普通PCR及测序PCR原理分解
pcr测序原理
pcr测序原理PCR测序原理。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，它可以在体外大规模复制DNA片段。
PCR技术的应用非常广泛，其中之一就是在测序中的应用。
PCR测序是通过PCR技术扩增DNA片段，然后对扩增产物进行测序，以获取DNA序列信息。
下面将详细介绍PCR测序的原理。
首先，我们需要了解PCR技术的基本原理。
PCR技术是通过酶的作用，在体外扩增DNA片段。
PCR反应需要一对引物（primers）、DNA模板、DNA聚合酶、四种核苷酸和缓冲液等组分。
引物是PCR反应的起始物，它们是由实验者设计合成的短链DNA片段，与待扩增的DNA序列互补配对。
在PCR反应中，引物与DNA模板结合，DNA聚合酶沿着引物合成新的DNA链。
通过PCR反应，可以在短时间内扩增出大量的DNA片段。
在PCR测序中，我们通常使用Sanger测序法。
Sanger测序法是通过DNA聚合酶合成DNA链的方式进行测序。
在PCR测序中，我们需要对PCR扩增产物进行测序，以获取DNA序列信息。
测序过程中，我们通常使用荧光标记的引物和特殊的测序试剂，通过测序仪器对DNA序列进行测定。
PCR测序的原理可以简单概括为以下几个步骤：1. PCR扩增，首先，我们需要利用PCR技术对待测序的DNA片段进行扩增。
在PCR反应中，引物与DNA模板结合，DNA聚合酶沿着引物合成新的DNA链，从而扩增出大量的DNA片段。
2. 准备测序反应，将PCR扩增产物与荧光标记的引物和特殊的测序试剂混合，准备进行测序反应。
荧光标记的引物可以在测序仪器中发出特定的荧光信号，用于测定DNA序列。
3. 测序反应，将混合好的PCR扩增产物和测序试剂放入测序仪器中进行测序反应。
在测序反应中，DNA聚合酶沿着荧光标记的引物合成DNA链，同时测序仪器记录下荧光信号。
4. 数据分析，最后，利用测序仪器记录下的荧光信号数据进行分析，得到DNA序列信息。
PCR技术及测序解析
Pacific BioscienceSMRTT
该测序也是基于边合成边测序的原理，这项技术使用ZeroModeWaveguide(ZMW)(零级波导)。测序的过程：被荧光标记磷酸基团 的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链结合（每种脱氧核苷酸被不用颜 色的染料标记），被激发出荧光，在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸集 团被切割并释放，聚合酶转移到下一个位置，下一个脱氧核苷酸连接到 位点上开始释放荧光脉冲，进行下一个循环。
基因测序技术
1.第一代：Sanger链终止法、Gilbert化学降解法
2.第二代：454、Illumina、 SOLiD
3.第三代：Helico BioScience Pacific BioscienceSMRTT
pcr种类和原理
PCR种类和原理引言聚合酶链反应（PCR）是一种基因分析技术，广泛应用于分子生物学领域。
通过PCR，可以在短时间内扩增一小段DNA序列，从而方便进行基因检测、DNA测序等相关操作。
本文将介绍PCR的种类和原理。
PCR的种类PCR根据特定的用途和反应条件的不同，可以分为以下几种不同类型：标准PCR标准PCR是PCR的最基本形式，包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将PCR反应体系中的DNA序列加热至高温，使其两个链解开。
然后，降温至一定温度，使引物（寡核苷酸）与DNA序列的两个链的末端结合。
最后，在合适的温度下，通过DNA聚合酶，使DNA序列的两个链延伸。
逆转录PCR逆转录PCR（RT-PCR）是一种将RNA转录成DNA的反应。
通过使用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后进行PCR扩增，可以更方便地研究RNA的表达和变化。
定量PCR定量PCR（qPCR）是一种用于测量DNA序列数量的PCR技术。
通过引入荧光探针或染料，可以实时监测PCR反应的进行，并据此计算目标DNA序列的起始数量。
数字PCR数字PCR是一种通过将反应体系分成多个小区域，并进行单分子级别的PCR扩增，实现对DNA序列的精确计数的方法。
长PCR长PCR用于扩增较长的DNA序列。
通常，标准PCR技术在扩增1000个碱基以上的DNA序列时表现不佳，而长PCR通过优化反应条件，可以扩增数千个碱基以上的DNA 序列。
PCR的原理PCR的原理基于DNA的复制过程。
PCR反应体系主要包括DNA模板、引物、DNA 聚合酶和反应缓冲液。
下面是PCR反应的基本步骤：1.变性：将反应体系加热至95°C，使DNA模板的双链解开。
此步骤中，DNA模板上的两个链会分离开，形成两个单链模板。
2.退火：降温至较低的温度，使引物与模板DNA的单链序列互补结合。
每个引物在目标区域的两端结合。
3.延伸：在适当温度下，DNA聚合酶开始将引物作为起始点，向外延伸合成新的DNA链，形成与模板DNA互补的两条新的DNA链。
《PCR详细讲解》课件
Oligo
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
Primer BLAST
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
逆转录PCR
《PCR详细讲解》
逆转录PCR的原理
由一条RNA单链转录为互补DNA （cDNA）称作逆转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR），由依 赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完 成。
《PCR详细讲解》
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
《PCR详细讲解》
24个核苷酸。 识别mRNA的3’端poly（A）尾，
因此仅mRNA可被逆转录。
《PCR详细讲解》
逆转录引物：
（3）特异性引物 能与目标RNA碱基序列互补的寡
核苷酸引物，仅产生待分析基因的 cDNA。
《PCR详细讲解》
半定量 RT-PCR
《PCR详细讲解》
基本概念
半定量RT-PCR（semi-quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是常用的一种简捷、特 异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增， 并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。
pcr原理及应用
pcr原理及应用PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，通过这种技术可以在体外合成大量特定DNA序列。
PCR的原理基于DNA的复制过程，在PCR过程中，需要一对引物（primers），引物的序列与目标DNA序列的两个端点相匹配。
PCR反应可以分为三个步骤：变性、退火和延伸。
首先，将DNA样本与引物、DNA聚合酶和dNTPs（脱氧核苷三磷酸）一起放入反应管中。
接下来，反应管中的温度升高至94-98℃，使DNA变性，即使其双链解开。
然后，温度降低至50-60℃，使引物与DNA序列互补配对，称为引物的退火温度。
最后，温度升高至72℃，此时DNA聚合酶开始在退火的引物上进行延伸合成新的DNA链，形成双链DNA。
PCR技术在许多领域都有广泛的应用。
第一，PCR可以用于基因分型及基因突变的检测。
通过设计特定的引物，可以选择性地扩增目标基因，并通过检测PCR产物的大小和序列来确定基因型或突变情况。
其次，PCR可用于基因工程和克隆。
通过PCR技术，可以从DNA样本中扩增出特定的DNA片段，然后将其插入到质粒或其他表达载体中，实现特定基因的克隆和表达。
另外，PCR也可用于DNA测序。
在测序反应中，需要将目标DNA进行PCR扩增，然后将PCR产物纯化，再进行测序反应。
通过PCR扩增，可以在测序反应中获得足够的DNA量，以确保测序的准确性和可靠性。
此外，PCR技术还可以应用于病原体的检测。
通过PCR扩增特定的病原体标记基因，可以在短时间内检测到病原体的存在，从而为疾病的诊断和治疗提供帮助。
总结来说，PCR技术具有高度灵敏性、高效性和广泛的应用范围。
它在基础研究、医学诊断、基因工程等领域发挥了重要作用，并为科学研究和临床应用提供了强有力的工具。
pcr测序原理
pcr测序原理PCR测序原理PCR测序是一种基于聚合酶链式反应（PCR）技术的DNA测序方法。
其原理是通过PCR扩增DNA片段，然后将扩增产物进行测序，从而得到DNA序列信息。
下面将详细介绍PCR测序的原理。
一、PCR扩增1.1 PCR反应体系PCR反应体系主要包括以下组分：模板DNA、引物、酶、缓冲液和dNTPs。
- 模板DNA：即待扩增的DNA片段。
- 引物：引物是一种短链寡核苷酸，通常由20个碱基左右组成，用于定向扩增目标DNA片段。
- 酶：PCR反应中使用的酶为聚合酶（polymerase），其作用是在每个循环中将单链模板DNA复制成双链DNA。
- 缓冲液：缓冲液用于调节反应体系的pH值和离子强度等参数，以确保反应能够顺利进行。
- dNTPs：即脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates），是构成新合成DNA链所需的四种单元之一。
1.2 PCR扩增过程PCR扩增过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
- 变性：在PCR反应开始时，将反应体系加热至94℃左右，使DNA 双链解开成两条单链。
- 退火：将温度降至引物的退火温度（通常为50-65℃），使引物与模板DNA结合成一个稳定的复合物。
- 延伸：将温度升高至聚合酶的最适工作温度（通常为72℃），聚合酶开始在引物的基础上扩增新的DNA链。
这个过程会一直持续到dNTPs用完或者达到设定的PCR循环次数。
1.3 PCR产物经过多轮PCR扩增后，可得到大量目标DNA片段。
这些产物可用于下一步的PCR测序。
二、PCR测序2.1 Sanger测序Sanger测序是最早被广泛使用的PCR测序方法。
其原理是通过在PCR反应中加入一种特殊的二进制核苷酸（dideoxynucleotide，ddNTP）来终止新合成链的延伸，从而得到不同长度的DNA片段，并通过电泳分离出这些片段。
根据片段长度和ddNTP种类可以推断出DNA序列信息。
PCR技术及测序
pcr技术的发展历程
1983年
Kary Mullis首次提出PCR技术的基本 原理。
1985年
Mullis和Cetus公司合作，实现了第一 次成功的PCR实验。
1987年
美国PE-Cetus公司推出了商业化PCR 仪，使PCR技术开始广泛应用于生命 科学研究领域。
1990年
美国PE-Cetus公司推出第一台自动 PCR仪。
测序分析
对PCR产物进行测序，获得目标基因的序列信息。
结果解读
对测序结果进行解读，分析基因变异、表达水平等信息。
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测序分析
对纯化的产物进行测序分析，以确定其序列。
结果解读
对测序结果进行解读，分析其与已知序列的 相似性和差异性。
04 测序技术概述
测序技术的定义
测序技术是指通过一定的方法测定生 物体内核酸的碱基排列顺序，从而分 析其基因型的过程。
测序技术是基因组学、遗传学和生物 信息学等领域的重要工具，对于生命 科学研究、医学诊断和治疗等方面具 有重要意义。
pcr技术及测序
目录
• pcr技术概述 • pcr技术的基本原理 • pcr技术的操作流程 • 测序技术概述 • 测序技术的基本原理 • 测序技术的操作流程
01 pcr技术概述
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
pcr技术的定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA片段 的核酸扩增技术，通过DNA聚合酶的催化，将模板DNA在一定 温度下进行变性、退火和延伸，完成DNA的扩增。
测序技术的反应过程
模板准备
提取待测DNA，进行纯化处理，获得高质量的模板。
引物设计
pcr测序原理
pcr测序原理1. 引言PCR（聚合酶链反应）是一种在分子生物学领域中广泛应用的技术，它可以在短时间内扩增DNA的特定片段。
PCR测序是一种基于PCR 技术的DNA测序方法，它通过PCR扩增出的DNA片段来确定DNA 序列。
本文将深入探讨PCR测序的原理及其在基因组研究中的应用。
2. PCR测序原理PCR测序是一种无模板法的测序方法，它利用PCR扩增DNA片段，然后通过测序仪器对扩增的片段进行测序。
下面将详细介绍PCR测序的原理。
2.1 PCR扩增需要设计一对引物，引物的序列应该与待扩增片段的两端序列匹配。
PCR反应涉及到三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将待扩增的双链DNA加热至95°C，使其变性成两条单链DNA。
将反应体系温度降低至55-65°C，引物与目标片段的互补序列进行配对，这一步骤称为退火。
在72°C的延伸步骤中，分别使用DNA聚合酶和四种核苷酸（dNTPs）扩增新的DNA链，形成DNA扩增产物。
2.2 扩增产物纯化在PCR反应结束后，扩增产物需要进行纯化。
纯化的目的是去除杂质和剩余的引物、核苷酸和酶等。
纯化的方法通常包括酶处理、柱层析或凝胶电泳等。
纯化后的扩增产物可以被用于后续的PCR测序实验。
2.3 PCR测序PCR测序需要使用测序仪器，测序仪器可以检测到每个扩增产物的碱基序列。
通常使用有效的荧光标记dideoxynucleotides（ddNTPs）来标记链终止。
在测序反应中，扩增产物会与引物和ddNTPs一起放入测序仪器中。
随着延伸的进行，当ddNTPs加入到新合成链中时，DNA链的扩增会终止。
由于每种ddNTPs都有不同的荧光标记，测序仪器会同时监测DNA链扩增的终止情况和发出的荧光信号，从而确定DNA序列。
3. PCR测序的应用PCR测序在基因组研究中有着广泛的应用。
下面将介绍PCR测序在以下几个方面的应用：3.1 基因突变检测PCR测序可以用于检测基因组中的突变，从而帮助研究人员了解突变与疾病之间的关系。
pcr实验知识点总结
pcr实验知识点总结PCR实验（聚合酶链反应）是一种在生物化学中广泛使用的分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。
该技术由Kary Mullis于1983年发明，并于1993年获得了诺贝尔化学奖。
以下是关于PCR实验的知识点总结。
一、PCR原理PCR的基本原理是利用DNA聚合酶对单链DNA进行复制的能力。
这个过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性：在高温（通常为95℃）下，双链DNA被解旋成两条单链模板。
2. 退火：温度降低（一般为50-65℃），引物与模板DNA的互补序列结合。
3. 延伸：在适宜的温度（72℃左右）和DNA聚合酶的作用下，引物沿着模板DNA向两侧延伸，形成新的双链DNA。
这三个步骤循环进行，每次循环都会使目标DNA的数量翻倍，经过几十到几百次循环后，就能得到大量的目标DNA。
二、PCR所需材料1. DNA模板：待扩增的目标DNA。
2. 引物：两段短的寡核苷酸，与目标DNA的两端互补。
3. dNTPs：脱氧核苷三磷酸，作为合成新链的原料。
4. Taq DNA聚合酶：能在高温下保持活性的酶，用于催化DNA的合成。
5. 缓冲液：提供合适的pH和离子环境。
三、PCR操作步骤1. 设计引物：根据目标DNA的序列设计出两条引物，分别与DNA的正反两条链互补。
2. 配制反应体系：将模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶和缓冲液按照一定比例混合。
3. PCR循环：将反应体系放入PCR仪中，设定好变性、退火和延伸的温度和时间，开始循环反应。
4. 产物检测：可以通过凝胶电泳等方法检测PCR产物的大小和数量。
四、PCR的应用1. 分子诊断：如病原体检测、基因突变检测等。
2. 基因克隆：将目的基因扩增后，可以方便地进行后续的克隆和表达。
3. 序列分析：通过扩增特定的基因区域，可以进行基因测序和SNP分析等。
4. 生物考古学：可以从古代样本中提取DNA并进行扩增，研究古生物的遗传信息。
五、PCR实验注意事项1. 引物设计：引物应具有良好的特异性和稳定性，避免产生非特异性扩增和二级结构。
PCR技术的基本原理和过程
PCR技术的基本原理和过程PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
它以DNA的复制过程为基础，通过重复的循环反应，迅速产生大量的目标DNA分子。
PCR 技术被广泛应用于基因测序、基因突变分析、疾病诊断等领域。
基本原理PCR技术基于DNA的双链结构和DNA聚合酶的酶活性。
在PCR反应中，需要的主要组成部分有：DNA样本、模板引物、核苷酸和DNA聚合酶。
PCR反应的每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1.变性（Denaturation）：将PCR反应液加热至95°C，使DNA双链解开，生成两条单链DNA。
2.退火（Annealing）：将反应液温度降至50-60°C，使引物与目标DNA序列发生互补碱基配对，形成引物-模板DNA复合物。
3.延伸（Extension）：将反应液温度升至72°C，在引物的引导下，DNA聚合酶开始沿着模板DNA的单链进行复制，合成新的DNA链。
通过循环不断地重复这三个步骤，可以迅速扩增目标DNA片段。
PCR反应的优化为了获得可靠的PCR扩增结果，需要对PCR反应进行优化。
以下是一些常见的PCR 反应优化策略：1.引物的设计：引物的设计是PCR反应成功与否的关键。
引物应具有互补碱基序列，且长度适当（一般为15-30个核苷酸）。
此外，引物的Tm值应相似，以确保在退火步骤时能够特异性结合目标DNA序列。
2.PCR反应体系的优化：PCR反应体系包括模板DNA、引物、核苷酸和酶。
适当调整这些组分的浓度可以提高PCR反应的效率和特异性。
3.PCR条件的优化：PCR反应的温度和时间也是关键因素。
合适的变性温度和时间可以使DNA完全解开；引物的结构可以在合适的退火温度下结合目标DNA；延伸的时间应足够长，确保DNA聚合酶复制目标DNA的完整长度。
PCR的应用PCR技术在科研和医学诊断领域具有广泛的应用。
下面是一些PCR的常见应用：1.基因测序：通过PCR扩增特定基因片段，可以进行基因测序，对基因序列进行分析，揭示基因的功能和作用。
PCR技术丨基本原理、各步骤目的、反应体系
PCR技术丨基本原理、各步骤目的、反应体系一PCR技术基本原理PCR是一种选择性体外快速扩增DNA片段的方法。
在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程，以拟扩增的模板DNA分子，与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4种dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系，经过重复地变性一退火一延伸三步，扩增新的目的DNA链，这个过程通过控制反应体系的温度来实现。
PCR包含下列三步反应：1、变性(denaturation)将反应体系混合物经加热至94℃左右，维持较短的时间，使双链DNA变成单链DNA，便于下一步引物的结合。
2、退火(annealing)将反应体系温度下降到特定温度（一般是引物的Tm值以下)，引物与DNA模板以碱基互补的方式结合，形成模板-引物杂交双链。
退火温度是保证引物与DNA模板互补结合的关键。
由于引物结构简单，加之引物量远远大于模板DNA的数量，所以DNA模板单链之间的互补结合很少。
3、延伸(elongation)将反应体系的温度上升到72℃左右并维持一段时间，在Taq DNA 聚合酶的作用下，以引物为起始点，以4种单核苷酸（dNTP）为底物，从5'→3'方向延伸反应，合成新的DNA双链。
以上三步反应为一个循环，重复进行变性、退火、延伸这三步反应，如此反复循环可以使DNA以指数形式进行扩增。
上述过程1.5小时左右完成，从而使所需的目的DNA片段扩增放大百万倍。
二PCR各步骤目的1、预变性破坏DNA中可能存在较难破坏的二级结构。
使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好地和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要省去这个步骤。
此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。
2、变性一退火一延伸循环(1)模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双徒DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备。
pcr实验原理和基本步骤
pcr实验原理和基本步骤PCR（聚合酶链反应）是一种体外的DNA复制技术，能够在小时级内扩增目标DNA片段，从而获得大量的DNA。
PCR由酶聚合酶、引物、DNA模板和适宜条件的缓冲液等组成。
其原理是通过循环性的反应过程，不断复制DNA模板，实现目标DNA的扩增。
PCR的基本步骤可分为以下几个步骤：1. 样品制备：将待扩增的DNA样品提取纯化，并定量测定其浓度。
合适的DNA 样品浓度对于PCR的成功至关重要。
2. 引物设计：根据目标DNA序列，设计合适的引物。
引物通常由18-25个碱基组成，具有反向互补性，并固定于待扩增的DNA的两侧。
3. PCR反应体系：准备PCR反应体系，其中包括DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液和适当的离子浓度。
还可以添加一些辅助试剂，如DNA胶原、DMF和BSA等，以提高PCR的效率和特异性。
4. 反应条件：PCR反应一般包括三个温度阶段：变性、退火和延伸。
变性阶段（94-96）使DNA双链解开，退火阶段（50-65）使引物与目标DNA序列结合，延伸阶段（72）使聚合酶合成新的DNA链。
5. PCR循环：将PCR反应体系置于热循环仪中，进行多次的PCR循环。
每个循环包括变性、退火和延伸，一个PCR循环的时间通常在2-5分钟之间。
6. 聚合酶链反应产物分析：PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳、定量PCR、测序等方法对PCR产物进行分析。
凝胶电泳可以根据DNA片段的大小，进行DNA分离和可视化。
PCR的原理是通过酶聚合酶将DNA在适宜条件下进行循环反应，不断复制DNA 模板。
主要分为变性、退火和延伸三个阶段。
1. 变性阶段：将PCR反应体系加热到94-96，使DNA双链解开成为单链DNA。
2. 退火阶段：降低反应体系的温度至50-65，使引物与目标DNA序列结合。
引物通常由18-25个碱基组成，具有反向互补性，并固定于待扩增的DNA的两侧。
3. 延伸阶段：将反应体系温度升至72，使聚合酶开始合成新的DNA链。
普通PCR及测序PCR原理分解ppt课件
4.对标本的纯度要求低： 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，
DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽 液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA 扩增检测
23
PCR常见问题
假阴性，无扩增产物
• 非特异性扩增 • 拖尾 • 假阳性
24
无扩增产物
现象：正对照有条带，而样品则无；
反应体系（50 ul）：
Taq酶
2.5 U
10x Buffer
5 ul
dNTP(2.5mM) 4 ul
DNA模板
0.1～2ug
上游引物(10P) 2 ul
下游引物(10P) 2 ul
H2O
补足至50 ul
总计
50 ul
反应流程（以扩增片段大小为
800bp为例）：
95℃ 95℃ 55℃ 72℃ 72℃ 4℃
5 min 30 s 30 s 1 min 5 min ------
30个 循环
21
PCR的特点
1. 特异性强 2. 灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能 将皮克(pg=10 - 12)量级的起始待测模板扩增 到微克(g=10 -6)水平 3. 简便、快速 PCR反应一般在2～4 小时完成扩增反应。扩 增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素， 无放射性污染、易推广
第3轮扩增（8）
第5轮扩增（32=25）
10
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 上下游引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
11
PCR反应条件
普通PCR及测序PCR原理课件
DNA模板质量
DNA模板的质量会影响PCR反应的效率和特异 性。
温度条件
PCR反应中的温度条件会影响DNA的解离和合 成过程。
酶的选择
不同的DNA聚合酶在PCR反应中的表现效果有 所差异。
常见的PCR变异形式
• 逆转录PCR • 长PCR • 多重重复序列扩增PCR • 特异性PCR
实时荧光PCR的应用PC源自反应体系PCR反应主要包括DNA模板、引物、酶和缺失核苷酸复合物。引物定向选择 DNA扩增的特定区域，而酶则在每个循环中催化DNA合成。
PCR反应步骤
1
变性
将目标DNA加热至高温，使其双链解离为单链。
2
引物结合
引物与目标DNA的末端序列互补，结合于单链DNA。
3
延伸合成
酶以引物为起始点，合成新的DNA链。
普通PCR及测序PCR原理课件
本课件将介绍普通PCR和测序PCR的原理，包括PCR的基本概念和反应步骤， PCR扩增的影响因素，以及测序技术的不同方法和应用。让我们一起探索这 两种重要的分子生物学技术的奥秘吧！
PCR的概念及基本原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于酶催化的核酸扩增技术，通 过不断的循环反应，将目标DNA序列扩增至数量可检测的水平。
PCR扩增的核酸序列
1 靶标序列
PCR扩增可以选择特定的核酸序列作为扩增的目标，如基因片段或DNA序列。
2 引物序列
引物的序列在PCR扩增中起到了定向选择目标序列的作用。
3 扩增产物序列
扩增过程中，引物和酶合成了新的DNA链，形成了扩增产物。
PCR原理及检测方法解读
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以 分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光 信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景 信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信 号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。 而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的 增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之 间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只 有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物 量的对数值与起始模板量之间存在线性关 系，我们可以选择在这个阶段进行定量分 析。
的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的 新DNA链。72 ℃ 1′ 上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
PCR 的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
1. 缓冲液：
10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.4)
维持 Taq 酶作用环境的偏碱性 25 ～ 50 mM KCl
促进引物退火，>50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。
100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA)
对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、 二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。
加热90～95℃，30 ～ 60 s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可 以调整变性温度和时间。一般情况下选择94 ℃ 30 ″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。 温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活 性和dNTP分子造成损害。
⑵ 复性温度和时间：
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。 复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含 量确定，长度在15 ～ 25 bp 之间时，复性温度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 计算得到，一般位于40 ～ 60℃， 30 ～ 60 s。 复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越 低，产物特异性越低。 一般情况下选择55 ℃ 30″，足以使引物与模板 之间完全结合。
pcr原理及在核酸检测中的应用
PCR原理及在核酸检测中的应用1. PCR（聚合酶链式反应）的原理PCR是一种常用的分子生物学技术，经常被用于核酸检测、基因测序以及基因工程中。
PCR基于DNA的复制原理，通过复制目标DNA片段来扩增其数量，从而便于后续的分析和研究。
PCR反应主要由以下三个步骤组成：1.1. 变性（Denaturation）PCR反应开始时，目标DNA被加热至高温（通常为94-98摄氏度），这样可以使DNA双链解开，变成两条单链的DNA。
这个过程称为变性，其目的是打开DNA双链结构，使其准备好与引物结合。
1.2. 预混合（Annealing）接下来，PCR反应体系的温度会降低到适合引物与目标DNA结合的范围（通常为50-65摄氏度）。
在此温度下，引物能够与目标DNA的互补序列结合，形成稳定的引物-模板复合体。
引物是一种短的DNA片段，可以识别并结合到目标DNA的特定区域。
1.3. 延伸（Extension）在引物与目标DNA结合后，PCR反应温度会升高到一个适合DNA聚合酶活性的范围（通常为65-72摄氏度）。
DNA聚合酶是一种酶类，能够在模板DNA上延伸新的DNA链。
在延伸步骤中，DNA聚合酶沿着引物在目标DNA模板上进行扩增，并合成新的DNA链。
2. PCR在核酸检测中的应用PCR技术广泛应用于核酸检测中，其高度特异性和敏感性使得它成为许多领域的首选方法。
下面列举了PCR在核酸检测中的主要应用：2.1. 疾病诊断PCR技术可以用于快速、特异性地检测疾病相关的病原体。
通过针对特定的DNA片段设计引物，可以检测患者样本中是否存在病原体的DNA。
例如，在COVID-19疫情期间，PCR被广泛应用于检测新型冠状病毒的存在，辅助诊断感染情况。
2.2. 基因突变检测PCR技术还可以用于检测个体基因组中的突变。
引物的设计能够使PCR特异性地扩增突变的基因片段，从而实现对特定突变的检测。
这对于基因疾病的早期筛查和个体基因型的确定非常重要。
PCR技术的原理与方法
PCR技术的原理与方法PCR定义PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DN A为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DN A。
可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。
PCR技术的基本原理一.PCR反应成分：1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸；4.DNA聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2 等。
二.PCR反应基本步骤：1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。
2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。
3.延伸：中温延伸。
DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。
2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。
3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2 存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。
以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。
•PCR扩增的基本方法•PCR反应的成分和作用总体积：一般为25μl～100 μl（一）无Mg2 buffer：由纯水、kcl、Tris组成。
Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。
kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。
（二）Mg2 :终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的3.延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。
普通PCR及测序PCR原理分解
（6）缓冲液（Buffer）
10mmol/L TrisHCl 调节PH，使Taq酶活性作用 环境维持在扁碱性（pH8.3,室温） 50mmol/L KCL 有利于引物的退火，但过高会 抑制Taq酶活性 0.01% 明胶 保护酶不变性失活
一
PCR技术
PCR概念 PCR的原理 PCR中的注意事项 PCR的主要类型
什么是PCR?
• 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称 ＰＣＲ技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外 扩增特异ＤＮＡ片段的技术。 PCR技术操作简 便，可在短时间获得数百万个特异的目的ＤＮ Ａ序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明， 引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广 泛应用于与分子生物学相关的各个领域。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、 DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）Taq DNA聚合酶（Taq酶）
DNA聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、dNTP等 存在的情况下催化DNA的合成。
Taq酶来自水生嗜热菌
Thermus aquaticus
95℃
模板DNA
退火(annealing)
50℃
引物1
DNA引物
引物2
延伸(extension)
Taq酶
72℃
引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
95℃
第1轮结束 第2轮开始
模板DNA（1） 第1轮扩增（2）
轮扩增（4） •第2 PCR 反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
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2）循环参数
(1)变性
使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒
(2) 退火
退火温度由引物Tm值决定，一般为
Tm – 5~10℃
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降 低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸
70-75oC(温度取决于聚合酶的活性） 延伸时间由扩增片段长度及DNA 聚合酶的延伸速度决定
第5轮扩增（32=25）
PCR的基本原理
第3轮扩增（8）
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 上下游引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
PCR反应条件
1）PCR反应成分 （1）模板
模板可以是DNA，也可以是RNA（反转录PCR）， 既可以是双链，也可以是单链。
制备杂交探针
基因组DNA结构功能的研究
低浓度引物
高浓度引物
反向PCR (reverse PCR)
是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 , 如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA 的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
原 因
1. 模板:含有抑制物，含量低 2. Buffer对样品不合适 3. 引物设计不当或者发生降 对 解 策 4. 反应条件：退火温度太高，延
伸时间太短
1. 纯化模板或者使用试剂盒提取 模板DNA或加大模板的用量 2. 更换Buffer或调整浓度 3. 重新设计引物（避免链间二聚 体和链内二级结构）或者换一 管新引物 4. 降低退火温度、延长延伸时间
3. 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
注意的事项：
（一）防止污染
试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作
（二）设立对照
阳性对照： 阴性对照： 试剂对照： 阳性模板 阴性模板 除模板外的所有组分
PCR的类型及应用
• 研究
– 基因克隆，DNA测序，分析突变 – 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 – 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 – 犯罪现场标本分析 – 各种肿瘤检测
4.对标本的纯度要求低： 不需要分离病毒或细菌及培养细胞， DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽 液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA 扩增检测
PCR常见问题
•
假阴性，无扩增产物
非特异性扩增 拖尾 假阳性
• • •
• 无扩增产物
现象：正对照有条带，而样品则无；
• 诊断
• 人类基因组工程
• 法医
• 肿瘤
• 其他……
PCR的不同类型
重组PCR 反向PCR 原位PCR 巢式PCR 热启动PCR 实时定量PCR 不对称PCR 多重PCR 连接酶链反应 递减PCR RT－PCR
重组PCR（基因克隆）
质粒DNA
基因片段
重组DNA
Bam H I 5’
5’ Bam H I Bam H I
Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA 等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
（6）缓冲液（Buffer）
10mmol/L TrisHCl 调节PH，使Taq酶活性作用 环境维持在扁碱性（pH8.3,室温） 50mmol/L KCL 有利于引物的退火，但过高会 抑制Taq酶活性 0.01% 明胶 保护酶不变性失活
（4）循环次数
主要取决于模版DNA的浓度
一般为25-35次
次数过多：扩增效率降低
错误掺入率增加
一个典型PCR体系
反应体系（50 ul）： Taq酶 2.5 U 10x Buffer 5 ul dNTP(2.5mM) 4 ul DNA模板 0.1～2ug 上游引物(10P) 2 ul 下游引物(10P) 2 ul H2O 补足至50 ul 总计 50 ul
LP（Labelled primers)检测
原位PCR的作用
既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）， 但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方 法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单 拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相 结合。
ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭 新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内 基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定 作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。
已知序列
未知序列
未知序列
限制酶 未知序列
已知序列
限制酶 未知序列
连接酶
多重PCR
用于检测特定基因序列的存在或缺失。
引物
电 泳
原位ＰＣＲ
原位聚合酶链式反应（In Still PCR，Is－PCR） 是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作 为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段， 在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段 来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞 中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、 DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）Taq DNA聚合酶（Taq酶）
DNA聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、dNTP等 存在的情况下催化DNA的合成。
Taq酶来自水生嗜热菌
Thermus aquaticus
一
PCR技术
PCR概念 PCR的原理 PCR中的注意事项 PCR的主要类型
什么是PCR?
• 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称 ＰＣＲ技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外 扩增特异ＤＮＡ片段的技术。 PCR技术操作简 便，可在短时间获得数百万个特异的目的ＤＮ Ａ序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明， 引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广 泛应用于与分子生物学相关的各个领域。
操作步骤
①固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯 包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内 源性过氧化物酶.
②蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的 组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶 K. ③PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加 液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环 扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置. ④杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原 位杂交
PCR反应的几个要素
• • • • • • DNA聚合酶 模板（要扩增的DNA） 引物 dNTPs Buffer（缓冲液） Mg 2+ 等 生产机器 模具 原料 稳定的环境 润滑剂
PCR反应步骤
95℃（变性）
50℃（退火） 72℃（延伸）
PCR循环（25-35个）
变性(denaturaion)
• 非特异性扩增
现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大
或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
• 非特异性扩增
原 因
1.
2. 3. 4. 5. 6.
引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 对 Mg2+浓度偏高 策 退火温度偏低 循环次数过多
1. 2. 3.
4.
5. 6.
（6）两引物间避免有互补序列。 （7）引物3’端与模板序列要严格配对，3’端避免出现 3个或3个以上连续相同的碱基 ；引物 5’端无严格限 制。 3’ 5’
5’
3’
限制性内切酶的识别序列
启动子序列
定点突变 探针标记
（4）dNTP
dNTP： dATP， dTTP， dGTP， dCTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
Bam H I
质粒DNA
目的基因 限制性核酸内切酶
GGAC
CCTG
GTCC
CAGG
GGAC
GTCC CAGG GGAC CCTG GTCC
CAGG
CCTG
不对称PCR
目的：扩增产生特异长度的单链DNA。
方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引 物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM, 关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则 降低反应产量
dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影 响DNA聚合酶的活性。
（5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。
特点：1.良好的耐热性 在70～80℃具有最高聚合活性 在95 ℃仍然可以有50%活性 2. Mg2+依赖性 3. 扩增时3‘末端凸出一个A 碱基 3. 无校正功能 一般PCR中酶的用量为0.5-2.5 U/50 l，酶量增加使反应 特异性下降，酶量过少影响反应产量。
（3）引物
引物浓度：0.1-0.5 mol/L
反应流程（以扩增片段大小为
800bp为例）：
95℃ 95℃ 55℃ 72℃ 72℃ 4℃ 5 min 30 s 30 s 1 min 5 min ------
30个 循环
PCR的特点
1. 特异性强 2. 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能 将皮克(pg=10 - 12)量级的起始待测模板扩增 到微克(g=10 -6)水平 3. 简便、快速 PCR反应一般在2～4 小时完成扩增反应。扩 增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素， 无放射性污染、易推广