核酸化学与检测

与RNA聚合 酶结合位点
外显子
内含子
外显子
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能 内含子 转录为信使RNA
48 48
真核细胞的基因结构
结构 外 显 子 内 含 子 功能 能够 转录RNA ， 并 编码蛋白质 序 列 能够 转录RNA ， 不能 编码蛋 序 白质 列 特点
编码区下游
RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录 非编码区是指不能转 开始后， RNA 聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板 录为信使 RNA ，也就是 说不能编码蛋白质的核苷 编码区是指能够转录为相 合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着 RNA聚合酶也从 酸序列。 应的信使RNA，进而指导蛋 DNA模板链上脱落下来。
基因的结构
基因（Gene）：是控制生物性状的遗传物质 的功能和结构位是有遗传效应的DNA片段。 噬菌体有360个基因，大肠杆菌有7500个基 因，人约有30000个基因。 每个基因有特定的脱氧核苷酸排列顺序，它代 表着遗传信息。
45
45
原核细胞的基因结构
非编码区
编码区
非编码区
编码区上游
与RNA聚合 酶结合位点
5’ … G-C-T-G-3’ 5’
5’-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’-G-C-T-C …
3’ 3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-5’
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三、 核酸的变性、复性与杂交
１、变性（denaturation）
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解链曲线（熔解曲线，melting curve ）
融解温度melting temperature (Tm) —在DNA热变性时，其A260 的升高达最大值一半时的温度
真核生物成熟 mRNA结构
５’端帽子结构: 经甲基化修饰,以5’,5’-磷酸 二酯键相连的GTP. (m7G5’ppp5’Np) 功能： 与蛋白质合成起始及保护 mRNA不易被降解有关 ３’端尾结构 ３’端：20-250个多聚腺苷 酸结构（poly A）。poly A 不是转录产物 功能： 稳定mRNA
术将一种催生红色素的CHS基因插入牵
牛花中，期望得到更艳丽的花朵 结果：原来开紫花的花色没有加深，花 瓣变成了白色，或杂色
The Plant Cell, 2, 279-289, 1990
12
1998年，Andrew Fire等首次将正义链反义链RNA
混合注入线虫C.elegans中，观察到更强的基因表达
snoRNA
miRNA
Micro RNA Small RNA involved regulation of expression
Other
Including large RNA with roles in chromotin structure and imprinting
siRNA stRNA
Small temporal RNA. RNA with a role in developmental timing
6
• 1953年， Watson和Crick 提出DNA结构的双螺
旋模型。(获得1962年的诺贝尔生理学奖 )
• 1958年，Crick 提出遗传信息传递的中心法则。
• 70年代 建立 DNA 重组技术。
• 80年代以后, 分子生物学、分子遗传学等学科突 飞猛进发展。
7
20世纪50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构 模型和半保留复制
tRNA
Transfer RNA Interface between mRNA & amino acids
snRNA
Small nuclear RNA Small nucleolar RNA -Incl. RNA that Found in nucleolus, form part of the involved in modification spliceosome of rRNA
RNA 腺嘌呤（A）
鸟嘌呤（G）
胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T）
鸟嘌呤（G）
胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U）
碱 基:
基本碱基
碱基---嘌呤碱（purine）与嘧啶碱（pyrimidine）的衍 生物。杂环化合物 ，嘧啶由2个氮原子取代苯分子间位
上的2个碳形成，嘌呤为双环结构 。
N 7 8 9 NH
5
4
6 1N 3 N
抑制。首次提出了RNA interference的概念
Double-stranded RNA
sense antisense
inject
13
第二部分 核酸化学
14
核酸化学概述
核酸（nucleic acid) 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA) —贮存细胞所有的遗传信息，是物种保持进化和 世代繁衍的物质基础 核糖核酸(ribonucleic acid，RNA) —参与蛋白合成的有3类： 信使核糖核酸 (messenger ribonucleic acid,mRNA) 转运核糖核酸(transfer ribonucleic acid,tRNA) 核糖体核糖核酸 (ribosome ribonucleic acid,rRNA)
5 4 3 2 N
O
NH
6 1 NH
NH2
NH
O源自文库
尿嘧啶(uracil, U)
O H3 C
N NH
NH
NH
O
O
胞嘧啶(cytosine, C)
胸腺嘧啶(thymine, T)
21 21
RNA和DNA含有的共同碱基成分---腺嘌呤(adenine,
A)、鸟嘌呤( guanine, G )和胞嘧啶( cytosine, C )。
核酸的理化性质
37
一、核酸的大小 DNA：人单倍体细胞中为2.9109bp RNA：分子较小
二、核酸的水解 1、化学法 低pH 发生磷酸二酯键水解 高pH RNA的磷酸酯键易被水解，DNA则不易被水解 2、酶法 ①按底物专一性： 核糖核酸酶（RNase）、脱氧核糖核酸酶（DNase） ②按对底物作用方式 核酸外切酶：5’ 3’外切酶、 3’ 5’外切酶 核酸内切酶：多核苷酸内部的磷酸二酯键
20世纪50年代末和60年代提出了“中心法则” 和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码
中心法则
遗传密码 64个密码子 61个代表各种氨基酸（AUG起始密码） 3个密码子为终止子 （UAA、UAG、UGA）
操纵子 用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质
转录后基因沉默(PTGS)的发现
目的：1990年美国人纳波里利用转基因技
维持DNA二级结构稳定性的因素 碱基对间 氢键 碱基的堆积力 范氏引力 疏水键 正负电荷作用
（三）DNA的三级结构 —DNA链进一步扭曲盘旋形成超螺旋结构
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（四）DNA的四级结构
一条DNA的长链经过一级结构即形成核小体后,其长度被 压缩了7倍 二级结构,即形成螺旋管后,DNA长度又被压缩了6倍 三级结构,即由螺线管形成超螺线管后,DNA的长度在二级 结构的基础上被压缩了40倍 在由三级到四级结构,即形成染色单体后,DNA的长度在三 级结构的基础上被压缩了5倍
• 1944年，Avery等通过肺炎球菌转化试验，揭示 了核酸的生物学功能（以后大量实验都证明DNA 是遗传物质）。
4
1946年，Chargaff 法则
不同种生物DNA分子中的核苷酸排列顺序不同 (有种族特异性) 同种生物不同组织器官细胞中DNA分子的核苷 酸排列顺序相同 (无组织器官特异性) 某一特定生物，其DNA碱基组成恒定 任何生物DNA碱基组成都符合 A=T， G=C， A+G=T+C
核酸化学与检测
上海市临床检验中心 王庆忠 wangqingzhong@sccl.org.cn
主要内容
核酸的发现及与生命的关系
核酸化学基础
核酸的检测
2
第一部分 核酸的发现 及与生命的关系
3
• 早期发现- 1868年， 瑞士科学家 F. Miescher从外
科绷带脓细胞的核中分离出一种富含磷的有机物 质“核素”（nuclein），后称为核酸（nucleic acid）。
二者的区别---RNA含有尿嘧啶( uracil, U )，而DNA
含有胸腺嘧啶( thymine, T )。
即，DNA(AGCT) ；RNA(AGCU)
22 22
核苷酸基本结 构:
5´-磷酸核苷酸的组成：碱基、戊糖、 磷酸基 。
23 23
常见（脱氧）核苷酸的结构与命名
20 24 24
核苷中的戊糖5’碳原子上羟基被磷酸酯化
常见核苷酸名称
26
核酸的分子结构
27
核酸的一级结构
多核苷酸链中核苷酸的排列顺序（碱基）
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DNA的分子结构 （一）DNA的一级结构
DNA中各脱氧核苷酸的排列顺序 四种脱氧的单核苷酸按照一定的顺序 以3’5’磷酸二酯键连接而形成的多核苷酸链
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（二）DNA的二级结构
Watson-Crick 双螺旋结构学说 （double helix structure）
（1）编码区是间隔的 、 不连续 的 （ 2 ） 在不同的基因中所含
的外显子 内含子 外显子 和 数目不同
编 码 区
（ 3 ）编码区 内含子 的比例小， 大部分由
占 组成
非编码区 有
调控遗传信息的核苷酸
序列
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原核细胞与真核细胞的基因结构比较：
原 核 细 胞真核细胞 真 核 细 胞 原核细胞
不 不 同 同 相 相 同 同 点 编码区是间隔的、 点 编码区是 不连续的 连续的 点 都由能够编码蛋白质的编码区 点 和具有调控作用的非编码区组 成的
核酸的分布
DNA：
存在于真核生物的细胞核内（占总量的98%以上） 及叶绿体和线粒体中；原核生物的拟核与质粒中。
RNA：
主要存在于细胞质（约占90%）及叶绿体和线粒体
中。
16
核苷酸(nucletide)
核苷酸
核苷 碱基
戊糖
磷酸
嘧啶
胞嘧啶 胸腺嘧啶 尿嘧啶
嘌呤
腺嘌呤 鸟嘌呤
脱氧戊糖
核糖
DNA 腺嘌呤（A）
核酸外切酶： 5’ 3’外切酶
3’
5’外切酶
5’ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3’ … A-C-T-T-A-A-G-C … 5’
39
核酸内切酶：多核苷酸内部的磷酸二酯键
5’ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
Small interfering RNA Active molecules in RNA interference
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mRNA的结构
占细胞中总RNA的１% - ５% 不均一分子 有编码序列与非编码序列
34
原核生物mRNA的结构
５’端：翻译起始序列; ３’端：翻译终止序列 少量的间隔序列 无帽无尾
Types of RNA
RNA
mRNA
ncRNA
Non-coding RNA. Transcribed RNA with a structural, functional or catalytic role
rRNA
Ribosomal RNA Participate in protein synthesis
白质的合成的核苷酸序列。
46 46
原核细胞的基因结构
结构 编码区 功能 能转录 mRNA 白质 并 编码 蛋
， 编码区 是 RNA聚合酶结合位点 非 调控 上游 起动并催化转录 起 作用 编 遗传信息 的 码 终止转录mRNA 编码区 区 表达 （终止子） 下游
47 47
真核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游 编码区 非编码区 编码区下游
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2、核酸的复性(renaturation) （退火，annealing）
变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程
影响复性速度的因素： DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度
3、杂交（hybridization）
两条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配 对原则复性形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分 子杂交
5 6
4
2
1 NH
3 2
N
嘌呤 嘌呤---腺嘌呤、鸟嘌呤 嘧啶---胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶
嘧啶
19 19
常见碱基结构
NH2 N
N
嘌呤(purine)
NH
N 7 8 9 NH
N
5
4
6 1N 3 N 2
腺嘌呤(adenine, A)
O N
NH
NH
N
NH2
鸟嘌呤(guanine, G)
20 20
嘧啶(pyrimidine)
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基因的一般结构特征
（一）外显子和内含子
原核生物的基因是DNA分子的一个片段，连续编码； 真核生物的结构编码序列往往是不连续的，被非编码序列 隔开。编码序列称为外显子，非编码序列称为内含子。