《生物工艺学下》复习题

生物工艺学下复习题1 生物下游加工过程的特点是什么？生物产品特点：①产物浓度低的水溶液 (原因：a 氧传递限制；b 细胞量;c 产物抑制②组分复杂(a 大分子;b 小分子;c 可溶物;d 不可溶物;e 化学添加物由于起始浓度低，杂质又多，所以提取步骤多，常导致收率低，成本高。

发酵液的产品浓度与价格成反比。

P3图13.1.③产物稳定性差(a 化学降解(pH , 温度);b 微生物降解（酶作用，染菌）c剪切力（影响空间结构、使分子降解）④由于分批操作和微生物变异，发酵液每批不尽相同，提取方法要有弹性。

选择提取方法要考虑放罐时间、杂菌污染、加入添加物等，⑤质量要求高（药品或食品）2 生物下游加工过程的一般工艺流程和阶段是什么？①预处理和固液分离技术: 絮凝，离心，过滤，微过滤。

②细胞破碎技术: 球磨，高压匀浆，化学破碎技术③初步纯化技术（目的在于浓缩): 盐析法，萃取，有机溶剂沉淀，化学沉淀，大孔吸附树剂，膜分离技术④高度纯化技术(精制）: 各类层析，亲和，疏水，聚焦，离子交换⑤最后纯化-成品加工喷雾干燥，气流干燥，沸腾干燥，冷冻干燥，结晶3 凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。

凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成１ mm 大小块状凝聚体的过程。

絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。

其中絮凝剂主要起架桥作用。

4 凝聚的机理：1）中和粒子表面电荷 2）消除双电层结构3）破坏水化膜5 常用的凝聚剂电解质有硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O（明矾）；氯化铝 AlCl3•6H2O;三氯化铁 FeCl3;硫酸亚铁 FeSO4·7H2O ；石灰；ZnSO4；MgCO36 絮凝的机理——架桥作用7 工业常用的絮凝剂分为三类：人工合成有机高分子聚合物、天然有机高分子聚合物、无机高分子聚合物1）目前常用的是人工合成有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚乙烯亚胺衍生物；聚丙烯酸类和聚苯乙烯类衍生物。

2）天然有机高分子絮凝剂天然有机高分子改性絮凝剂根据其原料来源不同可分为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。

其中淀粉改性絮凝剂的研究开发最引人注目。

3）无机高分子聚合物有聚合铁系和铝系两大类8 高价无机离子的去除方法1.Ca2+ ——草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀（注意回收草酸）；2.Mg2+——三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；3.Fe2+ ——黄血盐，→普鲁士兰沉淀9 预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：⑴改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。

⑵相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。

⑶尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）；10 常见的固液分离方法过滤filtration离心Centrifugation 膜分离membrane separation双水相萃取 ATPS 扩张床吸附 EBA11 错流过滤又称切向流过滤（Cross-Flow Filtration）传统过滤时过滤液体垂直于过滤介质，过滤阻力主要来之滤饼。

错流过滤打破了传统过滤的机制，即液体的流向和滤膜相切。

12 细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。

13 机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（homogenization）高速珠研磨破碎法（bead grinding）超声波破碎法（ultrasonication）14 非机械方法很多（1 酶解（2 化学法溶胞（3 物理法渗透压冲击冻结和融化干燥法其中酶法和化学法溶胞应用最广。

15 基因工程包涵体的纯化方法收集菌体细胞细胞破碎包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性16 常用包涵体蛋白变性剂：5-8 mol/L盐酸胍和6-8 mol/L尿素, 作用：破坏离子间相互作用；表面活性剂如1-2％ SDS，作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。

PH>9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。

影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。

17 包涵体蛋白的复性原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。

当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。

复性方法：稀释法除变性剂－加入大量水或缓冲液。

膜分离法除变性剂－透析、超滤、电渗析。

层析法：凝胶层析，高效疏水层析18 沉淀法的分类根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1）盐析法；（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）复合盐沉淀法等（7）亲和沉淀法（8）选择性沉淀法。

19 盐析在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。

20 盐析法机理（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。

（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。

（3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。

21 Cohn经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系㏒ S=β-ＫsＩ S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度，I=1/2∑mizi2 mi—离子 i的摩尔浓度；Zi—所带电荷；β—常数，图中截距Ks—盐析常数，图中直线斜率22 β和Ks的物理意义β—β代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。

与蛋白质种类、温度、pH 值有关，与盐无关；Ks—盐析常数，代表图中直线的斜率；从一些实验结果表明，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。

但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过1倍。

23 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，（固定pH, 温度，改变盐浓度），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液；第二种叫β分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，（固定离子强度，改变pH及温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶。

24 等电点沉淀法在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀的操作称为等电点沉淀25 有机溶剂沉淀法概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。

26 有机溶剂沉淀法机理A 降低溶剂介电常数（介电常数D有机 < D水），减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。

B 破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。

C 相反力：疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层27膜分离技术概念：用半透膜作为选择障碍层，利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离目的的技术。

28常见膜分离方法——按分离粒子大小分类：（1 透析（Dialysis，DS）（2 微滤（Microfiltration，MF）（3 超滤（Ultrafiltration，UF）（4 纳滤（Nanofiltration，NF）（5 反渗透（Reverse osmosis，RO）（6 电渗析（Electrodialysis，ED）（7 渗透气化（Pervaporation，PV）29对于不同种类的膜材料的基本要求：（1 耐压：膜孔径小，要保持高通量就必须施加较高的压力，一般模操作的压力范围在0.1~0.5MPa，反渗透膜的压力更高，约为1~10MPa （2 耐高温:高通量带来的温度升高和清洗的需要（3 耐酸碱：防止分离过程中，以及清洗过程中的水解；（4 化学相容性：保持膜的稳定性；（5 生物相容性：防止生物大分子的变性；（6 成本低。

30 影响截留率的因素：（1 分子形状：线状分子易透过，σ线 < σ球；（2 吸附作用：溶质吸附于膜孔壁上，降低膜孔有效直径（3 浓差极化作用：高分子溶质在膜面沉积，使膜阻力↑，较小分子溶质的截留率↑，分离性能↓。

（4 温度/浓度，T↑C↓，使↓σ，因为膜吸附作用↓；（5 错流速度↑，↓σ，因为浓差极化作用↓；（6 pH、离子强度影响蛋白质分子构型，影响σ31 截断分子量:（molecular weight cut-off，MWCO）相当于一定截留率(通常为90％或95％)的分子量，随厂商而异32 超滤是以压力为推动力，利用超滤膜不同孔径对液体中溶质进行分离的物理筛分过程。

其截断分子量一般为6000到 50万，孔径为几十nm，操作压0.2-0.6MPa。

33 反渗透利用反渗透膜选择性的只能通过溶剂（通常是水）而截留离子物质性质，以膜两侧静压差为推动力，克服渗透压，使溶剂通过反渗透膜实现对液体混合物进行分离的过程。

操作压差一般为1.5～10.5MPa，截留组分为小分子物质。

34 萃取：当含有生化物质的溶液与互不相溶的第二相接触时，生化物质倾向于在两相之间进行分配，当条件选择得恰当时，所需提取的生化物质就会有选择性地发生转移，集中到一相中，而原来溶液中所混有的其它杂质（如中间代谢产物、杂蛋白等）分配在另一相中，这样就能达到某种程度的提纯和浓缩。

35 液液萃取是以分配定律为理论基础分配定律：一定T、P下，溶质在两个互不相溶的溶剂中分配，平衡时，溶质在两相中浓度之比为常数。

K=C1/C2=萃取相的溶质浓度/萃余相的溶质浓度K-分配系数常温常压下，K为常数，应用前提条件：A稀溶液，B溶质对溶剂互溶没有影响，C溶质分子为同一分子类型，不发生缔合或解离36 分离因素表示有效成分A与杂质B的分离程度。

β=KA / KBβ=1，K A = KB，分离效果不好；β>1，K A > K B，分离效果好；β越大，KA 越大于KB，分离效果越好。

37 弱电解质的表观分配系数弱酸的表观分配系数：K=K0 /(1 ＋10 pH － pK )弱碱的表观分配系数： K=K0 /(1 ＋10 pK － pH )K0－只与T、P有关； K－与T、P和pH有关K可通过实验求出，而K0不能，可由公式求出。