基因工程的操作步骤

内含子： 不能够编码蛋白质的序列叫做内 含子
非编码区 编码区上游
启动子 与RNA聚合酶 结合位点
编码区
外显子
内含子
非编码区 编码区下游
终止子
真
核
外显子：能编码蛋白质的序列 编码区
细
内含子：不能编码蛋白质的序列
胞
的
基
非编码区 有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的
因
RNA聚合酶结合位点等。
结
构
复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
启动子：位于基因的首端的一段特殊 的DNA片断，它是RNA聚合酶识别 和结合的部位，有了它才能驱动基因 转录出mRNA，最终获得蛋白质
终止子：位于基因的尾端的一段特殊 的DNA片断，能终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞 中是否含有目的基因，从而将有目的 基因的细胞筛选出来
非编码序列：包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不同点 相同点
原核细胞
真核细胞
编码区是 _连_续___的
编码区是间隔的、 _不_连__续_的
都由能够编码蛋白质的_编__码_区__和具 有调控作用的__非_编__码_区组成的
思考
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核 细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
A.从基因文库中获取 B.利用PCR技术扩增 C.利用化学方法人工合成
一、目的基因的获取
（一）从基因文库中直接获取 1.基因文库：概念见P9
2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类
种 基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因 类 部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
3.基因文库的目的
前提： 一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合 成引物
利用PCR技术扩增目的基因
原理: DNA双链复制 前提: 要有一段已知 目的基因的脱 氧核苷酸序列， 以便合成引物。
过程
预变性（增加DNA变性的概率）
高温变性（解旋为单链）
低温退火（引物与单链互补结合） 适温延伸（在Taq酶的作用下合成
2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
蛋白质
mRNA
的氨基 推测的核苷
酸序列 酸序列
结构基因 推测 的核苷酸
序列
化学 合成
目的 基因
二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心
1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且 可以遗传给下一代，同时使目的基因能够 表达和发挥作用。
所需物质：
2、基因表达载体的组成：
归纳: 基因工程的百度文库本操作程序
1. 获取目的基因
从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成
2. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译
基因操作的基本步骤
基因操作的基本步骤
四、目的基因的检测与鉴定
检测:
是否插入目的基因（DNA分子杂交技术） 是否转录（mRNA分子杂交技术） 是否翻译（抗原—抗体杂交技术）
鉴定:
功能活性鉴定 抗性鉴定
分别提取什么进行检测
归纳步骤
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分 子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补 的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合 在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序 列的部位，仍然是两条游离的单链。
注意
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制 原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加 了目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到 DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的 化学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体 的方式携带进去。
与模板互补的DNA双链） 重复循环
2、具体过程
PCR(多聚酶链式反应)
3、人工合成的目的基因
1）反转录法：
以目的基因转录成的信 使RNA为模板，反转录成互 补的单链DNA，然后在酶的 作用下合成双链DNA，从而 获得所需的基因。
目的基因的mRNA 反转录
单链DNA (cDNA） 合成
双链DNA (即目的基因)
第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互 补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。
第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA 链降解，使之变成单链的DNA。
第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用 下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较
基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序
• 1.目的基因的获取 • 2.基因表达载体的构建 • 3.将目的基因导入受体细胞 • 4.目的基因的检测与鉴定
知识点一：1.原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游 启动子
编码区
非编码区 编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点
启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 没有启动子，基因就不能转录。
三、将目的基因导入受体细胞---植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
易感染双子叶植物和裸子植物，对 大多数单子叶植物没有感染能力
将目的基因导入受体细胞---动物细胞 显微注射法
将目的基因导入受体细胞---微生物细胞 Ca2+处理
使细胞处于一种能吸收周围环境中的 DNA---感受态细胞
知识点二.基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细 胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、获取目的基因
目的基因主要是__编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因__
1.获取目的基因的途径
A.从自然界已有的物种中分离
B.人工合成
2.获取目的基因的方法
非编码区
①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白 质。
②有调控遗传信息表达的核苷酸序列， 在该序列中，最重要的是位于编码区 上游的RNA聚合酶结合位点。
知识点一：2.真核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游
编码区
非编码区 编码区下游
启动子
与RNA聚合酶 结合位点
外显子
内含子
终止子
外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子
2、利用PCR技术扩增目的基因
概念：PCR全称为__聚__合__酶__链__式__反_应__，是一项在生物体__外__复制 特__定_D_N_A_片__段__的核酸合成技术
原理： DNA复制
条件： 模板DNA( 需含有目的基因 ) 四种脱氧核苷酸(dNTP) 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） Mg2+(激活剂) 缓冲溶液 一对引物：一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移 动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。
RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录 然后脱落)
非编码区 编码区上游 启动子
编码区
非编码区 编码区下游 终止子
原核 细胞 的基 因结
构
编码区 能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质
为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的 目的基因。
4.获取目的基因的根据： 见课本P9
5.基因文库的构建方法之一 （1）直接分离法(鸟枪法)
提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶切
一定大小的DNA片段 将DNA片段与载体连接
导入受体菌中储存
基因组文库
5.基因文库的构建方法之
cDNA合成过程