纤维素酶活力测定方法
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近年来国内通用的和新提出的一些纤维素酶活力测 定方法 , 大多利用 DNS法原理 , 即纤维素经纤维素酶 水解后生成的还原糖能将 3052二硝基水杨酸 (DNS) 中 的硝基还原为氨基 , 生成棕红色的氨基化合物 。在一定 的浓度范围内 , 还原糖的量与棕红色的深浅呈正比关
系 [12 ] 。可用比色法测定 。 21211 内切纤维素酶活 ( CMCaseactivity) 以无定形 纤维素为底物 , 以还原糖的生成量表征 CMC 酶活力 。 如 Amano法采用了羧甲基纤维素钠 , 国际药品联合会提 供的测定方法采用了羟乙基纤维素 [14 ] , Merz法采用了 磷酸膨胀纤维素 [15 ] 。 21212 外切纤维素酶活 ( PNPCase) 以对硝基苯纤 维二糖苷 ( pNPC) 为底物 , 以对硝基苯的生成量表示 酶活力 [15 ] 。也可以微晶纤维素 (Avicel) 为底物水解得 到的还原糖量表示酶活力 , 称为 Avicelase 活力 。但内 切葡聚糖苷酶对 Avicel水解程度也高 , 对原酶液而言 , 它反映的是纤维素酶各组分协同作用的结果 ; 对单一组 分来说 , 它反映外切葡聚糖苷酶的活力 。 21213 纤维二糖酶活 以纤维二糖为底物 , 测定酶解 反应后葡萄糖生成量 , 表示酶活力 。由于葡萄糖和纤维 二糖都具有还原性 , 定糖方法难以区分 。常用人工合成 的糖苷化合物 , 如对硝基酚 2β2葡萄糖苷 ( PNPG) 、水 杨素为底物 , 测定生成的对硝基酚或葡萄糖 。 21214 滤纸酶活 1984 年国际理论和应用化学协会的 发酵委员会确定滤纸酶活法为标准方法 。滤纸为天然结 晶类纤维素 , 以其为底物经纤维素酶水解后生成的还原 糖量 , 表示纤维素酶系总的糖化能力 , 得到了广泛的应 用 。然而由于滤纸结构的不均一性 , 方法繁琐 , 导致测 定结果误差较大 , 难以精确定量 。 21215 差重法 以砂芯坩埚为酶解反应器 , 避免了水 解液转移过程中产生的偏差 , 同时也不必在酶解液中添 加反映终止剂 , 直接过滤洗涤使反应终止 。节约了试 剂 , 避免了试剂干扰 。测出的酶水解率比常规的以还原 糖量测出的酶水解率要高 。试验操作简便易行 , 重现性 好 , 适合于酶解样品较少的试验研究 [16 ] 。
纤维素酶 ( Cellulase) 是使纤维素降解生成葡萄糖 的 1组酶的总称 , 包含 C1酶 、CX酶和 β2葡萄糖苷酶 , 这 3种酶协同作用可将纤维素降解为葡萄糖 [3, 4 ] 。纤维
收稿日期 : 2010203224 基金项目 : 四川省财政育种工程青年基金项目 (2008VJJ2018) 作者简介 : 康纪婷 (1984 - ) , 女 , 四川成都人 , 硕士在读 , 从事环境
Abstract: There were many determ ination methods of cellulas activity, which were no unified now1D ifferent determ ination methods were used based on different experiment purposes in many institutions in China, and some of them were modified according to experience1The determ ination methods of cellulose activity and p roblem s were summarized, which would p rovide references for the selection of methods based on different experiment purposes1 Key words: Cellulase; Activity; Determ ination method
D eterm ina tion M ethods of Cellula se Activ i ty
KANG J i2ting1 , WU Xiang2 , GAN B ing2cheng2 , ZHANG Xiao2p ing13 ( 11College of Resources & Environment, Sichuan Agricultural University, Yaπan 625014, China; 21M icrobiology Laboratory of Soil and Fertilizer Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610000, China)
摘要 : 关于纤维素酶活力测定方法很多 , 至今也没有统一 。国内许多单位根据各自的实验目的采用了不同的测 定方法 , 并据各自的经验对其做了部分修改 , 使得测定方法更加多样化 。综述了纤维素酶活力的测定方法及其 存在的问题 , 旨为不同目的纤维素酶活力测定方法的选择提供借鉴 。 关键词 : 纤维素酶 ; 酶活力 ; 测定方法 中图分类号 : TQ92011 文献标识码 : A 文章编号 : 100821631 ( 2010) 0420151203
河北农业科学 , 2010, 14 (4) : 151 - 153 Journal of Hebei Agricultural Sciences
编辑 李布青
纤维素酶活力测定方法
康纪婷 1 , 吴 翔 2 , 甘炳成 2 , 张小平 13
(11四川农业大学资源与环境学院 , 四川 雅安 625014; 21四川省农业科学院土肥所微生物实验室 , 四川 成都 610000)
纤维素酶 除 了 将 纤 维 素 水 解 成 葡 萄 糖 等 有 效 成 分 外 , 还能通过提高植物细胞壁的通透性 , 来提高植物细 胞内含物的提取率 , 所以 , 纤维素酶广泛应用于以植物 为原料的工农业生产中 。
2 纤维素酶活力的测定方法
211 纤维素酶活力测定的一般方法 [8 ] 国内外曾报道过的纤维素酶活力测定方法有很多 ,
微生物研究 。E2mail: kangjiting11zhong@yahoo. com. cn。 通讯作者 : 张小平 。
素酶是起协同作用的多组分酶系 , 可以促进纤维素的分 解 。纤维素酶主要来自于真菌和细菌 。按照其作用机 理 , 可分为内切葡聚糖苷酶 、外切葡聚糖苷酶和 β2葡萄 糖苷酶 3类 [5 ] 。 11211 内切葡聚糖苷酶 又称 Cx酶 、CMC 酶 、 endo2 1042β2D 2glucanase (来自真菌的简称 EG, 来自细菌的简 称 Cne) 。Cx酶作用于纤维素内部的无定型区域 , 随机 水解 1042β2葡萄糖苷键 , 将长链纤维素分子切短 , 产生 大量非还原性末端的小分子纤维素 。 11212 外切葡聚糖苷酶 又称 C1 酶 、 exo21042β2D2glu2 canase (来自真菌的简称 CBH, 来自细菌的简称 Cex) 。 C1酶作用于纤维素线状分子的末端 , 水解 1042β2D 2葡 萄糖苷键 , 每次切下 1个纤维二糖分子 , 又称纤维二糖 水解酶 ( cellobiohydrolase) 。 11213 β2葡萄糖苷酶 又称纤维二糖酶 、β21042gluco2 sidase (简称 BG) 。这类酶将纤维二糖或可溶性纤维糊 精水解成葡萄糖分子 。
现将其中具有代表性 、应用较为广泛的方法简介如下 :
·15Βιβλιοθήκη Baidu·
河北农业科学
2010 年
21111 棉线切断法 采用恒温振荡器 , 将细棉线的一 端浸入含有酶液的试管中 , 在最佳温度和 pH 值条件下 微振荡 。测定细棉线切断所需的时间 , 求得酶活力 。 21112 滤纸崩溃法 采用恒温振荡器 , 以一定规则的滤 纸片为底物 , 加入装有酶液的试管中 , 在最佳温度和 pH 值条件下微振荡。测定滤纸完全崩溃所需要的时间 , 求得 酶活力。由于滤纸崩溃的时间较难确定 , 所以误差很大。
1 纤维素和纤维素酶
111 纤维素 纤维素是植物细胞的主要成分 , 是地球上分布最
广 、含量最丰富的碳水化合物 , 也是生物界最重要的碳 源之一 [1 ] 。纤维素分子是由许多吡喃型的 D2葡萄糖残 基以 1042β2葡萄糖苷键相联结而形成的多糖 , 是 1 种高 分子化合物 。
纤维素之间存在着氢键 , 通过氢键的缔合作用 , 纤 维素链形成了纤维素束 。在这个纤维素的连续结构中 , 分子密度大的地方平行排列 , 定向良好 , 形成纤维素的 结晶性区域 。而随着致密度的减小 , 结合程度减弱 , 分 子间空隙增大 , 定向变差 , 形成了纤维素的无定型区 域 。在纤维素中除了纤维素链之间存在着氢键 , 在分子 内也存在着氢键 。氢键是 1种高能键 , 这种键的存在给 纤维素的水解带来了很大困难 [2 ] , 也是造成纤维素难以 被利用的根本原因 。 112 纤维素酶
还原糖增 加 法 是 通 过 底 物 与 酶 液 在 特 定 条 件 下 反 应 , 用葡萄糖含量的增加来计算酶活力 。目前普遍采用 该方法来测定纤维素酶的酶活 。 21114 分光光度计法 [10 ] 酶促反应中生成的糖类物质 与显色剂发生显色反应 , 用分光光度计在 500 nm 左右 的波长处测定吸光度 , 换算成还原糖量 , 计算出酶活 力 。分光光度计法大大缩短了酶活力测定所需要的时 间 , 而且有较高的精确度 , 是目前应用最广泛的方法 。 国内许多科研机构根据各自的实验目的 , 采用了不同的 底物和显色剂 , 因而由此衍生出的方法更加多样化 。 21115 快速测定纤维素酶 CMC液化活力法 [11 ] 以铬矾 为交联剂 , 使羧甲基纤维素交联产生粘度较大的凝胶 , 通过观测凝胶液化的程度和快慢确定酶活力的大小 。此 法简单方便 , 目测即可 , 用于菌种初筛十分方便 。 21116 平板法 在菌种选育工作中 , 都希望在平板上 对纤维素酶产生菌进行筛选 , 这样可以大大提高工作效 率 。磷酸膨胀纤维素易于制成均匀的双层平板 , 纤维素 酶在其上能够形成清晰的透明圈 , 此法广泛应用于产纤 维素酶的真菌选育中 。 21117 巴鲁阿 2斯温 (Barnch and swain) 测定法 以水 杨酸为底物 , 根据被水解出的水杨醇和 β2D 2葡萄糖量 , 用比色法测定 β2葡萄糖苷酶活力 。此法普遍应用于 β2 葡萄糖苷酶活力的测定 。 212 纤维素酶活力测定的主要方法
在此基础上又发展了滤纸失重法 。即在最佳温度和 pH值条件下 , 让滤纸片和酶液反应一段较长的时间 (通常需要 2周以上 ) , 然后将滤纸片水洗烘干 , 测定滤 纸片反应前后的质量变化 , 计算出滤纸的失重率 , 从而 推算出酶活力 。 21113 羧甲基纤维素钠为底物的粘度减少和还原糖增 加的测定法 [9 ] 测定 CMC 粘度降低的方法分为旋转粘 度计法和工研法 。旋转粘度计法采用旋转粘度计 , 测定 底物 3 m in 和 18 m in 的粘度 , 利用公式推算出酶活力 。 工研法采用奥氏粘度计 , 测定底物粘度减至 1 /2 时所需 的时间 , 以 l0 m in使底物粘度降低 1 /2 的酶活作为 1 个 活力单位 。
3 纤维素酶活力测定存在的问题与展望
311 纤维素酶活力测定存在的问题 纤维素酶活力的测定方法有很多 , 至今也没有统
一 , 而且测定中存在着很多困难 , 给纤维素酶的开发利 用带来了很多不利影响 。其主要问题有 [6 ] : ( 1 ) 根据 酶反应动力学通则 , 酶活力的测定是在底物过量存在的 条件下 , 测定酶促反应的初速度来表示酶活力 。但纤维 素酶是多组分酶系 , 各组分间有协同作用 , 形成了多种 终产物 , 涉及多种反馈控制机理 。测初速度的原则也就 难以反映底物特性 , 使得确定酶活力测定的标准化方法 非常困难 。 (2) 纤维素是不溶于水的高聚糖 , 纤维素酶 与其反应是在固体界面上进行的 , 其酶解反应速率受底 物对酶蛋白的吸附速率和产物扩散速率的影响 。不同来 源的同一类纤维素酶 , 其组成和各组成成分的比例也有 较大的差异 , 使得测定结果存在较大的不准确性 。 ( 3) 由于纤维素酶结构的复杂性 , 酶组分生化特性和酶学作 用的影响 , 以及异构酶的存在 , 在不同试验条件下得到
系 [12 ] 。可用比色法测定 。 21211 内切纤维素酶活 ( CMCaseactivity) 以无定形 纤维素为底物 , 以还原糖的生成量表征 CMC 酶活力 。 如 Amano法采用了羧甲基纤维素钠 , 国际药品联合会提 供的测定方法采用了羟乙基纤维素 [14 ] , Merz法采用了 磷酸膨胀纤维素 [15 ] 。 21212 外切纤维素酶活 ( PNPCase) 以对硝基苯纤 维二糖苷 ( pNPC) 为底物 , 以对硝基苯的生成量表示 酶活力 [15 ] 。也可以微晶纤维素 (Avicel) 为底物水解得 到的还原糖量表示酶活力 , 称为 Avicelase 活力 。但内 切葡聚糖苷酶对 Avicel水解程度也高 , 对原酶液而言 , 它反映的是纤维素酶各组分协同作用的结果 ; 对单一组 分来说 , 它反映外切葡聚糖苷酶的活力 。 21213 纤维二糖酶活 以纤维二糖为底物 , 测定酶解 反应后葡萄糖生成量 , 表示酶活力 。由于葡萄糖和纤维 二糖都具有还原性 , 定糖方法难以区分 。常用人工合成 的糖苷化合物 , 如对硝基酚 2β2葡萄糖苷 ( PNPG) 、水 杨素为底物 , 测定生成的对硝基酚或葡萄糖 。 21214 滤纸酶活 1984 年国际理论和应用化学协会的 发酵委员会确定滤纸酶活法为标准方法 。滤纸为天然结 晶类纤维素 , 以其为底物经纤维素酶水解后生成的还原 糖量 , 表示纤维素酶系总的糖化能力 , 得到了广泛的应 用 。然而由于滤纸结构的不均一性 , 方法繁琐 , 导致测 定结果误差较大 , 难以精确定量 。 21215 差重法 以砂芯坩埚为酶解反应器 , 避免了水 解液转移过程中产生的偏差 , 同时也不必在酶解液中添 加反映终止剂 , 直接过滤洗涤使反应终止 。节约了试 剂 , 避免了试剂干扰 。测出的酶水解率比常规的以还原 糖量测出的酶水解率要高 。试验操作简便易行 , 重现性 好 , 适合于酶解样品较少的试验研究 [16 ] 。
纤维素酶 ( Cellulase) 是使纤维素降解生成葡萄糖 的 1组酶的总称 , 包含 C1酶 、CX酶和 β2葡萄糖苷酶 , 这 3种酶协同作用可将纤维素降解为葡萄糖 [3, 4 ] 。纤维
收稿日期 : 2010203224 基金项目 : 四川省财政育种工程青年基金项目 (2008VJJ2018) 作者简介 : 康纪婷 (1984 - ) , 女 , 四川成都人 , 硕士在读 , 从事环境
Abstract: There were many determ ination methods of cellulas activity, which were no unified now1D ifferent determ ination methods were used based on different experiment purposes in many institutions in China, and some of them were modified according to experience1The determ ination methods of cellulose activity and p roblem s were summarized, which would p rovide references for the selection of methods based on different experiment purposes1 Key words: Cellulase; Activity; Determ ination method
D eterm ina tion M ethods of Cellula se Activ i ty
KANG J i2ting1 , WU Xiang2 , GAN B ing2cheng2 , ZHANG Xiao2p ing13 ( 11College of Resources & Environment, Sichuan Agricultural University, Yaπan 625014, China; 21M icrobiology Laboratory of Soil and Fertilizer Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610000, China)
摘要 : 关于纤维素酶活力测定方法很多 , 至今也没有统一 。国内许多单位根据各自的实验目的采用了不同的测 定方法 , 并据各自的经验对其做了部分修改 , 使得测定方法更加多样化 。综述了纤维素酶活力的测定方法及其 存在的问题 , 旨为不同目的纤维素酶活力测定方法的选择提供借鉴 。 关键词 : 纤维素酶 ; 酶活力 ; 测定方法 中图分类号 : TQ92011 文献标识码 : A 文章编号 : 100821631 ( 2010) 0420151203
河北农业科学 , 2010, 14 (4) : 151 - 153 Journal of Hebei Agricultural Sciences
编辑 李布青
纤维素酶活力测定方法
康纪婷 1 , 吴 翔 2 , 甘炳成 2 , 张小平 13
(11四川农业大学资源与环境学院 , 四川 雅安 625014; 21四川省农业科学院土肥所微生物实验室 , 四川 成都 610000)
纤维素酶 除 了 将 纤 维 素 水 解 成 葡 萄 糖 等 有 效 成 分 外 , 还能通过提高植物细胞壁的通透性 , 来提高植物细 胞内含物的提取率 , 所以 , 纤维素酶广泛应用于以植物 为原料的工农业生产中 。
2 纤维素酶活力的测定方法
211 纤维素酶活力测定的一般方法 [8 ] 国内外曾报道过的纤维素酶活力测定方法有很多 ,
微生物研究 。E2mail: kangjiting11zhong@yahoo. com. cn。 通讯作者 : 张小平 。
素酶是起协同作用的多组分酶系 , 可以促进纤维素的分 解 。纤维素酶主要来自于真菌和细菌 。按照其作用机 理 , 可分为内切葡聚糖苷酶 、外切葡聚糖苷酶和 β2葡萄 糖苷酶 3类 [5 ] 。 11211 内切葡聚糖苷酶 又称 Cx酶 、CMC 酶 、 endo2 1042β2D 2glucanase (来自真菌的简称 EG, 来自细菌的简 称 Cne) 。Cx酶作用于纤维素内部的无定型区域 , 随机 水解 1042β2葡萄糖苷键 , 将长链纤维素分子切短 , 产生 大量非还原性末端的小分子纤维素 。 11212 外切葡聚糖苷酶 又称 C1 酶 、 exo21042β2D2glu2 canase (来自真菌的简称 CBH, 来自细菌的简称 Cex) 。 C1酶作用于纤维素线状分子的末端 , 水解 1042β2D 2葡 萄糖苷键 , 每次切下 1个纤维二糖分子 , 又称纤维二糖 水解酶 ( cellobiohydrolase) 。 11213 β2葡萄糖苷酶 又称纤维二糖酶 、β21042gluco2 sidase (简称 BG) 。这类酶将纤维二糖或可溶性纤维糊 精水解成葡萄糖分子 。
现将其中具有代表性 、应用较为广泛的方法简介如下 :
·15Βιβλιοθήκη Baidu·
河北农业科学
2010 年
21111 棉线切断法 采用恒温振荡器 , 将细棉线的一 端浸入含有酶液的试管中 , 在最佳温度和 pH 值条件下 微振荡 。测定细棉线切断所需的时间 , 求得酶活力 。 21112 滤纸崩溃法 采用恒温振荡器 , 以一定规则的滤 纸片为底物 , 加入装有酶液的试管中 , 在最佳温度和 pH 值条件下微振荡。测定滤纸完全崩溃所需要的时间 , 求得 酶活力。由于滤纸崩溃的时间较难确定 , 所以误差很大。
1 纤维素和纤维素酶
111 纤维素 纤维素是植物细胞的主要成分 , 是地球上分布最
广 、含量最丰富的碳水化合物 , 也是生物界最重要的碳 源之一 [1 ] 。纤维素分子是由许多吡喃型的 D2葡萄糖残 基以 1042β2葡萄糖苷键相联结而形成的多糖 , 是 1 种高 分子化合物 。
纤维素之间存在着氢键 , 通过氢键的缔合作用 , 纤 维素链形成了纤维素束 。在这个纤维素的连续结构中 , 分子密度大的地方平行排列 , 定向良好 , 形成纤维素的 结晶性区域 。而随着致密度的减小 , 结合程度减弱 , 分 子间空隙增大 , 定向变差 , 形成了纤维素的无定型区 域 。在纤维素中除了纤维素链之间存在着氢键 , 在分子 内也存在着氢键 。氢键是 1种高能键 , 这种键的存在给 纤维素的水解带来了很大困难 [2 ] , 也是造成纤维素难以 被利用的根本原因 。 112 纤维素酶
还原糖增 加 法 是 通 过 底 物 与 酶 液 在 特 定 条 件 下 反 应 , 用葡萄糖含量的增加来计算酶活力 。目前普遍采用 该方法来测定纤维素酶的酶活 。 21114 分光光度计法 [10 ] 酶促反应中生成的糖类物质 与显色剂发生显色反应 , 用分光光度计在 500 nm 左右 的波长处测定吸光度 , 换算成还原糖量 , 计算出酶活 力 。分光光度计法大大缩短了酶活力测定所需要的时 间 , 而且有较高的精确度 , 是目前应用最广泛的方法 。 国内许多科研机构根据各自的实验目的 , 采用了不同的 底物和显色剂 , 因而由此衍生出的方法更加多样化 。 21115 快速测定纤维素酶 CMC液化活力法 [11 ] 以铬矾 为交联剂 , 使羧甲基纤维素交联产生粘度较大的凝胶 , 通过观测凝胶液化的程度和快慢确定酶活力的大小 。此 法简单方便 , 目测即可 , 用于菌种初筛十分方便 。 21116 平板法 在菌种选育工作中 , 都希望在平板上 对纤维素酶产生菌进行筛选 , 这样可以大大提高工作效 率 。磷酸膨胀纤维素易于制成均匀的双层平板 , 纤维素 酶在其上能够形成清晰的透明圈 , 此法广泛应用于产纤 维素酶的真菌选育中 。 21117 巴鲁阿 2斯温 (Barnch and swain) 测定法 以水 杨酸为底物 , 根据被水解出的水杨醇和 β2D 2葡萄糖量 , 用比色法测定 β2葡萄糖苷酶活力 。此法普遍应用于 β2 葡萄糖苷酶活力的测定 。 212 纤维素酶活力测定的主要方法
在此基础上又发展了滤纸失重法 。即在最佳温度和 pH值条件下 , 让滤纸片和酶液反应一段较长的时间 (通常需要 2周以上 ) , 然后将滤纸片水洗烘干 , 测定滤 纸片反应前后的质量变化 , 计算出滤纸的失重率 , 从而 推算出酶活力 。 21113 羧甲基纤维素钠为底物的粘度减少和还原糖增 加的测定法 [9 ] 测定 CMC 粘度降低的方法分为旋转粘 度计法和工研法 。旋转粘度计法采用旋转粘度计 , 测定 底物 3 m in 和 18 m in 的粘度 , 利用公式推算出酶活力 。 工研法采用奥氏粘度计 , 测定底物粘度减至 1 /2 时所需 的时间 , 以 l0 m in使底物粘度降低 1 /2 的酶活作为 1 个 活力单位 。
3 纤维素酶活力测定存在的问题与展望
311 纤维素酶活力测定存在的问题 纤维素酶活力的测定方法有很多 , 至今也没有统
一 , 而且测定中存在着很多困难 , 给纤维素酶的开发利 用带来了很多不利影响 。其主要问题有 [6 ] : ( 1 ) 根据 酶反应动力学通则 , 酶活力的测定是在底物过量存在的 条件下 , 测定酶促反应的初速度来表示酶活力 。但纤维 素酶是多组分酶系 , 各组分间有协同作用 , 形成了多种 终产物 , 涉及多种反馈控制机理 。测初速度的原则也就 难以反映底物特性 , 使得确定酶活力测定的标准化方法 非常困难 。 (2) 纤维素是不溶于水的高聚糖 , 纤维素酶 与其反应是在固体界面上进行的 , 其酶解反应速率受底 物对酶蛋白的吸附速率和产物扩散速率的影响 。不同来 源的同一类纤维素酶 , 其组成和各组成成分的比例也有 较大的差异 , 使得测定结果存在较大的不准确性 。 ( 3) 由于纤维素酶结构的复杂性 , 酶组分生化特性和酶学作 用的影响 , 以及异构酶的存在 , 在不同试验条件下得到