生物物理技术-1

2、用荧光强度变化检测结合程度
用杀鼠灵滴定人血清白蛋白(HAS)
λex=320nm λem=400nm Scatchard方程： r [L] = Ka (n - r)
Scatchard图
r为每个生物分子结合的荧光分子数，[L] 为游离的荧光分子浓度，Ka为每一位点 固有的结合常数，n为r的最大值。
七、GFP荧光蛋白
一、荧光的发现
1575：N.Monardes Lignum Nephriticum 1852：Stokes 分光计 植物抽提液、矿物、夜明珠、叶绿素、 奎宁 1880：Liebeman最早提出“荧光与化学结构关系”, 的经验法则 为荧光技术的开发应用拉开了序幕
二、荧光与荧光光谱
(2) 环境因素及分子运动对荧光偏振度的影响 A ：温度的影响－温度升高，P降低 A .温度的影响： B：溶液粘度－粘度升高，P升高 C：分子的运动—转动 溶液粘度
旋转弛豫时间rotational relaxation time —
（二）荧光分光光度术中的参量
4、荧光寿命 （Fluorescence liftime --） 荧光衰减为原来激发时最大荧光强度的1/e所需要的时间 I = I0e-kt , =1/k 表示分子处于激发态时间的长短（平均值），约ns级。 分子所处的环境 有无淬灭 有无能量转移 有无分子间相互作用
氢灯的能量分布
氘灯的能量分布
氙灯（红线）和带有玻璃外套的汞灯的能量分布
实践中常不选用强光源：
随着光强的增加，会同时导致散射光和热量的增多
强光源照射，容易使样品产生光化分解 强光源需要的稳压稳流装置复杂而昂贵 产生大量臭氧，损害健康
对于光源要注意以下几点:
（1）正负极不要接错。
（2） 拿灯时，不要碰窗口，以免手上的“油污”经紫外照射后，难以清除。 应及时用无水乙醇擦干净。
1、蛋白质的内源荧光
研究生物大分子构象
2、蛋白质的外源荧光
（1-苯胺基萘-8-磺酸盐）
◆ GdnHCl盐酸胍
（三）核酸的荧光分析
1、嘌呤及衍生物
室温，用紫外和可见光照射，中性水溶液中，均无荧光。 酸性介质中，腺嘌呤和鸟嘌呤有荧光。 碱性介质中，鸟嘌呤有荧光
2、嘧啶及衍生物
游离的胸腺嘧啶有自发荧光，但量子产率极低Φ＝0.0015
光漂白 2、淬灭(quenching)
(1)温度淬灭：
温度每升高10C ，荧光减少的百分比，称为温度系数。 在20-300C的范围内，温度系数大约为1.5。
(2)浓度淬灭：内滤光效应（inner filter effect) 1O (3)杂质淬灭：3O2 2
3、溶液pH的影响
利用一些物质在不同pH值溶液中荧光强度和颜色的改变， 可以判别各种滴定的终点。
生物物理技术
分子荧光光谱技术 分子振动光谱技术 核磁共振波谱技术 X射线晶体衍射技术 各种显微镜技术 细胞膜片钳技术
生物物理技术的最新进展
荧光光谱技术
Spectrophotofluorimetry
一、荧光的发现 二、荧光与荧光光谱 三、荧光光谱仪及主要谱参量 四、荧光生色团的结构特点 五、影响荧光测量的因素 六、荧光光谱技术在生物医学中的应用
（一）荧光光谱仪
凡是用于研究 光的吸收、发 射和散射的强 度与波长关系 的仪器，均称 之为光谱仪或 分光光度计。 这些仪器通常 都是由光源、 单色器、样品 室、检测器和 显示器等5个基 本单元组成。
1、激发光源
在紫外-可见光区，可供荧光激发用的光源很多包括：钨灯，碘钨灯， 氢灯，氘灯，汞灯，氙灯等。主要根据光源稳定性和强度选择光源。
酚酞
（3）取代基的类型： 1）加强荧光的基团：给电子取代基， -NH2, -NHR, -OH,-OR, -CN,-OCH3,-OC2H5 2）减弱荧光的基团：得电子取代基， -CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-I 3）影响不明显的基团：-R,-SO3H,-NH3
2、分子的能级与跃迁
三重态能级低于单重态 （Hund规则）
激发单重态：分子吸收能 量，电子自旋仍然配对， 为单重态，称为激发单 重态，以S1，S2…表示
激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三 重态，以T1，T2….表示。
基态：电子自旋配对， 多重度=2s+1=1，为单 重态，以S0表示。
（5）荧光探针的应用分类
测定细胞活性的荧光探针：活细胞探针和死细胞探针 膜荧光探针：荧光基团标记的磷脂，阴离子膜探针，阳离子膜探针， 其它非极性和双亲性膜探针。 细胞器荧光探针：线粒体探针，溶酶体、酵母菌液泡和其它酸性细胞器的探针 Ca2＋， Mg2＋， Zn2＋ ，Na＋， K＋， Cl－等离子荧光探针 pH荧光探针: 近中性pH应用的探针，酸性，探针交联物 活性氧和一氧化氮探针 细胞骨架蛋白荧光探针 信号转导探针：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸结合蛋白探针 入胞作用、受体和离子通道探针pH 细胞形态和流体测量的荧光示踪剂
四、荧光生色团的结构特点
1、天然荧光生色团的结构特点
（1）碳原子骨架：
分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环 任何有利于提高π电子共轭度的结构改变，都将提高 荧光效率。 例如：对苯基化，间苯基化等。
（2）分子的几何排布：
具有刚性平面结构
H H OH
HO
O
OH
HO
C
C
O C O
O C O
荧光素
（二）荧光分光光度术中的参量
ex—Maximum excitation wavelength em, max —Maximum emission wavelength
2、荧光强度（fluorescence intensity, F, I ）与 量子产率（quantum yield, ）
（一） 荧光的产生 （二）荧光光谱与吸收光谱
（一） 荧光的产生
1、分子的能量状态
在光学分析中涉及的分子能量有： Eo=Ee+ Ev + Er
Ee：价电子运动能, electron
Ev：原子在平衡位置附近的振动,vibration
Er：分子绕其重心的转动能, rotation 其中，Ee > Ev > Er
1） 荧光强度的定义：在一定激发波长(λex)作用下，发射的 荧光强弱。 2）
=发射光子数/吸收光子数
Ia=I0-I，I=I010-εcL F = I0(1-10-εcL ) {当C很低时F= I0εcL ， {当C较大时F=I0
为吸收系数或消光系数
F=Ia
Lambert-Beer定律：
（二）荧光光谱与吸收光谱
荧光光谱术： 又称荧光分光光度术，属于光谱技术中的一种发 射光谱术。其原理是电磁波和物质作用后，物质首先 吸收电磁波的能量，然后再重新发射电磁波。激发波 段在100-800nm之间，相当于紫外与可见光波段。
三、荧光光谱仪与主要参量 （一）荧光光谱仪
（二）荧光分光光度术中的参量
r= a/b
[L] = [L0] – [LP] = [L0] – r[P0]
（五） 大分子内基团间或分子间距离的测定
荧光共振能量转移 ( Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)
S*+A
S+A* A+h
荧光共振能量转移的三个条件： 供体和受体都能发光
0.2
1.3
282
460
0.04
0.07
6.4
6.3
0.08
0.91
ex: 460nm, em: 570nm 亚硝基奈酚+Tyr ex: 365nm, em: 515nm 茚三酮（Cu2+ pH5.8)+Phe
五、影响荧光测量的因素
1、光分解（photodissociation） 光照后导致化学键断裂——荧光减弱
透膜， RNA,DNA
Pyronin Y （派洛宁 Y）
Bisbenzimide （双苯酰亚胺 ）
545
580
345
460
透膜，DNA
（四） 利用荧光技术检测分子间结合程度
1、用荧光偏振变化检测结合程度
当一些小分子，如辅酶、辅基、半抗原等与特异蛋白质反应时，改变 其荧光特性（强度与偏振），通过这些参数的变化，可以了解他们结 合时的信息。 结合后的大分子驰豫时间长，荧光偏振就大。
3、核酸的荧光标记
Probes Ethidium Bromide （溴乙啶） Propidium Iodine （碘化丙啶 ） PO-PRO-1 iodine Acridine Orange （吖啶橙 ）
ex
em
Note
545 530
435
610 615
455 非透膜， RNA,DNA
490
590
检测物质 维生素A 维生素B2，pH7
激发波长 nm 345 370
发射波长 nm 490 565
维生素B12， pH7
维生素C 3,4-苯并芘10-6g/ml 5-羟色胺，中性或弱酸 性 5-羟色胺，盐酸
275
490 381 295
305
530 403 330
295
550，330
（二）蛋白质的荧光分析
（4）取代基的位置： 邻位、对位—荧光增强，间位—荧光减弱（-CN基例 外） （5）环境、溶剂、温度及pH等均会影响分子结构，从 而影响荧光
四、荧光生色团的结构特点
2、蛋白质和核酸中的荧光生色团
色氨酸
Tryptophan (W, Trp)
酪氨酸
Tyrosine (Y, Tyr)
苯丙氨酸
Phenylalanine (F, Phe)
生色团
Trp
Tyr
条件
H2O, pH7
H2O, pH7
ex nm
280
274
max 10-3
5.6
1.4
em nm
348
303
F
0.2
0.1
F ns
2.6
3.6
敏感度 maxF 10-2
11
1.4
Phe
Y-base 二氢尿嘧 啶
H2O, pH7
Yeast t-RNAPhe
257
320
（3） 灯有寿命，要节约使用。
（4） 启动间隔一般要大于半小时，待灯冷却后，在重新启动。 启动后要预热 半小时。
（5） 不要用眼睛直视灯。
2、样品池
在可见可用玻璃池，但紫外区一定要用石英池。 （1）设置空白对照 。 （2）清洗问题，关键是即时冲洗。
自来水冲洗
SDS浸泡
双蒸水冲洗
浓硝酸处理
双蒸水冲洗
发射波长：440nm
发射波长：430nm
5、溶剂和化学试剂
(1) 溶剂选择要适宜 例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。
(2) 溶剂要纯
6、荧光污染
(1) 涂活塞用的润滑油以及橡皮塞和软木塞 (2) 去污剂 (3) 微生物污染 (4) 滤纸
六、荧光光谱技术的应用
(一) 物质的检测 1、测量原理： 稀溶液， F= I0εcL 2、结构特点：含有“芳香环”结构 3、灵敏度：10-7~10-8g/ml
影响因素
5、荧光探针
(1)具有环状共轭双键即π电子系统
(2)量子产率随环境变化，而且变化很大 (3) 能产生稳定荧光的小分子 藻胆蛋白phycobiliprotein 绿色荧光蛋白Green Fluorescent Protein（395nm， 509nm）
(4) 与研究对象的特定基团共价结合，或与蛋白质非共价结合
供体的发射谱和受体的激发谱必须有部分重叠
供体和受体的距离必须小于100Å
大分子内基团间或分子间距离的测定
Förster 公式: E= R06/(R6+R06) R0: 临界距离，E：转移效率，R：基团间距离 E= 1- IDA/ID IDA: 受体存在时的荧光强度， ID：受体不存在时的荧光强度
荧光强度与浓度的关系
（二）荧光分光光度术中的参量
3 、荧光偏振( fluorescence polarization)
自然光
部分偏振光
偏振光
Βιβλιοθήκη Baidu
荧光
P=
I//-I
I//+I
荧光偏振度Fluorescence polarization -- P
(1) 荧光偏振度的物理意义： A ：I//=I ，P=0，自然光，荧光分子运动很快， 取向随机。（稀溶液中的荧光分子） B：I//或I为0 ，P=±1，平面偏振光，荧光分 子运动很慢或取向有序的情况。 C： I//I 0 ，0<P<1，生物大分子的荧光属 于这种情况。
指示剂 萘酚 荧光素 丫啶橙
颜色变化 无色变黄绿 浅绿变绿 浅黄绿变黄
pH范围 8.2-10.3 4.0-5.0 8.0-10.0
4、溶液极性的影响
荧光物质在非极性溶液中的发射峰位比其在极性溶液中的峰位向短波方向 （或高频方向）移动，即蓝移，同时荧光强度前者也高于后者。
水溶液中
膜 中
ＤＰＨ(膜探针)：１，６－二苯基－１，３，５－己三烯