【小初高学习]2017-2018学年高中生物 第三章 酶的应用技术实践 第二节 制备和应用固定化酶素

第二节固定化酶的制备和应用

1．掌握制备固定化酶的常用方法。(重点)

2．掌握酵母菌细胞的固定化技术。(重难点)

1．固定化酶

固定化酶是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。

2．制备固定化酶的方法

(1)物理吸附法的显著特点是工艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛。

(2)化学结合法是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。

(3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。

3．固定化酶的优点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用。

[合作探讨]

探讨1：对固定化酶的作用影响最小的固定方法是哪一种？

提示：物理吸附法。

探讨2：为什么固定化酶不适合采用包埋法？

提示：由于酶分子较小，容易在包埋材料中漏出，所以不适合采用包埋法固定化。

探讨3：如果反应物是大分子物质，应该采用哪种方法？

提示：因为大分子物质不容易进入细胞内，应采用固定化酶技术。

[思维升华]

1．制备固定化酶的常用方法可用下图所示：

2．常用的制备固定化酶的方法

1．最广泛的细胞固定化方法

凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。

2．优点

(1)无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，降低了生产成本。

(2)不仅可以作为单一的酶发挥作用，且可以利用细胞中所含的复合酶完成一系列的催化反应。

(3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。

3．缺点

(1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。

(2)由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制。

(3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键性的限制因素。

[合作探讨]

探讨1：固定化细胞为什么只能用于生产胞外酶和其他能分泌到细胞外的产物？

提示：因为固定化细胞固定的是活细胞，细胞膜具有选择透过性，细胞内有用的物质(如胞内酶)是不能自由进出细胞的。

探讨2：能否在刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入活化的酵母菌细胞？

提示：不能，因为刚溶化好的海藻酸钠溶液温度较高，会将酵母菌细胞杀死。

探讨3：如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，则说明了什么？如果凝胶珠不是圆形或椭圆形，又说明了什么？

提示：如果凝胶珠的颜色过浅，则说明了海藻酸钠溶液的浓度偏低，固定的酵母菌细胞数目较少；如果凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明了海藻酸钠的浓度过高，制作失败。

[思维升华]

1．制备固定化酵母菌细胞的操作流程

准备各种实验药品和器具

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制备麦芽汁

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活化酵母菌细胞

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制备固定化细胞

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浸泡凝胶珠，用蒸馏水洗涤

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发酵麦芽汁

2．酵母菌细胞的固定化实验需要注意的事项

(1)选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种单一。

(2)酵母菌细胞活化时体积会变大，因此活化前应选择体积足够大的容器，防止酵母菌细胞的活化液溢出。

(3)固定化酵母菌细胞时，应将海藻酸钠与酵母菌细胞的混合液用注射器缓慢滴加到0.05 mol/L的氯化钙溶液中，而不是注射，以免影响凝胶珠的形成。

(4)可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，作为对照。

3．检测凝胶珠是否制作合格的方法

(1)机械法：用镊子夹取一个凝胶珠放在实验桌上，用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠制作成功；也可以在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也表明制备的凝胶珠是成功的。

(2)目测法：合格的凝胶珠应是淡黄色，圆形或椭圆形的。如果颜色过浅呈白色，说明海藻酸钠溶液的浓度过低，固定的酵母菌细胞数目较少；如果形成的凝胶珠形状不规则，则说明海藻酸钠的浓度偏高。