植物病害研究

植物病害研究法实验

实验一：培养基的制作与灭菌

一、配方：马铃薯去皮200g，蔗糖20g，自来水1000ml，琼脂18g，自然pH

二、步骤：1.称取去皮新鲜马铃薯200g切成指甲盖大小的方块，放于小铝锅中，加入1000ml自来水，放

在电炉上煮。煮到用玻璃棒稍微按一下即烂即可

2.用四层纱布过滤

3.将事先准备好的琼脂剪碎，然后和过滤后的溶液一起放入锅中加热煮至琼脂全部溶（用玻璃

棒挑看上面有无琼脂条即可）

4.将溶化后的琼脂一起倒入事先放入蔗糖的1000ml烧杯

5.将熬制好的培养基倒入三角瓶中，倒入三角瓶的量不要太满，以免以后用时加热时发生事故

6.用棉塞塞住，再用报纸包好后，用绳子勒紧即可

7.放入灭菌锅中灭菌

三、注意事项：1.制备培养基的用具不宜用铁锅或铜锅。因为培养基中含铜量超过0.3mg/L或含铁量超过

0.4mg/L时就可能影响微生物的正常生长发育

2.实验做完后，关电，检查储水池是否被杂物塞住

3.做好卫生以及整理好实验材料

NA培养基：

一、配方：牛肉膏3g, 蛋白胨10g，琼脂15~20g，葡萄糖5~10g，自来水1000ml pH7.0~7.2

二、步骤：1.用玻璃棒挑取牛肉膏3g，蛋白胨10g，放入小烧杯式表面皿中，把称量好的配方加水置电磁

炉中搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解

2.向小铝锅中量取500ml的自来水，将溶解的牛肉膏、蛋白胨洗入铝锅中并用自来水冲洗2~3

次，在电磁炉上边加热边搅拌

3.加入称量好的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，再加入称量好的葡萄糖，搅拌均匀

后，补足水量至1000ml

4.分别装于250ml的锥形瓶中，塞好棉塞，捆扎好

5.高压蒸汽灭菌121℃,灭菌

实验二：病原物人工接种

一、实验原理：从病植物上分离到的微生物不一定具有致病性的病原物只用通过接种植物体才能确定他的

致病性。对于病原菌致病性的测定，不仅是病原物鉴定时不可缺少的工作，在病原菌致病性研究和作物不同品种抗病性的研究中都必须通过接种来测定他们的差异。因此，接种技术是植病研究工作中的一项基本技能。也是柯赫氏法则中最重要的一步。柯赫氏法则有三条：①这种微生物经常于某种病害有联系，发生这种病害往往就有这种微生物的存在②从病组织上可以分离到这种微生物的纯培养，并且可以在各种培养基上研究它的性质③将培养的菌种接种到健康植株上，可诱发与原来相同的病害④从接种后发病的植物上在分离到原来的微生物

二、实验步骤：

1.白菜软腐病菌的接种：

①取无病的白菜帮两片，用脱脂棉沾取75%的乙醇表面消毒，自然干燥后备用

②用无菌针分别在两片白菜帮上刺出梅花状小孔，孔与孔之间大于1cm

③挑取白菜帮软腐病菌涂抹于一片菜帮的伤口处，一片不接种，设为对照

④脱脂棉蘸取无菌水放于伤口处

⑤写好标签，28℃保湿箱中培养，3天后观察发病情况

2.涂抹法接种锈菌：

①选取杂草锈菌，把锈孢子收集起来放在白纸上备用

②选取幼嫩杂草，用手指轻轻摩擦叶表面，擦出微伤口，用手指蘸水在草叶上画出一道水膜，把收集

到的孢子涂抹在叶片上

③用塑料袋套住已接种的在草叶上，保湿24h后观察所接种草叶的发病情况。

未发病的原因：锈孢子致病力不强，环境条件不适宜，杂草抗病能力强

实验三：单孢分离技术

一、实验原理：单孢分离的方法很多，例如振落法，稀释法和直接挑取法。振落法和稀释法的共同点都是

采用某种方法使用真菌孢子经稀疏地分散在水琼脂平板上，然后再显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，找到单个孢子标记好后移植到PDA斜面培养基上，置室温下培养，形成的菌落即为单孢细菌，直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法

二、实验步骤：

1.利用震落法进行单孢分离：

①用无菌操作将熔化冷却60~70℃水琼脂培养基约10ml倒皿，凝固成平板备用

②按无菌操作要领，将盛水琼脂培养基打开30~45°，将长有较多孢子材料（事先干燥好，易震落）

伸进水琼脂平板，轻轻震动，使孢子稀疏落在平板表面，震落时宁轻勿重，防止过多孢子落在水

琼脂表面

③水琼脂平板翻转置显微镜载物台上，用低倍（10*10）找单个孢子，标记

④将标记好的单孢移植到PDA上，标注，25℃

⑤数月后，如在培养基上生出菌丝并形成孢子，镜检是否是纯菌体

2.利用稀释法进行单孢分离

①用灭菌水配制成孢子悬浮液，稀释到一滴孢子悬浮液20-30个孢子左右，用无菌吸管取一滴孢子

悬浮液入灭菌培养皿。

②将已熔化好并冷却45~50℃水琼脂培养基约10ml倒入上述灭菌培养皿中摇匀，凝成平板。将上述

孢子分散在平板上

③与震落相同：将盛水琼脂培养基打开30~45°，将长有较多孢子材料（事先干燥好，易震落）伸

进水琼脂平板，轻轻震动，使孢子稀疏落在平板表面，震落时宁轻勿重，防止过多孢子落在水琼

脂表面

实验四：病原真菌孢子的萌发

一、实验原理：真菌孢子的萌发受内在因子和环境条件的影响。内在因子主要是孢子的成熟度寿命长短、休眠期限和生机的强弱等。环境因子主要有温湿度、氧气、营养条件等

二、实验步骤：

1.培养皿中萌发法：将10ml无菌水倒入长满病菌菌体的培养皿中，用L玻棒轻轻刮培养皿于烧杯中，使病菌菌体充分混合在无菌水中制成菌悬液。用双层纱布过滤菌悬液得到孢悬液，取适量孢悬液移入另一培养皿中，再加入适量无菌水，使其浸没皿底，然后放在28℃条件下培养24h后观察萌发情况，用血球计数板统计萌发率

2.水琼脂表面萌发法:①取水琼脂加热解冻②倒水琼脂平板，冷却，凝固③制作病原真菌的孢悬液，移取1-2ml置于琼脂平板上，（两个重复）置于黑暗、光照24h（20℃）

实验五：植物病原菌的拮抗作用测定

实验操作：

皿内拮抗性观察:

3.在PDA平板上扩大繁殖靶标致病菌和生防菌