质粒提取原理和方法

质粒DNA提取的原理及方法

碱裂解法质粒DNA提取原理

质粒DNA提取主要包括以下几个方面：如何将细胞裂解释放质粒DNA，如何将质粒DNA和基因组DNA分离开来，如何去除RNA污染，如何去除蛋白质和其它杂质。

质粒提取方法中，最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。其原理是：

强碱性条件下，质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来，并发生变性。在pH中性，并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复性，仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，在去垢剂SDS作用下，染色体DNA与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，通过离心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。

BIOMIGA公司质粒DNA纯化系列试剂盒，采用碱裂解法质粒提取原理，在高盐环境下，采用硅胶膜特异性的吸附质粒DNA，而蛋白质不被吸附，最后用低盐洗脱液将DNA从膜上洗脱下来，方法简单，快速，质量好，收获量高。

影响质粒提取的因素

影响质粒提取的因素有很多种，如质粒拷贝数，宿主菌株的种类，细菌的培养时间、培养基种类、培养条件等等。

质粒拷贝数

质粒DNA最终收获量取决于质粒的拷贝数和质粒的大小。BIOMIGA 公司质粒DNA提取系列试剂盒，操作步骤适用于高拷贝数质粒的纯化，对于低拷贝质粒纯化提取，应加大起始菌液量的体积，并且相应地增加各种缓冲液的用量。

下表给出一些常用质粒载体的拷贝数：

质粒种类

复制起点

拷贝数

1 mL菌液质粒DNA收获量(µg)

pSC101

pSC101

5

pACYC

P15A

10-12

pSuperCos

pMB1

10-20

pBR322

pMB1

15-20

pGEMR

Muted pMB1

300-400

6-7

pBluescriptR

ColE1

300-500

6-8

pUC

Muted pMB1

500-700

8-12

宿主菌株

宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株，如JM101, JM110, HB101, TG1以及它们的衍生菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放出来的核酸酶的作用下，将会显著影响最终收获量，或者纯化到的质粒容易降解，推荐客户将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a进行质粒纯化。

如果从含内源核酸酶的宿主菌株中纯化质粒DNA，请用试剂盒附送的核酸酶去除溶液，去除核酸酶的污染。或选用HP系列试剂盒进行质粒的纯化。

下表给出一些常用的宿主菌株种类：

EndA- Strains of E. Coli

DH5α

DH1

DH21

JM106

JM109

SK2267

SRB

XLO

TOP10

DH10B

JM103

JM107

SK1590

MM294

Stbl2™

XL1-Blue

BJ5182

DH20

JM105

JM108

SK1592

Select96™

Stbl4™

XL10-Gold

EndA+ Strains of E. Coli C600

JM110

RR1

ABLE® C

CJ236

KW251

P2392

BL21(DE3)

HB101

TG1

TB1

ABLE® K

DH12S™

LE392

PR700

BL21(DE3) pLysS

JM101

JM83

TKB1

HMS174

ES1301

M1061

Q358

BMH 71-18

All NM strains

All Y strains

菌液培养

BIOMIGA 公司质粒DNA提取系列试剂盒，标准操作适用于在LB培养基中培养12~16小时，OD600在~的菌液质粒DNA的提取。如果使用丰富培养基，如TB，2 x YT培养基，请保证OD600不超过。菌液过量，将会影响最终的收获量和纯度。

培养方式

如果用于质粒小提，请从固体培养基平板上挑取新鲜单菌落，接种到加入筛选抗生素的培养基中，震荡培养12~16小时。

如果用于中提、大提或超大提，请按照以下方式制备菌液：

挑取单克隆，接种到1~5mL培养基中，进行初摇，然后按照1:1000的比例进行放大培养，培养瓶中培养基的体积最好不要超过培养瓶的1/4体积。

抗生素浓度的选择

对含有抗性的质粒载体，在进行筛选或培养时应加入相应的抗生素。

各种抗生素的工作浓度请参照下表：

抗生素

溶解性

保存条件

严紧型质粒

松弛型质粒

氨苄青霉素

50 mg/mL(溶于水)

-20℃

20 µg/mL

60 µg/mL

羧苄青霉素

50 mg/mL溶于水

-20℃

20 µg/mL

60 µg/mL

氯霉素

34 mg/mL溶于无水乙醇

-20℃

25 µg/mL

170 µg/mL