基因工程常用的工具酶
基因工程常用的工具酶
2024/10/14
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识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构
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第三节 DNA聚合酶
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DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
❖作用特点
能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催 化核苷酸的聚合
❖作用条件
➢ 脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d
HindΙ、 HindⅡ、 Hind Ⅲ
不同限制修饰系统
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三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列
识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
5‘ HO 3‘ HO
T4-PNP
5‘ p 3‘ HO
OH 3‘ OH 5‘
Mg2+ pppATP（g-32P-ATP）
OH 3‘
5‘ HO
BAP / CIP
《基因工程的基本工具》 知识清单
《基因工程的基本工具》知识清单一、限制性内切核酸酶（限制酶）限制酶是基因工程中最重要的工具酶之一。
它就像一把精准的“分子剪刀”，能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切开。
限制酶具有特异性，不同的限制酶识别的核苷酸序列不同。
例如，EcoRⅠ限制酶识别的序列是 GAATTC，而 BamHⅠ限制酶识别的序列是 GGATCC 。
当限制酶识别到特定序列后，就会在该位点将 DNA 双链切断，形成黏性末端或平末端。
黏性末端是指被切开的 DNA 双链的末端，一条链突出几个碱基，另一条链对应位置凹进去几个碱基，就像“锯齿”一样。
而平末端则是指切开的双链末端是平齐的。
限制酶的发现和应用，为基因工程中对 DNA 进行精确的切割和操作奠定了基础。
二、DNA 连接酶有了“剪刀”将 DNA 切开，还需要“胶水”将它们连接起来，这就是DNA 连接酶的作用。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
DNA 连接酶连接的是 DNA 片段之间的磷酸二酯键。
在基因工程中，常用的 DNA 连接酶有 E·coli DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶。
E·coli DNA 连接酶只能连接黏性末端，而 T4 DNA 连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端，但连接平末端的效率相对较低。
三、载体在基因工程中，要将目的基因导入受体细胞，就需要一个“运输工具”，这就是载体。
载体需要具备一些特定的条件：1、能够在受体细胞中稳定保存并自我复制。
这样才能保证目的基因在受体细胞中能够长期存在和表达。
2、具有多个限制酶切点，以便插入目的基因。
3、具有标记基因，便于筛选含有目的基因的受体细胞。
常见的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。
质粒是一种小型的环状DNA 分子，广泛存在于细菌等原核生物中。
它具有自主复制能力，并且通常含有一些抗生素抗性基因作为标记基因。
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
基因工程的工具酶
03
应用领域：基 因工程、生物 制药、环境保
护等领域
04
发展趋势：定 向进化与优化 将成为工具酶 研究的重要方 向，推动基因 工程领域的发
展。
工具酶在合成生物学中的应用与前景
工具酶在合成生物学中的作用：作为构建基因电路的关键元件，实现对基因的精确调控 工具酶的发展趋势：更高效、更精确、更稳定的工具酶不断被开发出来 工具酶在生物制药中的应用前景：利用工具酶进行药物设计和生产，提高药物疗效和降低成本 工具酶在环境保护中的应用前景：利用工具酶进行污染治理和生态修复，保护生态环境和促进可持续发展
工具酶在基因治疗和生物医学中的未来发展
01
基因治疗：工具酶在基因编辑和基因治疗中的应用
02
生物医学：工具酶在疾病诊断和治疗中的应用
03
未来发展：工具酶在个性化医疗和精准医疗中的应用
04
展望：工具酶在基因治疗和生物医学领域的发展趋势和挑战
THANK YOU
YOUR LOGO
04
应用：基因工 程、DNA测序 、基因治疗等
领域
DNA连接酶
功能：连接 DNA片段，形 成重组DNA
特点：高效、 特异性强、稳 定性好
应用：基因克 隆、基因突变、 基因表达调控 等
类型：T4 DNA连接酶、 T7 DNA连接 酶等
聚合酶
01
功能：在基因工程中，聚合酶用于切割和连 接DNA，以实现基因的插入、删除和修改
工具酶：基因工程工具酶是指 在基因工程中用于切割、连接 和修饰DNA的酶
12
34
应用：在基因突变的研究中，
实例：例如，使用限制性内切
基因工程工具酶可以用来诱导
酶切割DNA，然后使用DNA连
基因工程期末考试题及答案
基因工程期末考试题及答案一、选择题（每题2分，共20分）1. 基因工程中常用的工具酶是：A. 纤维素酶B. 限制性内切酶C. 淀粉酶D. 过氧化氢酶答案：B2. 下列哪项不是基因工程的基本步骤？A. 目的基因的获取B. 基因的表达C. 基因的克隆D. 基因的测序答案：D3. 基因枪法是一种：A. 植物转基因方法B. 动物转基因方法C. 微生物转基因方法D. 所有生物的转基因方法答案：A4. 重组DNA技术中，通常使用哪种质粒作为载体？A. 质粒DNAB. 线粒体DNAC. 核糖体RNAD. 染色体DNA答案：A5. 基因工程中，目的基因的表达通常需要：A. 启动子B. 终止子C. 增强子D. 所有选项答案：D二、填空题（每空2分，共20分）1. 基因工程是指按照人们的意愿，将不同来源的基因在体外构建杂合DNA分子，然后导入到活细胞和生物体内，以改变生物的遗传特性并取得新品种或新产品。
2. 基因工程中常用的宿主细胞有大肠杆菌、酵母菌和________。
答案：哺乳动物细胞3. 基因工程中，________是连接目的基因和载体DNA的关键酶。
答案：DNA连接酶4. 目的基因的表达需要________和________的协同作用。
答案：启动子；终止子5. 基因工程产品在医学领域的应用包括生产________、________和基因治疗等。
答案：重组蛋白；单克隆抗体三、简答题（每题10分，共30分）1. 请简述基因工程在农业中的应用。
答案：基因工程在农业中的应用主要包括提高作物的抗病性、抗虫性、抗旱性和提高作物的产量和品质。
例如，通过基因工程培育的抗虫棉可以减少农药的使用，提高棉花的产量和质量。
2. 基因工程在医学领域有哪些应用？答案：基因工程在医学领域的应用包括生产重组蛋白药物、单克隆抗体、基因治疗和疫苗开发等。
例如，利用基因工程技术生产的胰岛素可以治疗糖尿病，单克隆抗体用于治疗癌症和自身免疫性疾病。
3. 请解释什么是转基因生物，并简述其潜在的风险。
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
生物技术课件-02基因工程常用工具酶
随着技术的不断发展，基因工程经历了从简单到复杂的过程，从最初的重组DNA技术到现在的基因编辑技术，基因工程的应用范围和影响力不断扩大。
医学领域
农业领域
工业领域
基础生物学研究
01
02
DNA聚合酶的最主要功能是催化脱氧核糖核酸链的合成。
DNA聚合酶存在于生物体的各种细胞中，包括原核生物和真核生物。其中最重要的有E· coliDNA聚合酶Ⅰ、T4DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶α、β、γ等。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。
聚合酶
这类酶能够催化DNA的聚合反应，是PCR技术中常用的工具酶之一。根据来源不同，可以分为Taq酶和T7噬菌体聚合酶等。
工具酶的应用与展望
限制性核酸内切酶用于切割DNA，产生具有特定黏性末端的片段，连接酶将这些片段连接起来，形成重组DNA。
聚合酶用于DNA复制，通过检测特定基因的PCR产物，可以鉴定基因的存在和表达水平。
01
02
在基因工程中，末端转移酶可以用来在DNA片段的3'端加上多聚腺苷酸尾巴，从而增加外源基因在宿主细胞中的转录效率。
末端转移酶是一种能够将单个脱氧核糖核苷酸或脱氧寡核苷酸附加到核酸分子末端的酶。
工具酶的分类与特性
来源于动物细胞
这类工具酶是从动物细胞中提取得到的，如碱性磷酸酶、限制性核酸内切酶等。它们在基因克隆、DNA修饰等方面有广泛应用。
限制性核酸内切酶
这类酶能够识别并切割DNA的特异序列，是基因工程中常用的工具酶之一。根据识别序列的不同，可以分为限制性内切酶和特异性内切酶。
分子生物学第四章--基因工程常用工具酶
同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。
同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。
B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。
粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补— — DNA是分子重组的基础
15
同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别 序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平 头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端， 称为同识异切。
第四章 基因工程常用工具酶
1
Manipulating Genes
- Transferring Genes
Restriction Ligation Extract DNA
Transformation
Selection
Culturing
2
重组DNA实验中常见的主要工具酶
3
我们的基本目的是：把外源基因与载体 连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以 下两类工具酶：
23
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，
产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的
DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
24
限制性内切酶的剪切方式
25
Yu Zheng, et al. Using shotgun sequence data to find active restriction enzyme genes. Nucleic Acids Res., 2009, 37: e1. Whole genome shotgun sequence analysis has become the standard method for beginning to determine a genome sequence. The preparation of the shotgun sequence clones is, in fact, a biological experiment. It determines which segments of the genome can be cloned into Escherichia coli and which cannot. By analyzing the complete set of sequences from such an experiment, it is possible to identify genes lethal to E. coli.
基因工程操作的工具酶
也称为Kronberg酶，是Kronberg等1956年发 现的第一个DNA聚合酶。
具有三种酶活性
a、5’ ---3’DNA聚合酶活性
CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCT
GGCTATCGGA Mg2+ dNTP
GGCTATCGGA
.
46
b、3’ ---5’ 外切酶活性
.
44
3. DNA聚合酶
分为两类： ①依赖于DNA的DNA聚合酶，包括大肠杆菌
DNA聚合酶I（全酶）、大肠杆菌DNA聚合 酶I的Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等。 ②依赖于RNA的DNA聚合酶，有逆转录酶。
.
45
DNA聚合酶
(1)大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)：
.
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常见的限制性内切酶
限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点
EcoR Ⅰ
G↓AATTC
HindⅡ
GTPy↓PuAC
Hind Ⅲ
A↓AGCTT
BsuR I
GG↓CC
.
22
Pst Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ BamHⅠ Not Ⅰ
CTGCA↓G CCC↓GGG
T↓CTAGA C↓TCGAG G↓GATCC
.
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限制性酶的识别序列一般为4~8个核苷 酸，这些序列大多呈回纹结构。
Eco RⅠ识别6个核苷酸序列，在特定的G-A 之间切割DNA分子。 5’ … G↓A –A- T –T – C … 3’ 3’ … C – T –T –A –A↑G … 5’
.
15
Pst Ⅰ酶切 5’ … C – T –G –C–A↓G … 3’ 3’ … G↑A–C – G–T– C… 5’
基因工程试题及答案
基因工程试题及答案# 基因工程试题及答案## 一、选择题1. 基因工程中常用的工具酶是：A. 限制性内切酶B. DNA聚合酶C. 逆转录酶D. DNA连接酶2. 基因工程中，用于目的基因的克隆通常使用：A. 质粒B. 噬菌体C. 人工染色体D. 转座子3. 下列哪项不是基因工程的应用领域？A. 农业改良B. 疾病治疗C. 能源开发D. 武器制造## 二、填空题1. 基因工程中，常用的宿主细胞包括________、________和________。
2. 基因枪法是一种________技术，可以将目的基因直接导入植物细胞。
## 三、简答题1. 简述基因工程的基本操作步骤。
2. 基因工程在医药领域的应用有哪些？## 四、论述题1. 论述基因工程对现代农业的影响及其潜在风险。
## 参考答案### 一、选择题1. 答案：A, D。
限制性内切酶和DNA连接酶是基因工程中用于切割和连接DNA片段的常用工具酶。
2. 答案：A。
质粒是基因工程中常用的载体，用于克隆和表达目的基因。
3. 答案：D。
基因工程的应用领域广泛，但武器制造不属于其应用范围。
### 二、填空题1. 答案：大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞。
这些是基因工程中常用的宿主细胞，用于表达外源基因。
2. 答案：基因转移。
基因枪法是一种基因转移技术，通过高速微粒子将DNA射入细胞内。
### 三、简答题1. 答案：基因工程的基本操作步骤包括：目的基因的获取、载体的选择与构建、目的基因与载体的连接、转化宿主细胞、筛选含有目的基因的细胞、目的基因的表达与检测。
2. 答案：基因工程在医药领域的应用包括：生产重组蛋白药物、基因治疗、疫苗开发、疾病诊断等。
### 四、论述题1. 答案：基因工程对现代农业的影响主要体现在作物改良、提高产量、增强抗病虫害能力等方面。
通过基因工程，可以培育出抗旱、抗盐碱、抗病的作物新品种，提高作物的适应性和产量。
然而，基因工程也存在潜在风险，如基因流可能导致非目标物种的基因改变，以及转基因作物对生态环境的影响等。
基因工程基因工程工具酶
2023-11-03
目录
• 基因工程工具酶概述 • 基因工程工具酶的种类及应用 • 基因工程工具酶的生产及纯化 • 基因工程工具酶的发展趋势及挑战 • 基因工程工具酶的相关法规及伦理问题
01
基因工程工具酶概述
基因工程工具酶的定义
基因工程工具酶是指那些在基因工程实验中用于切割、修饰 、检测和操控DNA的酶。
详细描述
DNA连接酶可以连接DNA片段之间的缺口，实现DNA分子的拼接。在基因工程中，它被广泛应用于 基因克隆、载体构建、测序等实验中。根据来源不同，DNA连接酶具有不同的特性和应用范围。
逆转录酶
总结词
逆转录酶是一种能够将RNA转化为cDNA 的酶，是基因工程中重要的工具酶之一。
VS
详细描述
逆转录酶可以逆转录RNA分子，生成 cDNA分子。在基因工程中，它被广泛应 用于RNA测序、cDNA库构建、基因克隆 等实验中。根据来源不同，逆转录酶具有 不同的特性和应用范围。
03
基因工程工具酶的生产及 纯化
基因工程工具酶的生产
01
02
03
基因克隆
将目标酶的基因克隆到表 达载体中，构建成重组 DNA分子。
细胞转化
将重组DNA分子导入宿 主细胞，使目标基因在细 胞内表达。
培养基选择
选择适合细胞生长和酶表 达的培养基，优化培养条 件。
基因工程工具酶的纯化
细胞破碎
采用物理或化学方法破碎 细胞，释放出目标酶。
这些酶主要来自生物体内，但也可以通过基因工程技术进行 人工改造和优化。
基因工程工具酶的重要性
基因工程工具酶是实现基因操作的关键工具，没有它们，我们无法实现从DNA片 段到完整基因组的精确编辑。
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单基因工程作为现代生物技术的核心领域之一，为人类带来了前所未有的机遇和挑战。
而在基因工程中，酶和载体是至关重要的工具，它们就像是工匠手中的精巧工具，帮助我们实现对基因的精确操作和转移。
一、基因工程中的酶1、限制性内切酶限制性内切酶，也被称为“分子剪刀”，是基因工程中最重要的工具酶之一。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切断。
这种特性使得我们能够从复杂的 DNA 分子中切取特定的基因片段。
不同的限制性内切酶识别的序列不同，这为基因工程的操作提供了丰富的选择。
限制性内切酶的作用就像是一把精准的剪刀，能够在 DNA 这个长长的“绳子”上剪出我们需要的特定片段。
比如，EcoRI 能识别GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断 DNA 双链。
2、 DNA 连接酶当我们用限制性内切酶切下所需的基因片段后，需要将它们与其他DNA 片段连接起来，这时候就轮到 DNA 连接酶发挥作用了。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
想象一下，DNA 连接酶就像是一个“胶水”，把被剪开的 DNA 片段重新粘在一起，使它们成为一个连续的整体。
3、 DNA 聚合酶在基因工程中，DNA 聚合酶常用于 DNA 的复制和扩增。
例如，PCR（聚合酶链式反应）技术就依赖于耐高温的 Taq DNA 聚合酶。
通过 PCR 技术，我们可以在体外大量扩增特定的 DNA 片段，为后续的实验和应用提供足够的材料。
4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA（cDNA）。
这在获取真核生物的基因时非常有用，因为真核生物的基因中含有内含子，而通过反转录得到的 cDNA 不含内含子，更便于在原核生物中表达。
二、基因工程中的载体1、质粒质粒是一种存在于细菌细胞质中的小型环状 DNA 分子。
它具有自主复制能力，可以在细菌细胞内独立存在和复制。
第二章基因工程中常用的工具酶
第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。
型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。
基因工程常用工具酶及应用
*
5′CCGATA-OH 3′ 3′GGC DNA聚合酶Ⅰ 5′CCG 3′GGC ＋dA,dT 3’→5’ 外切酶活性
2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段
该酶是用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ ，从全酶中切去 5‘ → 3’ 外切活性的肽段后产生的一条多肽链，保留了5’→3’聚合和3’→5’外切活性。
5'
5'
3'
-G AATTC-
5'
3'
-CTTAA G-
5'
5'
3'
3'
-GTT AAC-
-CAA TTG-
5' sticky end 5'粘末端
3' sticky end 3'粘末端
blunt end 平末端
*
四.识别位点与切割方式
限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。
M-MLV－来自于莫络尼鼠的白血病病毒
二 . T4DNA连接酶
催化两个DNA片段的3’-OH和5’-P末端 形成磷酸二酯键
该酶是大肠杆菌T4噬菌体的DNA30编码的产物，分子量68kd。现已由基因工程菌表达。
*
DNA 连接酶
“分子针线”
*
DNA连接酶
连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。
01
该酶称为Klenow酶。也称为 Klenow 片段（Klenow fragment）。
02
*
3.T4噬菌体DNA聚合酶
来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，具有
5’→3’ DNA聚合酶活性
生物技术课件——基因工程常用工具酶
HO GCA…5’
5’…ACGAATTCGT…3’
T4DNA连接酶 Mg2＋，ATP
3’…TGCTTAAGCA…5
反应系统：ATP，Tris－HCl，MgCl2，DTE（二硫赤藓糖醇），ATP， pH7.5，4～15℃
h
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也可以连接两条平起末端的DNA分子，但反 应速度较慢。
5’…CGAOH
DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。
DNA聚合酶主要有三类：聚合酶Ⅰ(polⅠ)、 聚合酶Ⅱ(polⅡ) ，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其 中聚合酶Ⅰ参与DNA修复，聚合酶Ⅲ参与DNA 复制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。
h
32
DNA聚合酶Ⅰ在DNh A复制过程中的作用 33
DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比较
h
7
2.1.1.2 R-M系统
细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构 成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restrictionmodification system)。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的 限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可 以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则 会被降解。
2 基因工程常用工具酶
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1
基因工程的重要特点之一是在体外实行DNA分子的切 割和重新连接。因此，工具酶是DNA体外操作必不可 少的工具。
取得编码某种药物的目的基因，大多需要工具酶－限 制性核酸内切酶
将目的基因与载体DNA连接在一起，也需要工具酶－ DNA连接酶。
目前，许多厂商都在生产各种优质工具酶，简化了分
感染
E.coli k
Phageλ（k）
B 限制 λ（不k感）染』
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单一、基因工程简介基因工程，又称为重组 DNA 技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
它是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，而实现这一技术的关键就在于一系列特殊的工具，其中酶和载体起着至关重要的作用。
二、基因工程中的酶1、限制性核酸内切酶（限制酶）限制酶是能够识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开的酶。
限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割 DNA 分子。
例如，EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断磷酸二酯键。
限制酶切割DNA 分子产生的末端有两种类型：黏性末端和平末端。
黏性末端是指被限制酶切开的 DNA 双链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对；平末端则是指切口平整，不带有伸出的核苷酸。
2、 DNA 连接酶DNA 连接酶的作用是将两个具有相同末端（如黏性末端或平末端）的 DNA 片段连接起来，形成一个完整的 DNA 分子。
DNA 连接酶与限制酶的作用相反，它通过催化磷酸二酯键的形成，将断开的 DNA 片段重新连接起来。
3、 DNA 聚合酶在基因工程中，DNA 聚合酶常用于 DNA 片段的扩增，如 PCR 技术（聚合酶链式反应）。
PCR 技术中使用的热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶）能够在高温环境下保持活性，不断地将脱氧核苷酸加到引物的 3'端，使 DNA 链得以延伸。
4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA 链，即 cDNA。
这在获取目的基因时非常有用，例如从真核生物细胞中提取出mRNA，然后通过反转录酶合成 cDNA，再进行后续的基因操作。
三、基因工程中的载体1、载体的作用载体在基因工程中主要起到运输目的基因的作用，它能够将目的基因导入到受体细胞中，并使其在受体细胞中稳定存在和表达。
3第三章基因工程的工具酶
三、核酸酶
作用：降解磷酸二酯键 分为：外切酶 内切酶
（一） Bal 31(来自于细菌 Alteromonas espejiana)
单链特异内切，双链特异外切，依赖于Ca2+ 用途： 构建限制酶图谱 产生末端缺失突变 DNA超螺旋线性化
ห้องสมุดไป่ตู้
（四） DNase I: 来自于牛胰腺，既可 以降解单链也可以降解双链，没有特异 性，产生单核苷酸或短链
（五）RNase H： 切割DNA—RNA杂交双链中的RNA
序列，使杂交双链变成单链DNA结构
（一）
四、聚合酶
（二） Klenow酶
该酶无5‘-3’外切活性，保留了5‘-3’聚合活性 及3‘-5’外切活性。
建立酶切图谱需要的酶类 确定每一种酶酶切后产生的分子量和片段数目 进行双酶切 比较酶切和双酶切的结果，绘制酶切图谱 含糊的位点可以通过部分酶切解决（可短时间 的酶切或者在4℃条件下进行）
六、 限制性内切酶的star活性
在pH不合适，或甘油浓度过高≥10%时， 限制性内切酶的切割位点会出现非专一性，因 此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下。
蛋白结构 异源三聚体
同源二聚体
异源二聚体
辅助因子 ATP Mg2+SAM
Mg2+
ATP Mg2+SAM
识别序列 TGAN8TGCT
旋转对称序列
GAGCC
AACN6GTGC
CAGCAG
切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游
随机性切割
特异性切割
24-26bp处
基因工程中常用的酶
分类与用途
分类
根据识别序列的长度和切割位点的特性，限制性内切核酸酶 可分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型限制性内切核酸酶识别位点较长， 切割位点不规则；Ⅱ型限制性内切核酸酶识别位点较短，切 割位点规则。
用途
限制性内切核酸酶在基因工程中主要用于DNA的克隆、基因 的定位、突变分析等方面。通过限制性内切核酸酶的切割， 可以将DNA片段分离出来，再进行后续的克隆和转化等操作 。
生物制药
在生物制药中，使用DNA 连接酶将药物基因或疫苗 基因插入到载体中，制备 基因药物或基因疫苗。
03
聚合酶
定义与特性
聚合酶
是一种能够催化DNA复制和修复的酶， 通过聚合核苷酸片段，合成新的DNA 链。
特性
聚合酶具有专一性、高效性和耐受性 等特性，能够在特定的模板指导下， 高效地合成DNA链。
分类与用途
分类
根据来源不同，反转录酶可分为天然反转录酶和重组反转录酶。
用途
在基因工程中，反转录酶主要用于将RNA转录为cDNA，以便进行基因克隆、表达和功能研究。
反转录酶的应用案例
基因克隆
通过反转录酶将mRNA转化为 cDNA，再利用限制性内切酶将其 切割成适当大小的片段，进行基 因克隆和测序。
基因工程中常用的酶
• 限制性内切核酸酶 • DNA连接酶 • 聚合酶 • 反转录酶 • 其他常用酶类
01
限制性内切核酸酶
定义与特性
定义
限制性内切核酸酶是一类能够识 别并切割DNA特定序列的酶，是 基因工程中常用的工具酶之一。
特性
限制性内切核酸酶具有高度的特 异性，能够识别并切割DNA中的 特异序列，切割位点通常是DNA 双链中的特定位点。
限制性内切核酸酶的应用案例
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单一、基因工程简介基因工程，又称基因拼接技术或 DNA 重组技术，是指按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外进行改造和重新组合，然后导入另一种生物的细胞内，使其能够表达并产生新的性状或产物的技术。
这项技术的出现，为人类解决许多问题提供了新的途径和方法。
二、酶在基因工程中的作用1、限制性核酸内切酶（简称限制酶）限制酶是基因工程中最重要的工具酶之一。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割 DNA 分子。
例如，EcoRⅠ限制酶能够识别 GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断磷酸二酯键。
限制酶的作用就像是一把“分子剪刀”，能够将 DNA 剪成不同的片段，为后续的基因重组提供材料。
不同的限制酶识别的核苷酸序列不同，切割位点也不同。
这使得我们可以根据需要选择合适的限制酶来切割 DNA。
2、 DNA 连接酶在基因工程中，将切割后的 DNA 片段连接起来需要用到 DNA 连接酶。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
DNA 连接酶的作用就像是“胶水”，将断开的 DNA 链条重新连接起来，保证基因的完整性和稳定性。
3、反转录酶反转录酶在基因工程中也有着重要的作用。
它能够以 RNA 为模板合成 DNA，这一过程被称为反转录。
例如，在获取目的基因时，如果我们只有相应的 mRNA，就可以利用反转录酶合成与之互补的 DNA 链，即 cDNA。
4、聚合酶聚合酶在基因工程中的应用也非常广泛。
例如，在 PCR 技术（聚合酶链式反应）中，DNA 聚合酶能够在体外快速大量地扩增特定的DNA 片段。
三、载体在基因工程中的作用载体是基因工程中用于携带目的基因进入受体细胞的工具。
常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。
1、质粒质粒是一种存在于细菌等微生物细胞中的小型环状 DNA 分子。
它具有自主复制能力，能够在细胞内独立地进行复制和遗传。
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四、影响限制酶活性的因素
DNA的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、EDTA、SDS
增加限制酶用量 扩大酶催化反应体系 延长酶催化时间
DNA的甲基化程度：
反应温度：
DNA的分子结构：
酶缓冲液组成： 甘油浓度：
MgCl2： NaCl/KCl： Tris-HCl： β-巯基乙醇/二硫苏糖醇（DTT）： 牛血清白蛋白（BSA）：
连接方式
缺口DNA:
5’ 3’
OH P
3’
5’
平齐末端DNA：
5’ 3’
OH P P OH
3’ 5’
粘性末端DNA：
5’ 3’
3’ 5’
基因工程中常用的连接酶
T4噬菌体DNA连接酶（T4连接酶） 大肠杆菌DNA连接酶 热稳定性DNA连接酶
第三节 DNA聚合酶
DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
HaeⅢ 的切割位点
5‘ … G A G G C C G A G … 3’ 3‘ … C T C C G G C T C … 5’
HaeⅢ的识别序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 部分限制酶能识别多种核苷酸序列
HindⅡ的识别序列 5‘ … G C G T Py Pu A C G A G … 3’ 3‘ … C G C A Pu Py T G C T C … 5’
与识别位点一致 Mg2+
低
高
EcoK、EcoB
Hind Ⅱ
同时存在 两个亚基 Ι 、Ⅱ之间 与识别位点不一 Mg2+、 SAM
低 EcoPΙ
二、限制酶的命名
命名原则
限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小 写）表示寄主物种
菌株名位于其后 罗马数字表示同一寄主菌株的不同限制修饰系统
属名
种名
❖ 酶特性：
➢ 5’→3’聚合酶活性 ➢ 5’→3’核酸外切酶活性 ➢ 3’ → 5’核酸外切酶活性
3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ 5‘ … C-G-A-G-T-OH
DNA pol I dNTP Mg2+ 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ 5‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH
第二节 DNA连接酶
DNA连接酶：能够催化双链DNA片段相邻的3‘羟基与5’ 磷酸基形成磷酸二酯键的酶
作用特点
只能连接双螺旋DNA分子，不能连接单链DNA分子； DNA链上必须具有游离的3’-OH和5‘-P； 只能封闭DNA链上磷酸二酯键切口，不能封闭多个核酸分子缺失形成
的裂口； 需要吸能：ATP/NAD+
Sau3A I
MboI
5‘ … GTGATCGA … 3’ 5‘ … GAGATCCA … 3’ 3‘ … CACTAGCT … 5’ 3‘ … CTCTAGGT … 5’
XmaI
SmaI
5‘ … GTCCCGGGGA … 3’ 5‘ … GTCCCGGGGA … 3’ 3‘ … CAGGGCCCCT … 5’ 3‘ … CAGGGCCCCT … 5’
❖作用特点
能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催 化核苷酸的聚合
❖作用条件
➢ 脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）
➢ 引物链：带有3’-OH游离基团 ➢ 模板：单链或双链DNA模板 ➢ Mg2+：
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ι （ DNA pol I ）
株名ห้องสมุดไป่ตู้
Haemophilus influenzae d
HindΙ、 HindⅡ、 Hind Ⅲ 不同限制修饰系统
三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列
识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
第二章 基因工程常用的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶：简称限制酶。是一类能识别双链DNA 分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的 核酸内切酶
20世纪50年代发现：
λ噬菌体
E.coli B
PFU10-4
E.coli B
PFU1
E.coli B
限制性核酸内切酶：降解外来DNA 修饰酶：DNA甲基化
Py dCMP、dTMP Pu dAMP、dGMP
识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构
三、Ⅱ型限制酶的特性-切割后形成的末端
粘性末端： 彼此具有互补核苷酸的单链延伸末端
5‘ … GTGAATTCGA … 3’EcoR I 5‘ … GTG
AATTCGA … 3’
3‘ … CACTTAAGCT … 5’
3‘ … CACTTAA
GCT … 5
平齐末端：
5‘ … GAGGCCGAG … 3’ HaeⅢ 5‘ … GAGG
3‘ … CTCCGGCTC … 5’
3‘ … CTCC
CCGAG … 3’ GGCTC … 5’
三、Ⅱ型限制酶的特性-同尾酶、同裂酶
同尾酶:来源各异、识别序列也不相同，但都产生相同粘性 末 端的一类限制酶
5‘ … GTGGATCCGA … 3’ BamH I 5‘ … GTG GATCCGA … 3’
3‘ … CACCTAGGCT … 5’
3‘ … CACCTAG GCT … 5’
5‘ … GTTGATCAGA … 3’ Bcl I 3‘ … CAACTAGTCT … 5’
BamHI、 BclI为一组同尾酶
5‘ … GTT GATCAGA … 3’
3‘ … CAACTAG TCT … 5’
同裂酶:来源各异，但识别相同核酸序列的一类酶
λ噬菌体
DNA被降解 DNA被修饰
防御 保护
寄主细胞控制的限制与修饰系统（R/M体系）！
一、限制酶的种类
Ι型酶
Ⅱ型酶
Ⅲ型酶
限制修饰活性
同时存在
单独存在
酶蛋白结构 相对分子质量
多亚基结构 30万dal
单亚基结构 2-10万dal
切割位点
切割作用辅助因 子
实用性
代表
与识别位点不一致 致
Mg2+、ATP、SAM