肿瘤药理试验方法与技术
《抗肿瘤药物实验法》课件
05
抗肿瘤药物实验法的挑 战与前景
抗肿瘤药物实验法面临的挑战
01
02
03
实验方法的局限性
传统的抗肿瘤药物实验方 法可能无法完全模拟人体 环境，导致实验结果与临 床效果存在差异。
肿瘤细胞的异质性
肿瘤细胞内部存在复杂的 异质性，不同细胞类型的 反应可能不同，影响实验 结果的可靠性。
伦理和法规限制
涉及人体和动物的实验受 到伦理和法规的严格限制 ，可能影响实验的进行和 结果。
提高抗肿瘤药物实验法的效率与准确性的方法与技术
建立标准化操作流程
利用动物模型进行预测
制定和实施抗肿瘤药物实验的标准操作流 程，确保实验的一致性和可重复性。
利用基因工程小鼠等动物模型，更准确地 预测抗肿瘤药物在人体内的效果。
采用多学科交叉的研究方法
加强数据管理和统计分析
结合生物学、药理学、化学和医学等多个 学科的理论和方法，提高实验的科学性和 可靠性。
抗肿瘤药物实验法的应用领域
新药研发
通过抗肿瘤药物实验法，可以筛选和 发现具有抗肿瘤活性的新药，为新药 研发提供科学依据。
临床治疗
患者个体化治疗
通过抗肿瘤药物实验法，可以根据患 者的基因型、表型等特征，制定个体 化的治疗方案，提高治疗效果和患者 的生存质量。
通过抗肿瘤药物实验法，可以对临床 使用的抗肿瘤药物进行效果评价和优 化，提高治疗效果和减少不良反应。
客观性原则
以客观事实为依据，避免主观 臆断和偏见。
科学性原则
采用科学的方法和手段进行数 据处理和分析。
数据分析的统计学方法
描述性统计
对数据进行描述和概括，如平均值、中位数 、众数、标准差等。
生存分析
对肿瘤患者的生存时间和影响因素进行分析 。
中药抗肿瘤药理常用的技术和方法
中药抗肿瘤药理常用的技术和方法1. 细胞毒性实验：使用各种肿瘤细胞株进行细胞毒性实验，观察中药抗肿瘤药理的抑制效果。
2. 免疫荧光染色：通过免疫染色技术观察中药对肿瘤细胞的免疫活性和杀伤作用。
3. 病理切片观察：采用组织病理切片技术观察患有肿瘤的动物组织在给药后的变化，评估中药对肿瘤组织的影响。
4. Western blot分析：通过Western blot技术检测中药对肿瘤相关蛋白的表达和信号通路的影响。
5. 内源性酶活性测定：测定肿瘤细胞中相关内源性抗氧化酶的活性，评估中药的抗氧化和抗肿瘤效果。
6. 荧光素酶报告基因实验：构建荧光素酶报告基因的肿瘤细胞株，检测中药对基因表达的影响。
7. 流式细胞仪分析：利用流式细胞仪观察中药对肿瘤细胞周期、凋亡和增殖率的影响。
8. 分子对接模拟：利用计算机辅助模拟技术，预测中药分子与肿瘤相关蛋白的结合模式和亲和力。
9. 组织工程技术：将中药与支架材料结合，应用于三维细胞培养系统，模拟体内环境评估抗肿瘤作用。
10. 核磁共振成像：利用核磁共振成像技术观察中药对肿瘤动物模型的瘤内代谢和组织学变化。
11. 质谱分析：通过质谱技术分析中药提取物中的化学成分，寻找对肿瘤有效的活性成分。
12. 体内药代动力学研究：通过体内实验及药代动力学参数研究中药的吸收、分布、代谢和排泄特性。
13. 乙醇沉淀法提取：采用乙醇沉淀法提取中药有效成分，评价其抗肿瘤药理活性。
14. 超声辐照提取：利用超声波技术辐照中药提取，增加有效成分的释放率和药效。
15. 气相色谱-质谱联用技术：结合气相色谱和质谱技术对中药成分进行分析和鉴定。
16. 纳米载体技术：利用纳米技术将中药有效成分载入纳米载体，提高其生物利用度和靶向性。
17. 载脂蛋白封装技术：利用载脂蛋白封装技术提高中药有效成分的稳定性和药效。
18. 化学修饰法：通过化学修饰改善中药的药物性质，提高其抗肿瘤效果。
19. 双荧光素酶报告基因激活实验：构建双荧光素酶报告基因激活体系，评估中药对肿瘤相关基因的调控作用。
实验肿瘤药理学—抗肿瘤药物的药效学评价
3
3. 样品抗肿瘤活性的确证（二） ——体外筛选实验
3.1原理与基本操作要点 3.1.1实验原理 3.1.2基本操作要点 3.2常用的肿瘤细胞株介 绍 3.3抗肿瘤药物体外筛选 的实验设计
3.4常用的评价方法 3.4.1细胞拒染法 3.4.2生长曲线法 3.4.3克隆计数法 3.4.4MTT法 3.4.5SRB法 3.5其它评价方法
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2.1概述
实验动物肿瘤模型根据获取肿瘤组织的不同，可以分为自发性肿瘤、 诱发性肿瘤以及移植性肿瘤。
小鼠常见高自发性肿瘤举例
动物品系 C3H DBA/1 A AKR PBA C57BL … 肿瘤组织类型 乳腺癌 乳腺癌 肺瘤（癌） 淋巴细胞性白血病 淋巴瘤 网织细胞肉瘤 … 发生率 99% 75% 90% 91% 100% 74.5% … 月龄 7.2 >12 >18 10 8.7 14 …
5532常用肿瘤细胞株概要细胞株名称生物学特点研究应用mel红白血病细胞hl60白血病细胞k562白血病细胞wehi3b白血病细胞b16黑色素瘤细胞a2780卵巢癌细胞mcf7乳腺癌细胞kb口腔癌细胞a549肺癌细胞ht1080纤维肉瘤细胞3t3l1成纤维细胞nb4白血病细胞dba2小鼠白血病人白血病人balbc小鼠c57bl6小鼠卵巢癌病人乳腺癌病人口腔癌病人肺癌病人纤维肉瘤病人3t3小鼠白血病人悬浮培养小细胞球状基本为二倍体有染色体异常细胞较大酸性磷酸酶阳性基本为三倍体ph染色体阳性培养条件不适可影响分化诱导的敏感性密度高过会自分化高低密度时细胞形态有变化可移植到动物体内对阿霉素及苯丙氨酸氮芥敏感上皮样生长单层上皮样生长上皮样生长上皮样生长倍增时间较长26小时非典型的肿瘤细胞达到饱和浓度时有接触性抑制具有人早幼粒细胞白血病所特有的典型的染色体异常分化诱导实验分化诱导实验分化诱导实验耐药分化诱导实验分化诱导或细胞杀伤实验细胞杀伤及耐药实验细胞杀伤实验细胞杀伤实验细胞杀伤实验细胞杀伤及抗侵袭实验分化诱导或细胞杀伤实验分化诱导实验5633样品初筛时应该注意三点
抗肿瘤药物筛选及临床实验
抗肿瘤药物筛选及临床实验责任编辑:luanchaojibing,作者：佚名文章来源：本站原创点击数：更新时间：2005-10-24 14:54:02(—)抗肿瘤药物的筛选1．体内筛选方法体内筛选方法是药物应用于有移植性肿瘤的动物进行实验的方法。
肿瘤模型是进行药物筛选的先决条件。
一个理想的用于药物筛选的肿瘤模型应具备的条件是：①对临床疗效有预告性；②快速、经济；③指标明确、客观；④重现性好，结果可信赖。
常用于鼠类，近年来在体内试验方面，裸鼠被广泛应用于抗肿瘤药物的筛选，目前已成功地将官颈癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌等10余种人体肿瘤移植于裸鼠，国内已成功地建立了卵巢癌裸鼠皮下移植瘤和腹水瘤模型，并已用于科研和临床。
在体内试验方面需注意：①给药途径。
因腹腔给药假阳性较多见，因此要筛选一种药物是否对一种移植肿瘤确实有效，需应用两种以上不同的给药途径，并且三次实验结果均显示标准抗癌活性时才能判定有效。
②在每一种给药途径中，还需观察不同剂量的抗肿瘤活性，以揭示有效抗肿瘤药物的量效关系。
2．体外筛选方法因体内筛选需要的技术条件高，故大批筛选或粗选时多采用体外筛选。
(1)人肿瘤集落形成法：该方法是将单细胞悬液，接种到含软琼脂的培养基中，培养一定时间后一部分肿瘤细胞能够在琼脂中生长，形成集落。
通过药物处理组和对照组的细胞集落生成数量比较，可作为肿瘤化疗的药物敏感试验。
每次可用多个平面筛选8一10种药物，以找出对肿瘤细胞最敏感的药物。
此法快速、经济、选择性高，而且结果可靠，故在临床用药选择和抗肿瘤药物开发上将得到广泛应用。
该方法缺点是活肿瘤组织单细胞悬液的制备比较困难，并且集落形成的成功率不够高，故在方法学上需待完善。
ALberts等以此法指导69例复发转移卵巢癌的治疗，结果临床有效率为54％；经验治疗组的有效率为20％；而以。
HCTA中抗药的药物治疗的有效率为8％。
(2)三磷酸腺苷生物发光法(ATP法)：其基本原理是ATP为细胞内能量的基本来源，其浓度与活细胞量有关。
肿瘤药理学
根据实验目的和要求，选择合适的动 物模型，如免疫缺陷小鼠、转基因小 鼠、移植性肿瘤等。
肿瘤药理学实验方法与技术
细胞培养
体内药效学实验
通过体外培养肿瘤细胞，研究药物对肿瘤 细胞的生长抑制、细胞毒性和凋亡等作用 。
通过给动物模型用药，观察药物对肿瘤生 长、转移和耐药性的影响，评估药物的疗 效和安全性。
肿瘤药物的安全性监测与评价
肝功能监测
对于接受化疗等药物治疗的 患者，定期监测肝功能，以 便及时发现和处理药物性肝 损伤。
血常规监测
定期监测血常规指标，如白 细胞、血小板和血红蛋白等 ，以便及时发现和处理药物 引起的骨髓抑制。
心脏安全性监测
对于某些可能对心脏产生不 良影响的药物，如蒽环类药 物，需要进行心脏安全性监 测。
信号转导抑制剂
干扰肿瘤细胞信号转导，抑制肿瘤细胞增殖，如EGFR抑制剂。
血管生成抑制剂
抑制肿瘤血管生成，切断肿瘤营养供给，导致肿瘤细胞死亡。
免疫调节剂
激活或增强机体免疫系统对肿瘤的识别和杀伤能力。
肿瘤药物的靶点与作用机制
直接作用机制
直接杀伤或抑制肿瘤细胞增 殖。
间接作用机制
通过调节机体免疫系统、抑 制肿瘤血管生成等方式发挥 作用。
肝肾损伤
某些抗肿瘤药物可能对肝脏和肾脏造成损害 。
05
肿瘤药物的研发与临床应用
肿瘤药物的研发流程与关键环节
01
靶点发现
通过基因组学、蛋白质组学等方法 ，发现肿瘤细胞特异的靶点。
体外筛选
在细胞水平上对药物进行初步筛选 ，评估其抗肿瘤活性。
Hale Waihona Puke 0302药物设计与合成
基于靶点结构，设计和合成具有抑 制作用的肿瘤药物。
实验肿瘤药理学—抗肿瘤药物的药效学评价
01
抗肿瘤药物通常通过口服、注射等途径进入体内，药物的吸收受到药物剂型、生物利用度、胃肠黏膜通透性等多种因素的影响。
抗肿瘤药物的吸收与分布
02
药物吸收后，会随着血液和淋巴液分布到全身各个组织器官中，药物的分布受到药物与组织的亲和力、血流量和组织屏障等因素的影响。
xx年xx月xx日
实验肿瘤药理学—抗肿瘤药物的药效学评价
CATALOGUE
目录
实验肿瘤药理学概述抗肿瘤药物的药效学评价抗肿瘤药物的抗肿瘤作用机制抗肿瘤药物的药代动力学研究抗肿瘤药物的药效学评价的临床应用实验肿瘤药理学的未来发展趋势
01
实验肿瘤药理学概述
实验肿瘤药理学是一门在实验条件下研究抗肿瘤药物作用机制、药效和药代动力学的学科。它利用动物肿瘤模型和体外实验系统来评估药物的疗效和安全性。
实验肿瘤药理学与其他学科的交叉融合
应用生物信息学方法分析肿瘤药效学和耐药性的相关数据，挖掘药物作用机制和预测药效。
与生物信息学交叉
结合医学影像学技术，实时监测药物在肿瘤组织中的分布、活化及疗效评估等。
与医学影像学交叉
THANKS
感谢观看
破坏肿瘤细胞膜结构
抗肿瘤药物可以破坏肿瘤细胞的膜结构，导致肿瘤细胞裂解、死亡，从而抑制肿瘤的生长和转移。
抑制肿瘤血管生成
01
抗肿瘤药物可以抑制肿瘤血管的生成，切断肿瘤细胞的营养供应，导致肿瘤细胞死亡。
间接抗肿瘤作用机制
调节宿主免疫系统
02
抗肿瘤药物可以通过调节宿主免疫系统，增强机体的免疫功能，杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长和转移。
药效学评价是药物研发和临床试验中不可或缺的环节，对于抗肿瘤药物的研发和应用具有重要意义。
抗肿瘤药物的药效学研究
抗肿瘤药物的药效学研究随着医学技术和科技的不断发展，抗肿瘤药物的药效学研究也得到了很大的发展。
药物的药效学研究是药物研究的重要方面，也是药物研究的核心内容之一。
一、药物的药效学研究药物的药效学研究是对药物在体内的药理学与药动学以及药物在治疗中对体内疾病的治疗效果的研究。
药物在体内的药理学与药动学是药物药效学研究的重要方面之一。
药理学研究药物与生物体之间的相互作用，包括药物的结构、生理作用、药效、剂量效应关系以及药物的不良反应等。
药动学则是研究药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄的过程，以及药物在体内的血药浓度与药效的关系等。
药物的药效学研究不仅要求对药物机理与代谢有全面深入的认识，还要求对药物在治疗过程中所发挥的作用进行全面的评估与研究。
二、抗肿瘤药物是治疗肿瘤疾病的重要药物之一，抗肿瘤药物的药效学研究对治疗肿瘤疾病具有重要作用。
1. 细胞系模型的建立建立肿瘤细胞系模型，能够对抗肿瘤药物的效果进行预测。
在细胞系模型中，通过对不同类型的肿瘤细胞的试验、筛选和实验，可以进一步提高抗肿瘤药物的疗效。
不同的肿瘤细胞系模型具有不同的优势。
2. 动物模型实验动物模型实验是对促进抗肿瘤药物的药效学研究的重要方法。
动物模型实验中，可以进行抗肿瘤药物药效评价、探究药物在体内的分布、代谢和排泄的过程，以及药效的剂量--效应关系等。
在动物实验中，可以通过体内、体外等多种方法对抗肿瘤药物进行研究，这对促进抗肿瘤药物的研究具有重要作用。
3. 抗肿瘤药物的药效评估抗肿瘤药物的药效评估是抗肿瘤药物的药效学研究的重要方面。
药效评估通过对抗肿瘤药物药效作用、生理指标变化、肿瘤生长变化等指标的评估，来确定抗肿瘤药物的药效，并从而指导临床应用。
药效评估的结果直接影响到抗肿瘤疗效的判断和指导。
4. 抗肿瘤药物的剂量--效应关系研究抗肿瘤药物的剂量--效应关系研究是抗肿瘤药物药效学研究的重要方面之一。
这一研究重点在于确定抗肿瘤药物的最佳剂量，一个合理而有效的剂量是确保抗肿瘤药物有效性和安全性的基础。
肿瘤的临床试验与药物评价
肿瘤的临床试验与药物评价肿瘤的临床试验和药物评价是肿瘤研究和治疗中非常重要的一部分。
临床试验是指通过在人体中对新药物或疗法的安全性和有效性进行测试和评估的过程，而药物评价则是评估肿瘤药物在临床应用中的效果和副作用的过程。
本文将分别介绍肿瘤的临床试验和药物评价。
1. 肿瘤的临床试验肿瘤的临床试验是指通过科学方法和原则，在人体中对新药物、治疗方法或预防方法的安全性和有效性进行测试和评估的过程。
临床试验主要包括前期研究、临床试验设计、实施和结果分析。
（1）前期研究：在进入临床试验阶段之前，需要进行大量的前期研究工作。
这些工作包括理论研究、细胞实验、动物模型研究等，用于验证新药物的潜在疗效、毒副作用和药代动力学特性。
（2）临床试验设计：临床试验的设计非常重要，需要合理选择研究对象、药物剂量、观察指标和对照组等。
常见的临床试验设计包括随机对照试验、盲法和交叉试验等。
（3）实施和结果分析：在实施临床试验过程中，需要遵循伦理原则，确保研究对象的权益和安全。
试验结果的分析可以采用各种统计学方法，包括生存分析、荟萃分析和系统评价等。
2. 药物评价肿瘤药物评价是对肿瘤药物的临床应用效果和副作用进行评价的过程。
评价方法包括药理学评价、药效学评价和安全性评价等。
（1）药理学评价：药物的药理学评价主要研究药物在人体内的药代动力学特性、药物作用机制以及靶点选择等。
药理学评价包括药物的吸收、分布、代谢和排泄等方面的研究。
（2）药效学评价：药效学评价主要研究药物的治疗效果和副作用。
评价指标包括生存期、生存率、缓解率和生活质量等。
对于肿瘤药物评价，人体临床试验是最重要的评价方法。
（3）安全性评价：安全性评价主要研究药物的毒副作用和不良反应。
安全性评价需要通过观察临床试验中的不良反应、常见不良反应和罕见不良反应等来进行评价。
3. 临床试验与药物评价在肿瘤治疗中的意义肿瘤的临床试验和药物评价对于肿瘤治疗的进展和创新具有重要意义。
（1）临床试验可以评估新药物或治疗方法的安全性和有效性，为肿瘤患者提供更多治疗选择。
肿瘤药理学
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第1部分 肿瘤药理学的基础理论
第7章 肿瘤侵袭和转移 7.1 肿瘤侵袭和转移的基础知识 （1） 肿瘤侵袭(tumor invasion)
是指恶性肿瘤细胞离开原发生长部位，突破 基底膜和细胞外基质构成的屏障，侵犯毗邻的正 常组织，肿瘤侵袭的组织发生变性和坏死。侵袭 可分为两大类，即原发性侵袭和继发性侵袭。
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第2部分 抗肿瘤药物的药理作用
（2）主要抗肿瘤药理作用机制
应用一些激素或抗激素，体内激素平衡受到影响，使 肿瘤生长所依赖的条件发生变化，肿瘤的生长可因此受到 抑制，如性激素(包括雄激素、雌激素及孕激素)在生理剂量 时，可影响富含性激素受体的性分化组织，如乳腺、子宫 内膜及前列腺组织的生长，大剂量时可抑制这些组织所产 生的肿瘤的增殖。激素治疗有效的先决条件是肿瘤细胞上 具有激素受体，并肿瘤细胞的生长和繁殖在一定程度上受 激素控制，通过改变机体激素水平，有效控制肿瘤生长。
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第2部分 抗肿瘤药物的药理作用
10.3 激素类抗肿瘤药物 激素类药物即影响体内激素平衡的抗癌药物。
激素治疗目前已成为肿瘤治疗的重要手段，主要 用于治疗乳腺癌和前列腺癌。
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第2部分 抗肿瘤药物的药理作用
（1）激素类抗肿瘤药物的分类
①糖皮质激素：泼尼松、泼尼松龙等。
②雌激素：己烯雌酚、雌莫司汀等。 .
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第1部分 肿瘤药理学的基础理论
第8章 血管生成与肿瘤 8.1 血管生成的基础知识
是指源于已经存在的毛细血管和毛细血管后静 脉的新生毛细血管生成。
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抗肿瘤药物实验法
第1节 肿瘤细胞体外筛选方法
一、抗肿瘤药体外方法
动物模型在抗肿瘤药物的评价中起重要的 作用，但动物模型费用高，周期长使其不适 合大规模的抗肿瘤药物评价。因此抗肿瘤药 初步筛选首先应采用肿瘤细胞体外实验方法， 既节约成本又节省时间。
1.MTT法 【基本原理】活细胞线粒体中存在的脱氢酶能够 代谢还原黄色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2） -2，5-二苯基四氮唑（MTT）为蓝紫色的甲臜； 而死细胞此酶消失，MTT不被还原。 用DMSO溶解甲臜后，570nm处酶标仪测定其吸光 度（OD值）。 OD值与活细胞数成正比，因此可 根据 OD 值推测出活细胞的数目，了解药物抑制 或杀伤肿瘤细胞的能力。
• 【操作步骤】
（1）0.25%胰酶消化对数生长期细胞，5%～10%NBS的RPMI 1640调细胞浓度50000个/ml。96孔板100ul/孔。设溶剂 对照，每组 3-6 平行孔。 37℃， 5%CO2 、 95% 空气的培养 箱中预培养24h，弃上清。 （2）加药物5个10倍稀释的浓度（溶剂常用的有二甲亚砜 和水)，通常为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。 （ 3 ）细胞连续培养 24 ～ 72h ，每孔加入 10μ l 5mg/ml 的 MTT溶液（以无血清培养基配制），继续培养4h。 （4）吸去上清。加入200μ l DMSO，轻轻振荡以使甲臜完 全溶解。570nm处用酶标仪测定OD值。 （5）计算抑制率(%)=（对照OD-药物OD）/对照OD*100%
（ 2 ）软琼脂集落形成：适用悬浮和贴壁生长细胞。
1）计数对数生长期细胞，15% NBS培养液配成1000个/ml细 胞悬液，37℃温育。 2）取33～35mm培养皿，3复皿，加受试药20μ l。 3）取37℃新鲜培养液9份，加沸水浴中融化的5%琼脂液1份， 摇匀，加入平皿，每个1ml，混匀置室温使琼脂凝固。 4）取预温的细胞悬液按每9.4ml加5%琼脂液0.6ml的比例混 匀，加入已铺底层琼脂的平皿中，每个1ml，置室温使琼 脂凝固。 5）将平皿置5%CO2，37℃孵育箱中培养7～10天。 6）镜下计数直径大于75μ m（50个细胞以上）的集落。
完整版抗肿瘤药物药效学试验方法及指导原则
完整版抗肿瘤药物药效学试验方法及指导原则一、引言抗肿瘤药物药效学试验是评价抗肿瘤药物作用与效果的重要手段。
其目的是通过药理学与临床学相结合的方法，全面评价药物的抗肿瘤活性、药理学特性、副作用及安全性。
本文将介绍完整版抗肿瘤药物药效学试验方法及指导原则。
二、试验设计1.实验动物的选择实验动物应根据药物作用机制、药物毒性及效果评价指标来选择。
常用的实验动物有小鼠、大鼠、禽类等。
对于一些特殊类型的癌症，可使用转基因小鼠模型进行研究。
2.药物给药途径和剂量选择药物给药途径应根据药物的理化性质和目标靶区来选择。
常用的给药途径有经口给药、腹腔注射、静脉注射等。
药物剂量的选择应根据药物的毒性和治疗效果来确定，常采用多剂量组合实验设计。
3.观察指标的选择观察指标应包括药物的抗肿瘤活性指标和毒性指标。
常用的抗肿瘤活性指标有肿瘤体积抑制率、生长延缓时间、生存期延长等。
毒性指标包括体重变化、脏器毒性、血液学指标等。
三、实验步骤1.药物制备和给药药物应按照实验设计的要求制备，并以适当的剂量给予实验动物。
给药过程中要控制好给药途径和剂量，确保药物的有效吸收和分布。
2.肿瘤模型建立根据不同的实验目的和要求，可选择裸鼠移植瘤模型、体内免疫相关模型等建立肿瘤模型。
3.观察药物治疗效果按照药物治疗时间和剂量进行观察，在一定时间段内记录肿瘤体积的变化、瘤内细胞的凋亡情况等。
同时，使用电子显微镜、荧光染色等技术观察药物的作用机制。
4.毒性评价观察实验动物的体重变化情况、脏器是否受损、血液学指标是否异常等，评价药物的毒性。
5.统计分析对实验结果进行统计分析，包括平均值、标准差、t检验、方差分析等方法，以确定药物的治疗效果和毒性。
四、指导原则1.伦理原则药效学试验应符合伦理原则，保护实验动物的权益，确保试验的安全性和可行性。
2.实验设计的科学性和合理性试验设计应具有科学性和可靠性，控制变量，确保实验结果的准确性和可重复性。
3.安全性评价药物的毒性评价应充分考虑人体安全性，确保药物的治疗效果和安全性兼顾。
抗肿瘤创新药物研究技术与方法
ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｈ ａ ｓ ｎ ｅ ｖ ｅ ｒ ｂ ｅ ｅ ｎ ｓ ｔ ｏ ｐ ｐ ｅ ｄ ． Ｉ ｎ ｒ ｅ ｃ ｅ ｎ ｔ ｙ ｅ ａ ｒ ｓ ， ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ｍｏ ｄ ｅ ｍ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｗａ ｓ ｗ ｉ ｄ ｅ ｌ ｙ ｕ ｓ ｅ ｄ， ｔ ｕ ｍｏ ｒ ｒ ｅ — ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｗａ ｓ ｇ ｒ ａ ｄ ｕ ａ ｌ ｌ ｙ ｔ ｈ ｏ ｒ ｏ ｕ ｇ ｈ ． Ａｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｕ ｓ ｅ ｏ ｆ ｃ ｏ ｎ ｔ ｉ ｎ ｕ ｏ ｕ ｓ ｕ ｐ ｄ ａ ｔ ｉ ｎ ｇ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｙ ｇ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ｅ ｄ ａ ｎ ｔ ｉ ｔ ｕ ｍｏ ｒ ｄ ｒ ｕ ｇ ｉ ｎ ｎ ｏ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ， ｏ ｂ ｖ ｉ ｏ ｕ ｓ ｌ ｙ ｈ ａ ｓ ｇ ｒ ｅ ａ ｔ ｓ ｉ ｇ ｎ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ ｂ ｒ ｏ ａ ｄ ｐ ｒ ｏ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｓ ．
中图分类 号 ： Ｒ ２— ０ ３
文献 标 识码 ： Ａ
文章编 号 ： １ ０ ０ ８ ）８ ４ ０ ５ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ６ － １ ４ ２ ４ ）３ ４
肿瘤学药理学的研究进展
肿瘤学药理学的研究进展近年来，肿瘤学药理学领域取得了许多重要的研究进展。
药理学是研究药物如何在生物体内起作用的科学，而肿瘤学药理学则关注于药物在肿瘤细胞中的作用机制以及抗癌药物的研发。
本文将介绍一些肿瘤学药理学的最新研究进展。
1. 肿瘤微环境的研究肿瘤微环境是指肿瘤细胞周围的组织和细胞环境，包括肿瘤细胞、免疫细胞、血管、纤维细胞等。
近年来，研究人员通过对肿瘤微环境的深入研究，发现该环境对肿瘤的形成和发展起着重要作用。
针对肿瘤微环境的研究为开发新的针对性药物提供了理论依据。
2. 免疫检查点抑制剂的研究免疫检查点抑制剂是一类新型的抗癌药物，通过恢复免疫系统对肿瘤的识别和攻击能力，来治疗肿瘤疾病。
近年来，免疫检查点抑制剂在肿瘤学药理学领域取得了突破性的进展。
这类药物已经成功用于治疗多种肿瘤类型，包括黑色素瘤、肺癌等。
其研究成果为肿瘤免疫治疗开辟了新的途径。
3. 基因编辑技术在肿瘤治疗中的应用基因编辑技术是一种用于修改生物体遗传信息的先进技术，近年来在肿瘤学药理学中得到广泛应用。
通过基因编辑技术，研究人员能够精确改变肿瘤细胞的基因组，进而调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力。
这一领域的研究成果为个体化治疗和精准医学提供了新的思路。
4. 组织芯片技术的发展组织芯片技术是一种将多个不同组织或细胞培养在芯片上的技术，通过这种技术，研究人员可以模拟出肿瘤细胞在体内的生长环境，进一步研究肿瘤的发生机制和治疗方法。
组织芯片技术的发展为肿瘤学药理学的研究提供了新的工具和平台。
5. 人工智能在药物筛选中的应用人工智能技术在肿瘤学药理学中的应用越来越广泛。
通过建立大规模的数据库和使用机器学习算法，研究人员可以高效地筛选出具有抗肿瘤活性的化合物，并预测药物的药效和毒副作用。
这一领域的研究进展为药物研发提供了新的方法和理论支持。
总结起来，随着科学技术的不断进步，肿瘤学药理学领域取得了许多重要的研究进展。
肿瘤微环境的研究、免疫检查点抑制剂、基因编辑技术、组织芯片技术和人工智能在药物筛选中的应用等方面的研究成果为肿瘤学的发展和抗癌药物的研发提供了理论基础和实验支持。
抗肿瘤药物评价技术
体外抗肿瘤活性试验
美国NCI抗肿瘤药物体外筛选使用的60种人类细胞
白血病（6株）：CCRF-CEM、HL-60、K562、MOLT-4、RPMI-8226、SR 肺癌（9株）：A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322、 MNCI-H460、NCI-H522 乳腺癌：BT-549、HS578T、MCF-7、MCF-7/ADR、MDA-MB-231、ATCC、 MDA-MB-435、MDA-N、T-47D 卵巢癌：IGROV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3 肾癌：786-0、A498、ACHN、CAKI-1、RXF-393、SN12C、TK-10、UO-31 前列腺癌：DU-145、PC-3 中枢神经系统肿瘤：SF-268 、SF-295 、SF-539、 SFB-19 、SFB-75、U251 黑色素瘤：M14、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、 UACC-257、LOCIMV
体外抗肿瘤活性试验
注意事项
体外筛选其他方法：MTS法、刃天青法 以线粒体为作用靶点的受试物不宜采用四氮唑盐还原法 溶媒对照组与阴性对照组比较，OD值应在±5%，且无统 计学差异 应考虑到受试物在水溶液中的稳定性，比如环磷酰胺在水溶液 中的半衰期为3h 脂溶性的受试物常用DMSO助溶，但DMSO终浓度不低于0.1% 测出的OD值有事会出现假阴性（加MTT等染色剂时更换培养基）
体外抗肿瘤活性试验
生长曲线测定法
试验原理：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞 数的对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细 胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减 慢以致停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过 生长曲线反映出来 。 方法要点： 将浓度为10000个细胞/ml的对数生长期细胞悬液按每瓶5ml 种至25ml的培养瓶，或按每孔100微升种至96孔板，并加受试样品适量， 培养后分别于即刻和1、2、3、4、5、6、7d进行检测。前者可采用台盼 蓝染色计数活细胞，后者可采用MTT法或SRB法读取OD值，并据此进行 作图与计算。 观测指标 1、倍增时间(TD),将实际生在曲线进行直线回归求出0和t时刻 的理论细胞数N0和N t，据此计算：TD=0.301t/（log N t—log N0）；2 增殖细胞杀伤率（%）=( N0—N0’)/ N0×100%；3 细胞生长饱和密度 （N s），代表高坪期每毫升细胞数的均数。
肿瘤药理实验方法
●人体肿瘤动物体内移植模型的建立 ●实体瘤动物体内移植模型的建立 ●非实体瘤动物体内移植模型的建立
移植性动物肿瘤模型
实体瘤动物体内移植模型的建立
●主要特点
小块瘤体接种法
●接种方法 肿瘤细胞悬液接种法
培养细胞动物体内移植法
●瘤体测量方法
实体瘤动物体内移植模型的
主要特点
1.一群动物同时接种等量同种癌细胞，肿瘤生 长速度比较一致，个体差异较小；
瘤块，剔除其他组织后称重。若对照组小鼠肿瘤
平均小于1g或20%小鼠的瘤重小于400mg，表 示肿瘤生长不良。在治疗期间给药组小鼠死亡率 大于20%或平均体重下降 (自身对照)超过15%者， 表示药物毒性反应，应适当减量重复试验。
比较试验组与对照组瘤重的差异，按下列公式 计算肿瘤抑制率。
肿瘤抑制率＝
对照组瘤重－给药组瘤 对照组瘤重
在无菌条件下操作。
肿瘤细胞悬液接种注意事项
1.研磨方向及转速 制备肿瘤细胞悬液时，在人工研磨时必须使
研磨杆向同一方向转动，不可反向交替研磨，防 止磨破肿瘤细胞；如果采用电动研磨，一定要控 制好转速，以免破坏完整的肿瘤细胞。 2.细胞数
细胞数多少适中，如果瘤细胞数过多，接种 后瘤体生长过快，不便于药物作用的观察；瘤细 胞数过少，会导致接种失败，接种部位不能形成 肿瘤。接种失败后再在原动物体内重新接种也难 成功，必须重新更换动物。（为什么？）
MD＝ A B C ×100% 3
MD为肿瘤平均直径；A、B、C为实体肿瘤3 个相互垂直的直径，一般用毫米为单位。由于测 量的厚度包括皮肤在内，故瘤体越小，产生的误 差也就越大。注意由同一实验者测量。
动物肿瘤体内实验方法
移植性动物肿瘤模型
中药抗肿瘤药理常用的技术和方法
中药抗肿瘤药理常用的技术和方法
中药抗肿瘤药理研究的常用技术和方法包括以下几个方面：
1. 体外细胞实验：通过体外培养的癌细胞株，使用中药提取物或纯化组分进行处理，评估其对肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等方面的影响。
常用的实验方法包括MTT法、流式细胞术、细胞凋亡检测等。
2. 动物模型研究：使用小鼠、大鼠等动物建立肿瘤模型，在给药后观察肿瘤生长的变化，并通过病理学、免疫组织化学等技术手段评估中药对肿瘤的治疗效果。
常用的动物模型包括移植瘤模型和转基因小鼠模型。
3. 分子生物学方法：通过PCR、Western blot、Real-time PCR等技术，研究中药对肿瘤细胞信号通路、基因表达、蛋白质水平的调控作用，以及对肿瘤相关的细胞周期、凋亡、血管生成等关键过程的影响。
4. 药物代谢动力学研究：通过药代动力学方法，评估中药在体内的吸收、分布、代谢和排泄情况，揭示中药抗肿瘤作用的药理学基础。
常用的技术包括药物浓度测定、药物动力学参数计算等。
5. 分子影像学研究：利用核磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）等分子影像学技术，观察中药对肿瘤的影响，如肿瘤体积、代谢活性的变化等。
6. 组织病理学分析：通过组织切片染色、免疫组织化学等技术手段，观察中药对肿瘤细胞形态学、组织结构的影响，以及对血管生成、免疫细胞浸润等指标的调节作用。
以上所述仅为中药抗肿瘤药理研究中的常见技术和方法，实际研究过程中还可根据具体需要选择其他适合的技术手段。
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第七节 肿瘤药理实验方法与技术肿瘤药理实验方法无外乎体内和体外实验两种。
从实验目的上看，又可以分成抗癌作用和抗癌作用机制研究两种。
一、抗癌作用研究（一）体外实验法：用培养的肿瘤细胞系进行。
1、噻唑蓝（MTT ）法 在培养的活细胞线粒体中与NADP 相关的脱氢酶可将黄色的四氮唑（MTT ）催化成不溶性的蓝紫色的甲替，将甲替用二甲基亚砜（DMSO ）溶解后，利用酶标仪（试验波长570nm ，参比波长450nm ）测定光密度值，按照公式实验组光密度值肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1 - ）×100%对照组光密度值计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。
用系列浓度的药物可制作肿瘤细胞生长抑制率的量效曲线。
2、染料排斥法 本方法是根据活细胞具有排斥某些染料的功能，而死细胞因胞膜破坏而易于被染料着色的原理，在培养的对数生长期的细胞悬液中加入伊红、台盼蓝、或苯胺黑等染料，在室温下放置5分钟后，在15分钟用血球计数板计数200个细胞。
根据公式未染细胞数活细胞率（%）= ×100%细胞总数3、生长曲线法 本方法是根据肿瘤的Gompertzian 生长曲线而设计。
培养的肿瘤细胞在初期为指数增殖期，随着细胞密度的增加，因代谢产物的积聚和营养物质的消耗，增殖趋于减缓乃至停止，进入所谓的平台期。
在培养后的的即刻、1、2、3、4、5、7天的细胞，用台盼蓝染色，细胞计数，然后取细胞对数对培养时间作图可获细胞生长曲线。
1）将生长曲线外延至Y 轴可获得截距No`，用公式%100No No`-No ⨯=对增殖细胞的杀伤力计算药物对增殖细胞的杀伤力（No`是对照组的的截距）2）用Nt 代表接种后t 小时的细胞数， 用公式TD = 0.301t / logNt - LogNo计算药物对细胞增增时间（TD ）的影响。
3）取平台期每毫升的细胞均数，比较细胞生长的饱合密度（Ns ）。
4、集落形成法 本方法利用分裂≥6代以上的克隆原单细胞子细胞可形成集落成簇（每簇细胞数＞50）的能力，比较药物对单个肿瘤细胞增殖能力的影响。
本方法有贴壁法和半固体培养法两种。
1）贴壁法需要选用贴壁生长的细胞，按500细胞/ml的浓度接种到35mm培养皿中，培养后弃去培养基，用瑞氏-姬姆萨染色后，在20×解剖显微镜下计数含有50个细胞的细胞集落。
2）半固体软琼脂培养法取对数生长的细胞，用含小牛血清的培养液稀释成1000细胞/ml的悬液；溶化5%的琼脂液，并按1：9的比例与含小牛血清的新鲜培养液混合，倒入35mm 培养皿（1ml/皿），室温下待琼脂凝固，取0.94ml的细胞悬液，加0.04ml的5%琼脂, 加到已制备的琼脂平皿中，室温下凝固。
移入培养箱培养。
在16×解剖显微镜下计数直径大于75μm的细胞集落。
以集落形成抑制百分率对对数剂量作图，可得“S”型曲线，从曲线上求取半数抑制浓度IC50；以集落的存活分数与剂量作图，可获得克隆原细胞存活曲线，方程为S=1-(1-e-D/Do)n，S为存活分数，D 为剂量，Do为存活分数每下降1/ e时所需的药物剂量，n为外推值。
Do越小，药物的杀伤力越大，N越大杀死细胞的药物剂量越大。
5、硫化若丹明B法（SRB）法硫化若丹明（sulforhamine B）呈粉红色，溶于水，可与生物大分子的碱性氨基酸结合，这种结合物在波长515nm时的读数与细胞表现出良好的线性关系，可用于细胞的定量。
测试的细胞先用TCA固定，去除固定液，加入SRB，室温下静置，然后去除未结合的SRB，用非缓冲tris碱液溶解结合的SRB，在自动化分光光度平板读数仪（515nm波长）测定OD值。
可根据下述公式计算:T - T0生长率（%）= ×100%C - T0C、T和To分别为对照组细胞，为给药组细胞，另外的对照平板加药时的细胞的OD值。
T - T0杀伤率(%) = ×100%TT - T050%生长抑制所需的药物浓度(GI50) = ×100%C - T0T - T0杀死50%细胞所需的药物浓度(LC50)= ×100%T0(二) 在体试验法1、小鼠白血病L1210 系用甲基胆蒽诱发DBA/2小鼠而得。
取接种于DBA/2小鼠第6～7天之腹水，制成细胞悬液，每只小鼠（DBF1或CDF1）腹腔接种活细胞1×105，观察体重变化，计算平均存活时间T/C（T--治疗组存活时间，C--对照组存活时间）。
T/C大于125%，并可重复，认为有抗癌活性，T/C大于150%，并可重复，认为具有显著活性。
2、大鼠Walker-256瘤本瘤细胞接种在皮下或肌肉成为实体瘤，接种于腹腔则成为腹水瘤。
取Walker-256瘤体制成瘤细胞悬液，按106个细胞接种于大鼠大腿肌肉。
计算瘤重和T/C。
重复实验T/C≤42%，认为有活性。
3、Lewis 肺癌是一个在C57BL/6小鼠上发现的自发性肺内未分化的上皮样癌。
该癌细胞恶性程度高，皮下、肌肉接种对药物的敏感性低，但可向肺转移，静脉接种可在肺形成瘤集落。
方法是取接种于C57BL/6小鼠肌肉或腋窝皮下的13～15天的Lewis肺癌，制成细胞悬液接种2×106个细胞于BDF1小鼠皮下或腹腔内，12天后处死动物，作皮下接种者直接摘取肿瘤称重，作腹腔接种者，将双侧后肢从髋关节处剪下，荷瘤肢重减去正常肢重即为瘤重。
重复实验T/C≤42%为有活性。
二、抗癌作用机制研究（一）药物作用周期特异性研究进行药物作用细胞周期性实验必须首先制备同步化的细胞，常用的体外培养细胞同步化的方法有机械振荡法、双胸苷同步法、含羞草氨酸俘获法和离心洗脱法。
1、机械振荡法机械振荡法分离同步化细胞是基于单层贴壁生长的细胞在进入有丝分裂期时, 胞形变圆，松散地附在支持物上，利用摇晃或拍击培养瓶可以剥离出这些细胞，利用此方法可以得到较纯的M 期细胞。
双胸苷同步法的原理是先以高浓度的TdR处理细胞，使细胞内的dTTP升高，后者抑制CDP 向dCDP的转变，DNA复制受阻，S期细胞停滞在S 期，其它期细胞积聚在G1/S边界；撤TdR，让原处于S期的细胞完全越过S期，再给予TdR，让越过S期的细胞进入G1/S边界，然后撤去TdR，让细胞重新生长，同时进入S期。
因此，本方法可以得到较纯的S期细胞。
2、含羞草氨酸俘获法含羞草氨酸可将细胞集结于G1/S边界，阻止细胞进入S期。
在撤除含羞草氨酸后，细胞可同步进入S 期。
3、离心洗脱法离心洗脱法的原理是进入细胞周期的的体积呈线性增加。
G1期细胞体积最小，离出口最近而被最先洗出。
G2/M细胞体积最大离进气口最近而被后洗出。
在上述同步化处理尚需配合以同步化程度的检测，检查的方法有两种：流式细胞光度技术和放射性同位素技术。
前者通过测定细胞的荧光强度来定量细胞的DNA量；后者则利用测定掺入到DNA中的3H-胸苷（3H-TdR）或溴脱氧尿苷（BrdU）的量来获知处于S 期的细胞量。
（二）药物抗微管作用利用微管蛋白在37℃聚合，在冰浴上解聚的特点，测定微管蛋白或微管液的OD值，分别获得S型的聚合曲线和倒S型的解聚曲线，比较药物对曲线的影响，用下式计算抑制率。
实验组光密度值抑制率（%）=（1 - ）×100%对照组光密度值（三）药物与DNA结合能力检查吸收光谱移动法原理是DNA与药物形成复合物后吸收光谱发生改变，吸收峰产生位移，位移波长随DNA/ 药物复合物的量增加而增加。
利用紫外分光光度计进行紫外吸收光谱扫描，可观察到这些改变。
荧光光谱移动法原理是在激发光的激发下，DNA-药物复合物的荧光发射光谱发生改变，谱峰向短波方向移动，荧光强度增强，同时激发光谱说发生改变。
用荧光分光光度计测定激发光谱和发射光谱可观察到这些变化。
（四）药物造成的DNA损伤彗星（Comet）微凝胶单细胞电泳法正常的DNA为负超螺旋结构，在pH<9.0时以双链形式存在, 在pH>12.0时则完全解链。
DNA受损后链断裂, 成为一个松散的结构, 在电场的作用下,松散的DNA离开细胞核向正极移动, 形成彗星似的拖尾,变换不同pH缓冲液可检测断裂的是双链还是单链。
碱洗脱法收集细胞于滤膜上，用细胞溶解液裂解细胞并洗去RNA和蛋白质，暴露DNA，用洗脱液进行洗脱，若DNA发生链断裂，则易于经滤膜洗出。
（五）药物对DNA拓扑异构酶的影响DNA拓扑异构酶是调节DNA空间结构的动态变化的关键性核酶，分成拓扑异构酶I 和II，抑制拓扑异构酶I可以造成DNA的单链断裂，抑制拓扑异构酶II，可造成双链断裂，进而干扰DNA的复制、重组和基因表达。
实验的原理是用从肿瘤细胞核提取的拓扑异构酶II处理PBR322DNA，后者是一种质粒DNA，主要存在有超螺旋、缺口状和线性DNA三种形式，琼脂糖电泳上显示出三条带，在拓扑异构酶的作用下超螺旋DNA解旋、断裂，电泳时超螺旋带减弱或消失，相应的缺口环状或线性DNA增加。
如果药物对拓扑异构酶具有抑制作用，则可见超螺旋带保留。
此方法亦可改进为观察药物对拓扑异构酶功能的促进和抑制作用。
方法是选定不能使一定量DNA完全断裂量的拓扑异构酶处理PBR322DNA后电泳可见超螺旋带，同时加入不同浓度的药物，如果药物抑制拓扑异构酶，则超螺旋带增强，若药物增强拓扑异构酶活性，则见螺旋带减弱或消失。
（六）药物对细胞核酸代谢的影响DNA和RNA合成均需要特殊氨基酸，用同位素标记前体物如3H-TdR，3H-UR可分别掺入到细胞DNA 和RNA中去，用液闪法测定其同位素活性则可知细胞DNA和RNA 的合成情况。
（七）药物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用细胞凋亡是一种受基因调控的细胞程序性死亡过程，细胞凋亡时表现为细胞体缩小，染色质浓缩成大小不等的块状，并裂解为小片段。
DNA断裂长度为核小体核苷酸长度(180～200碱基对)的整倍数，提取后普通的琼脂糖电泳表现为特殊的云梯状，凋亡小体形成。
检查细胞凋亡的方法有：1、荧光显微镜的形态学检查该方法是利用凋亡细胞染色质浓缩，DNA广泛裂解的特征和荧光化合物可嵌入DNA分子或以静电相互作用与DNA分子结合的原理，建立DNA 的荧光探针。
常用的方法是用Hoechst33342和PI联合染色，然后在荧光显微下用紫外光激发。
凋亡的细胞对Hoechst33342具有高摄取比，加之染色质的高度浓缩，呈强蓝色荧光；正常细胞呈微弱荧光，坏死细胞则呈红色荧光（被PI染色）。
2、流式细胞光度术该方法的原理是用DNA结合性的荧光染料标记DNA，因为细胞发生凋亡时，内源性核酸内切酶降解、断裂DNA，断裂生成的小分子量DNA溢出细胞外，细胞内DNA总量降低，利用流式细胞光度术可以检测出DNA的这种结构和量的变化。
3、琼脂糖电泳分析法利用该方法可检测出呈云梯状的寡聚核小体。