生物化学-生化知识点_第十二章 基因工程

第十二章基因工程下册 P580

12-1 基因工程

是对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。核心是构建重组体DNA的技术。

一一一DNA克隆

将DNA限制酶切片段插入克隆载体，导入宿主细胞，经无性繁殖以获得相同的DNA扩增分子。

一1一DNA限制酶和连接酶：

限制酶可将DNA切割成平末端或黏性末端，互补黏性末端之间碱基配可促使连接反应容易进行。

相容的限制片段可用DNA连接酶相连接，DNA的黏性末端和平末端连接见P5

82 图40-1。

一2一分子克隆的载体与宿主系统：

载体：将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的运载工具。

克隆载体通常是由质粒、病毒（如λ-噬菌体）或一段染色体DNA改建而成。

质粒是染色体外自主复制的遗传因子，多为共价闭环DNA分子，常用作细菌与真菌的克隆载体。如用限制性酶切割环形质粒DNA，制备一个具黏性末端的

开环质粒分子。

作为克隆载体应具有自主复制能力，有易于筛选的选择标记，如含有抗药基因等。

宿主细胞应根据载体的性质来选定，应易于接受外源DNA，且易于生长和筛选。

一3一外源基因导入宿主细胞：

欲引入的外源目标DNA经限制酶切割后应与载体有同样的黏性末端，用连接酶将外源DNA片段和载体连接成外源基因。

用CaCl2等方法,使E. coli等宿主细胞处于感受态，从而将外源基因导入细胞。

此外还有电穿孔法等使外源DNA高效导入细胞。

最后分离筛选出带有目的基因的重组体并进行克隆（可按重组体某种特征，如抗药性选择、营养标记选择等在特定培养基上进行筛选后繁殖形成菌落。每

个菌落的细胞将含有同样的重组质粒DNA，这些质粒DNA又含有同样外源DN

A片段）。

一一一基因文库

一1一基因文库的构建： P589

基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。

理想情况下基因文库应包含该基因组的全部遗传信息。

基因文库的构建包括基因组DNA的随机片段化、载体DNA的制备、重组DNA 的体外包装、重组噬菌体感染大肠杆菌、基因文库的鉴定和扩增等步骤。

一2一cDNA文库的构建：

真核生物基因是断裂的，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。若将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（cDNA），接上原核生物表达

控制元件，在原核生物表达。

通过cDNA还可研究不稳定的mRNA。