原
酶免疫技术的核心组成部分
酶结合物 （conjugate）
酶标记物
通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的
结合物
精品医学
14
酶标记抗体或抗原
制备方法要求
➢抗原要求纯度高，抗原性完整
➢抗体需要特异性好、效价高、亲 合力强以及比活性较高，能批量生 产，易纯化。
精品医学
7
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比
精品医学
ELISA中应用最为广 泛的标记用酶
8
酶和酶作用底物
抗原和酶标抗原
或抗体
洗涤
3
使结合在固相上
的抗原抗体复合物
与未结合的分离
4 底物显色
定性或定量的分析
精品医学
31
二、方法类型及反应原理
三个必要试剂
固相的抗原或抗体
酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
精品医学
32
ELISA检测抗原的方法
双抗体夹心法
➢ 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶
标抗体，加底物显色
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
+
捕获法精原品医理学
EE E
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
免疫学--酶免疫技术
酶免疫技术
Enzyme Immunoassay
❖ 酶免疫技术：
是用酶作标记物标记抗原或抗体，将抗 原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专 一性结合在一起的一种免疫检测技术。
本章主要内容
1.酶 标记物的制备 2.酶联免疫吸附试验 3. 酶免疫印迹试验 4. 生物素放大酶免疫技术
第一节 概述
一、技术原理 二、酶免疫技术的类型
是一种以膜为载体的酶免疫技术，以膜为载 体吸附抗原，加入抗体和酶标二抗，反应后 在膜表面形成免疫复合物，加底物显色进行 检测。
类型： 斑点酶免疫试验
（dot immunoenzyme filtration assay） 免疫印迹试验
（immuno-blotting test）
（一）斑点-酶联免疫吸附试验
❖ 生物素亲和素系统酶联免疫吸附试验 Biotin-Avidin System ELISA
一、生物素-亲和素系统
❖ 生物素： Biotin ❖ 亲和素： Avidin
生物素
➢维生素H ➢动、植物组织中广泛分布,
卵黄和肝含量高,现可人工合成 ➢MW 244.31kD ➢结构：咪唑酮环＋噻吩环（图）
PAP:
过氧化物酶(P)-抗过氧化物酶(AP)复合物
Ag-Ab1-桥Ab2-PAP-桥Ab2B-ABC-S
第六节均相酶免疫测定
❖ 酶放大免疫测定技术 ❖ 克隆酶供体免疫测定技术
第七节 酶免疫测定的应用
1. 病原体及其抗体测定 2. 蛋白质测定 3. 非肽类激素测定 4. 药物和毒品测定
思考题： 1. 酶免疫技术的类型。 2.ELISA的基本原理。
二、技术类型
（一）酶免疫测定技术与酶免疫组化技术 1. 酶免疫组织化学技术:
Enzyme Immunoassay
❖ 酶免疫技术：
是用酶作标记物标记抗原或抗体，将抗 原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专 一性结合在一起的一种免疫检测技术。
本章主要内容
1.酶 标记物的制备 2.酶联免疫吸附试验 3. 酶免疫印迹试验 4. 生物素放大酶免疫技术
第一节 概述
一、技术原理 二、酶免疫技术的类型
是一种以膜为载体的酶免疫技术，以膜为载 体吸附抗原，加入抗体和酶标二抗，反应后 在膜表面形成免疫复合物，加底物显色进行 检测。
类型： 斑点酶免疫试验
（dot immunoenzyme filtration assay） 免疫印迹试验
（immuno-blotting test）
（一）斑点-酶联免疫吸附试验
❖ 生物素亲和素系统酶联免疫吸附试验 Biotin-Avidin System ELISA
一、生物素-亲和素系统
❖ 生物素： Biotin ❖ 亲和素： Avidin
生物素
➢维生素H ➢动、植物组织中广泛分布,
卵黄和肝含量高,现可人工合成 ➢MW 244.31kD ➢结构：咪唑酮环＋噻吩环（图）
PAP:
过氧化物酶(P)-抗过氧化物酶(AP)复合物
Ag-Ab1-桥Ab2-PAP-桥Ab2B-ABC-S
第六节均相酶免疫测定
❖ 酶放大免疫测定技术 ❖ 克隆酶供体免疫测定技术
第七节 酶免疫测定的应用
1. 病原体及其抗体测定 2. 蛋白质测定 3. 非肽类激素测定 4. 药物和毒品测定
思考题： 1. 酶免疫技术的类型。 2.ELISA的基本原理。
二、技术类型
（一）酶免疫测定技术与酶免疫组化技术 1. 酶免疫组织化学技术:
临床检验免疫学酶免疫技术课件
常用的供氢体(底物）： 邻苯二胺（O-phenylenediamine, OPD）:反应显橙黄
色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB）:
反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差 ABTS (2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)
反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的 酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记 Ag（Ab）的浓度成反比
四）捕获法(capture ELISA )：
主要用于 血清中某种抗体亚型成分的测定 检测IgM抗体最常用方法
原理：
（三) 结果分析：
1、定性
• 间接法与夹心法：正相关 竞争法：反相关
4℃过夜
弃包被液，PBS清洗
保存备用。
三）封闭(blocking)
1、定义：包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被 的过程
2、常用的封闭剂：1％～5％牛血清白蛋白
二、酶免疫技术分类
Ag-E + Ab E-Ag Ab + Ag-E
EE
E
E
三、酶联免疫吸附试验
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
待测抗原或抗体量与产物量呈负相关
基本原理
测定抗原:
测定抗体
特点：
用于抗原和半抗原的定性、定量测定，也可对 抗体进行测定
酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力
反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是 固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与 非标记Ag（Ab）的分子数量和
色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB）:
反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差 ABTS (2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)
反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的 酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记 Ag（Ab）的浓度成反比
四）捕获法(capture ELISA )：
主要用于 血清中某种抗体亚型成分的测定 检测IgM抗体最常用方法
原理：
（三) 结果分析：
1、定性
• 间接法与夹心法：正相关 竞争法：反相关
4℃过夜
弃包被液，PBS清洗
保存备用。
三）封闭(blocking)
1、定义：包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被 的过程
2、常用的封闭剂：1％～5％牛血清白蛋白
二、酶免疫技术分类
Ag-E + Ab E-Ag Ab + Ag-E
EE
E
E
三、酶联免疫吸附试验
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
待测抗原或抗体量与产物量呈负相关
基本原理
测定抗原:
测定抗体
特点：
用于抗原和半抗原的定性、定量测定，也可对 抗体进行测定
酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力
反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是 固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与 非标记Ag（Ab）的分子数量和
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
11
2020年10月2日
12
五、膜载体的酶免疫测定
一）斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA） 二）斑点免疫渗滤试验（IFA） 三）斑点免疫层析试验（ICA） 四）免疫印迹法（IBT）-Western-blot
六、酶免疫组织化学技术
第一课件网网站
2020年10月2日
13பைடு நூலகம்
2020年10月2日
14
2020年10月2日
15
2020年10月2日
16
演讲完毕，谢谢观看！
Thank you for reading! In order to facilitate learning and use, the content of this document can be modified, adjusted and printed at will after downloading. Welcome to download!
酶免疫技术
第一课件网网站
2020年10月2日
1
一、定义 二、分类
酶免疫组织化学技术
酶免疫测定 均相酶免疫测定
异相酶免疫测定 液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
2020年10月2日
2
三、常用的酶及底物
常用酶
底物
辣根过氧化物酶 邻苯二胺、H2O2
（HRP）
四甲基联苯胺、 H2O2
碱性磷酸酶（AP） 对硝基本磷酸脂
汇报人：XXX 汇报日期：20XX年10月10日
17
显色 橙黄色
蓝色 黄色
2020年10月2日
3
四、酶联免疫吸附试验
（enzyme linked immunosorbent assay，ELASA） 一）基本原理
二）技术类型
1、间接法
包被抗原 洗涤 封闭 待测标本 洗涤 加酶标二抗 洗涤 底物显色
2020年10月2日
4
2020年10月2日
5
2020年10月2日
6
2020年10月2日
7
2、双抗体夹心法
★包被：
Ab
★洗涤、封闭
★加待测标本：Ag
★洗涤
★加酶标抗体
★洗涤
★加底物显色
3、竞争法
★包被：
Ab
★洗涤、封闭
★加待测标本（Ag）+酶标Ag
★洗涤
★加底物显色
2020年10月2日
8
2020年10月2日
9
第一课件网网站
2020年10月2日
10
2020年10月2日