分子克隆及细胞培养基本实验方法

分子克隆及细胞培养基本实验方法

1.载体构建实用操作技术

1.1菌种的保存一20%甘油菌

2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20C或-70 C备用。（甘油菌中甘

油的浓度为20-30%均可）

1.2甘油菌复苏、培养

方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种）,37 C培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp

的LB液体培养基中，37C振荡过夜（约12~16小时）。

方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，

37 T振荡过夜（约12~16小时）。

1.3 小规模制备质粒DNA （QIA miniprep kit ）

适于从1~5ml菌液中制备20ug高拷贝质粒

⑴收集菌液，离心1000rpm，1分，弃上清

⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase）

⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免

长时间消化）

⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm

⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之

⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒

⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分

⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37 C预热），离心1分。

1.4酶切反应

⑴体系构成（反应体系尽可能小！）

pGEM3ZF-huCTLA4-Ig (ul) pAdTrack-CMV (ul)

① dd.H20 ② 10X NEbuff 2 3 ③ 10X BSA 3 ④ 底物DNA 5 ⑤ 内切酶 Hi nd 川

1 Xba I

1 Total : 30 ul

30ul

⑵37C 水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至

12小时

⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65 C 灭活内切酶 ⑸-20 C 保存备用

1.5 回收目的片段(QIAquick Gel extraction Protocol )

⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重；

⑵加入适量buff QG (300ul QG /100mg 胶)；＞2%的胶，应加大 QG 用量(600ul QG

/100mg )；

⑶水浴50 C, 10min ，每2-3min 混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完

全溶解后混合物颜色应为黄色，与

buff QG 相似；

⑷当DNA 片段在＜500bp 或＞4kb 时，应加入异戊醇100ul/100mg 胶，以提高产物 量。

此步不离心。DNA 片段在500bp~4kb 时，加入异戊醇并不能提高产量；

⑸ 结合：将混合物转入 QIAquick 柱，离心13000rpm ，1min ；(柱容量 800ul/次)； ⑹洗：0.75ml buff PE ，离心13000rpm ，1min ； ( DNA 用于盐敏感操作时，如平

端连接、直接测序，加入 PE 后静置2-5min )；弃离心液，再离心 13000rpm ，

1min ，以去除剩余的乙醇；

⑺将QIAquick 柱置于一清洁的 1.5ml Ep 管，加入 30~50ul buff EB 或 出0 (滴 于

QIAquick 膜上！)，静置 1min ，离心 15000rpm ， 1min ；

⑻-20 C 保存备用。

17 17 3 3 5 1 1

1.6连接反应

反应组份数量（ul）

①dd.H20 8

②T4 10X buff 2

③载体DNA（ul） 1

目的片段（ul）8

④T4DNA连接酶 1

Total : 20 ul

⑵16C水浴12-16小时（过夜）

⑶直接用于转化或-20 C保存备用

1.7感受态细胞的制备

⑴ 菌种10-20ul入5ml LB液体培养基（不加Amp）, 37C振摇4-6 hr，至中对数期；

⑵菌液冰浴10min，分装2管，离心（4 C, 4 000-6 000rpm ）收菌；

⑶弃上清，将菌体悬浮于800ul 0.1M CaCb （冰预冷）中，冰浴10min，离心

（4C，4000-6000rpm ）;

⑷ 再将菌体悬浮于200ul 0.1M CaCb （冰预冷）中，冰浴，12-24hr可用。菌体沉

淀时，重悬操作要轻。

1.8转化

⑴新鲜感受态细胞200ul，加入2-10ul连接产物，轻轻旋转混合，冰浴30-60min ;

⑵42C热休克90sec,勿摇动试管，再冰浴2min ；

⑶加入液体LB培养基（无抗生素）800ul，37 C温和振摇45-60min ;

⑷离心4000-6000rpm，2min，弃去900ul 上清；

⑸剩余物重悬细菌，铺Amp板，平放20min，倒置培养10-14hr。

1.9鉴定重组子

常规PCR法鉴定重组子（25ul反应体系，1ul菌液）或抽提质粒DNA酶切鉴定。

⑴PCR反应体系:

试剂数量终浓度

① dd.H2O 17.5 ul

②10x PCR缓冲液 2.5 ul 1 x

③ MgCI2 (25mM ) 1.5 1.5 mM

④ dNTPmix(2.5mM) 1 ul 50uM

⑤上游引物(25pmol/ul ) 0.5 ul 0.5uM

下游引物(25pmol/ul ) 0.5 ul 0.5uM

⑥TaqDNA 聚合酶(3U/ul) 0.5 ul 0.06U/u

l

⑦模板(菌液) 1ul

终体积25ul

⑵PCR反应参数：

94°C, 5min ;

“94C, 30sec、50 C, 30sec、72 C, 1min ” x 20-30 循环；

72 C, 6min ;

4 C,保存备用；

⑶电泳鉴定，以挑选阳性重组子，注意阳性、阴性对照的设立。

2.大规模制备质粒DNA( QIAGEN Plasmid Maxi Protocol )

适于从100~250ml菌液中制备100-200 ug高拷贝质粒

⑴涂板挑取单克隆菌落，入LB选择性培养基，37 C振摇8hr后，取适量菌液

(1/500-1/1000 )入100-250ml LB 选择性培养基(高拷贝100-250ml LB，低拷

贝500ml LB ), 37 C 振摇12-16hr;

⑵收获菌液，4 C离心6 000rpm (6 000g )1 5min，弃尽上清；

注意：在此步可将菌(离心沉淀)冻存于-20 C,留待以后操作。

⑶以10ml P1重悬细菌(P1中已加RNase);

⑷加入10ml P2，颠倒4~6次轻混，室温放置5min (轻混以免剪切基因组DNA , 并免长

时间消化)；

⑸加入冰预冷10ml P3,迅速颠倒4~6次轻混，冰上放置20min，以促进沉淀形