基因工程常用的工具酶

Sau3A I
MboI
5‘ … GTGATCGA … 3’ 5‘ … GAGATCCA … 3’ 3‘ … CACTAGCT … 5’ 3‘ … CTCTAGGT … 5’
XmaI
SmaI
5‘ … GTCCCGGGGA … 3’ 5‘ … GTCCCGGGGA … 3’ 3‘ … CAGGGCCCCT … 5’ 3‘ … CAGGGCCCCT … 5’
第二节 DNA连接酶
DNA连接酶：能够催化双链DNA片段相邻的3‘羟基与5’ 磷酸基形成磷酸二酯键的酶
作用特点
只能连接双螺旋DNA分子，不能连接单链DNA分子； DNA链上必须具有游离的3’-OH和5‘-P； 只能封闭DNA链上磷酸二酯键切口，不能封闭多个核酸分子缺失形成
的裂口； 需要吸能：ATP/NAD+
与识别位点一致 Mg2+
低
高
EcoK、EcoB
Hind Ⅱ
同时存在 两个亚基 Ι 、Ⅱ之间 与识别位点不一 Mg2+、 SAM
低 EcoPΙ
二、限制酶的命名
命名原则
限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小 写）表示寄主物种
菌株名位于其后 罗马数字表示同一寄主菌株的不同限制修饰系统
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d
HindΙ、 HindⅡ、 Hind Ⅲ 不同限制修饰系统
三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列
识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
Py dCMP、dTMP Pu dAMP、dGMP
识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构
连接方式
缺口DNA:
5’ 3’
OH P
3’
5’
平齐末端DNA：
5’ 3’
OH P P OH
3’ 5’
粘性末端DNA：
5’ 3’
3’ 5’
基因工程中常用的连接酶
T4噬菌体DNA连接酶（T4连接酶） 大肠杆菌DNA连接酶 热稳定性DNA连接酶
第三节 DNA聚合酶
DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
❖ 酶特性：
➢ 5’→3’聚合酶活性 ➢ 5’→3’核酸外切酶活性 ➢ 3’ → 5’核酸外切酶活性
3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ 5‘ … C-G-A-G-T-OH
DNA pol I dNTP Mg2+ 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ 5‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH
❖作用特点
能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催 化核苷酸的聚合
❖作用条件
➢ 脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）
➢ 引物链：带有3’-OH游离基团 ➢ 模板：单链或双链DNA模板 ➢ Mg2+：
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ι （ DNA pol I ）
四、影响限制酶活性的因素
DNA的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、EDTA、SDS
增加限制酶用量 扩大酶催化反应体系 延长酶催化时间
DNA的甲基化程度：
反应温度：
DNA的分子结构：
酶缓冲液组成： 甘油浓度：
MgCl2： NaCl/KCl： Tris-HCl： β-巯基乙醇/二硫苏糖醇（DTT）： 牛血清白蛋白（BSA）：
三、Ⅱ型限制酶的特性-切割后形成的末端
粘性末端： 彼此具有互补核苷酸的单链延伸末端
5‘ … GTGAATTCGA … 3’EcoR I 5‘ … GTG
AATTCGA … 3’
3‘ … CACTTAAGCT … 5’
3‘ … CACTTAA
GCT … 5
平齐末端：
5‘ … GAGGCCGAG … 3’ HaeⅢ 5‘ … GAGG
3‘ … CTCCGGCTC … 5’
3‘ … CTCC
CCGAG … 3’ GGCTC … 5’
三、Ⅱ型限制酶的特性-同尾酶、同裂酶
同尾酶:来源各异、识别序列也不相同，但都产生相同粘性 末 端的一类限制酶
5‘ …ຫໍສະໝຸດ BaiduGTGGATCCGA … 3’ BamH I 5‘ … GTG GATCCGA … 3’
HaeⅢ 的切割位点
5‘ … G A G G C C G A G … 3’ 3‘ … C T C C G G C T C … 5’
HaeⅢ的识别序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 部分限制酶能识别多种核苷酸序列
HindⅡ的识别序列 5‘ … G C G T Py Pu A C G A G … 3’ 3‘ … C G C A Pu Py T G C T C … 5’
3‘ … CACCTAGGCT … 5’
3‘ … CACCTAG GCT … 5’
5‘ … GTTGATCAGA … 3’ Bcl I 3‘ … CAACTAGTCT … 5’
BamHI、 BclI为一组同尾酶
5‘ … GTT GATCAGA … 3’
3‘ … CAACTAG TCT … 5’
同裂酶:来源各异，但识别相同核酸序列的一类酶
λ噬菌体
DNA被降解 DNA被修饰
防御 保护
寄主细胞控制的限制与修饰系统（R/M体系）！
一、限制酶的种类
Ι型酶
Ⅱ型酶
Ⅲ型酶
限制修饰活性
同时存在
单独存在
酶蛋白结构 相对分子质量
多亚基结构 30万dal
单亚基结构 2-10万dal
切割位点
切割作用辅助因 子
实用性
代表
与识别位点不一致 致
Mg2+、ATP、SAM
第二章 基因工程常用的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶：简称限制酶。是一类能识别双链DNA 分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的 核酸内切酶
20世纪50年代发现：
λ噬菌体
E.coli B
PFU10-4
E.coli B
PFU1
E.coli B
限制性核酸内切酶：降解外来DNA 修饰酶：DNA甲基化