离子通道课件讲解
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⑹ TaAKTIｃＤＮＡ：从小麦根中分离的，具有与拟南芥KATI氨基酸顺序76%， 属于Kin通道。
⑺AtKUPI： 该基因是通过校母突变体 互补性分析得到的，呈现 “两 相”
形式，从高亲和相﹙Km 为44μM﹚性到低亲合相﹙Km值为11mM﹚
性的转变范围在100～200μM外界钾离子浓度.高低和 亲系统受到
植物细胞离子通道
植物根系不仅从土壤中吸收水分，还要吸收各种矿质 元素，以维持正常的生命活动，促进植物的生长发育目 的获得高产优质｡如：小麦、水稻、玉米、烟草、蔬菜 、水果等 植物吸收矿质元素首先细胞从环境中吸收，这个环境可 以是植物的生存外部环境，如土壤，也以是植物本身的 内部环境｡ 肥料→离子→吸附→交换→细胞 被动吸收：外液浓度＞细胞浓度 吸收 主动吸收：外液浓度＜细胞浓度 吸收 积累离子
⑴ KATI：从拟南芥中鉴定出来的钾离子运输蛋白，是电压依赖型内向性通道， 在拟南芥保卫细胞和茎根的维管组织中表达，参与气孔开发，并向维管组织中 转运钾离子，不能从土壤中吸收钾离子。拟南芥中的KATI可编码667个AA, 分子 量为79KD.
⑵ AKTI：从效母突变体中采用互补法筛选出来。在根组织中表达，能从土壤 中吸收钾离子，可编码856个AA, 分子量为97KD.
( 3) 机械敏感性: 由细胞膜表面的应力变化控制通道的开放与关闭 状态。 其中以电压依赖性通道最常见
根据生物学功能的特性将离子通道分为三类:
( 1) 电压门控的离子通道,包括Na+、K+、Ca2+ 通道等;
( 2) 受体激活的离子通道, 包括神经递质、激素等外源 性化学物质以及机械和渗透压力刺激所激活的离子通 道;
2.渗透和代谢调节, 例如，气孔运动
3.信号传导， 例如，钙离子是细胞中重要的第二信使之一
4.调节膜电位，例如，植物细胞的动作电位
5.决定细胞的分裂和生长方向，钙离子通道能调节细胞分裂和 生长。
植物体内的离子通道参与了植物生长发育衰老死亡的全过程。
保卫细胞离子通道参与了ABA信号转导过程
离子通道分子水平的研究概况
根据影响离子通道开放的条件可将离子通道分为三大类:
( 1) 电压依赖性: 这种离子通道的开启和关闭状态取决于膜电位的电 压。细胞内钠、钾、钙、氯通道都属于电压依赖性通道。
( 2) 配体门控性: 这种离子通道的开启和关闭取决于各种递质与通 道上受体的结合状态。例如神经细胞膜上的乙酰胆碱受体通道, 该 通道的递质为乙酰胆碱, 其与特异性受体结合时则通道开放, 解离时 则关闭。
膜片钳实验
（1）玻璃微电极使用硬质有芯玻璃毛细管在拉制仪 （PC-10,Narishige）上拉制，实验前用抛光仪（MF900，Narishige）进行抛光。
单通道记录法（Single channel mode）:细胞吸附式(Cell-attached mode)、膜内面向外 Inside out）、膜外面向外(Outside-out)、开放的细胞吸附式膜内面向外(Open cell-attached inside-out mode)和穿孔囊泡膜外面向外（Perforated-vesicle outside-out mode）; 全细胞模式记录法（Whole-cell mode）:孔细胞模式(Hole cell mode)、穿孔膜片模式 (Perforated patch mode)或制真菌素膜片模(Nystatin patch mode)，也称缓慢全细胞模式（Slow whole-cell mode ）。
5mM 和更高浓度的抑制.也受到钾离子通道阻断剂的抑制,在根中表达, 不同钾含量的土壤中吸收钾.
木质部壁细胞含有3个阳离子通道：
⑴ KORC： 为外向型钾离子通道, 调节钾从木质部壁细胞释放到导管 中.
⑵ KIRC：为内向型钾离子通道,调节钾从木质部转移到周围壁细胞重 新吸收
⑶ NORC： 非选择性外向整流阳离子通道，能把盐分释放到木质部的 导管，还负责电信号和水力学信号的传导。
全细 胞钾 离子 通道 电流
单通 道记 录钙 离子 通道 电流
抛光仪
拉制仪
显微镜操作系统及可见光源
冷 光 源
膜片钳放大器、操作系统
低 温 水 浴 摇 床
材料的 好坏直 接影响 膜片钳 实验的 成败！
要根据不同的实验目的来栽培材料。 根细胞：通常根长度在2厘米左右，但突变体要 根据该基因起作用的发育阶段来确定； 保卫细胞：通常在土壤中生长4-6周，但绝不能 抽苔；叶肉细胞对光照要求较高，因为光照直 接影响叶绿体的活动。
K+通道
内向整流通道 : K+in 外向整流通道 ：K+out
阴离子通道
Cl- , NO3-
Ca2+通道
1. 慢流动型通道(SV型)
对阳离子具有选择性,许多一价阳离子( K+ , Na+ , Cs+ ) 和二价阳离子(Ca2 + , Mg2 + , Ba2+ ) 都可通过此通道，而且Cl - 也能极少量的通过。
1) 双微电极钳位法只适用于巨大的神经轴突、肌肉纤维和卵母细胞等较大 的细胞, 对于直径小于10 微米的细胞, 胞内插入两根电极就很困难, 虽然此时可 用单根吸附电极进行电压钳位, 但是对细胞膜的损伤也不可避免;
2) 只能采用全细胞记录模式, 记录到的是整个细胞膜上所有开放通道的电 流总和, 无法了解单通道电流的情况;
( 3) 第二信使激活的离子通道, 包括由细胞内Ca2+、 IP3、G 蛋白及蛋白激酶激活的离子通道。
质膜上的离子通道
植
阴离子通道
物
细
胞
液泡膜上的离子通道
离
子
通 道
阳离子通道
其他细胞器膜上的离子通道
自从在蚕豆保卫细胞膜上发现植物离子通道以来，人们对植物细 胞乃至作为细胞器的液泡膜上离子通道的认识迅速深入,到目前为 止，已经发现植物细胞及其内膜上存在多种离子通道。
离子通道问题和展望
⑴生理作用 ⑵调控的分子机理 ⑶基因的转化和应用
电 压 钳 技 术 示 意 图
电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流, 抵消离子通道开放时所产生 的离子流, 从而使细胞膜电位固定在某一数值. 由于注射的电流与离子流大小相 等、方向相反, 因此它可以反映离子流的大小和方向. 电压钳技术是一种研究可 兴奋细胞电生理特征的基本手段和方法, 但在应用上具有其局限性:
苹果酸(VMAL) 通道 氯离子(VCl) 通道
内向型K+通道AKT1结构模型示意图
具有6个保守的跨膜结构域，其中S4结构域具有电压感 应作用，S5与S6之间有一个形状如发卡的疏水区域，这个 结构区域构成离子通道的孔道部分，具有结合离子的位点。
钙离子通道调节细胞生理活动的模型
1.离子的吸收和转运 研究K离子吸收有二 种途径： ⑴高亲和性 K离子吸收途径,一般浓度为1－200μmol﹒L-1范 围内起作用 ⑵ 低亲和性K离子吸收途，一般浓度为1－10μmol﹒L-1范围 内 起作用径
被动吸收： ⒈扩散作用：指分子或离子沿着化学势梯度或电化学势 梯度转移的现象｡
楞思特方程式：
⒉协助扩散：指小分子物资经膜转运蛋白顺浓度梯度或电化学势梯 度的转运｡
转运蛋白：膜上具有转运功能的蛋白质又称传递蛋白｡ 分为二类：载体蛋白
通道蛋白 ⑴载体蛋白：是一类内部蛋白，由载体蛋白转运的物质首先与载体 蛋白的活性部位结合，结合后载体蛋白发生构象变化，被转运的物质 释放到细胞内。 载体蛋白转运物质具有饱和现象。 ⑵通道蛋白：由细胞膜中一类内部蛋白构成的孔道，或有的称膜中 由大分子组成的孔道 又叫离子通道。可被化学方式或电化学方式激活，控制离子顺势流 过细胞膜，在形成维持跨膜离子梯度和信号传导等生理过程起重要作 用。 检测：膜片钳技术 取几平方微米细胞膜或者全细胞膜，测定跨膜离子电流的大小，即 在保持跨膜电压恒定的条件下，测定通过膜上离子通道的离子流大小 。 其原理，欧姆定律 ：
⑵通道蛋白也称离子通道是由膜中大分子组成的孔道或是 由膜中一类内在蛋白组成的孔道。当这些通道打开时，准 许特定的离子跨膜通过。
植物离子通道的特点
1. 离子转运的被动性 2. 离子的选择性和导度(离子导度：离子跨暯的能力，电阻的 倒数，反应通过离子通道通过离子多少。 ) 3. 通道门控特性 4. 离子转运的高效性 5. 饱和现象 （离子跨膜运输可 分 为被动运输和主动运输 两类。由 扩散作用或物理 过程所决定的运输属于被动运 输；逆浓度梯度或电位梯度 运输 ，需要消耗能量属于主 动运输。离子通道 与载体蛋白都能准许离子沿浓度梯度或 电势梯度扩散，但二者的转运离子的速度有明显差异。载 体蛋白每秒可转运104-105个离子，转运效率低，而离子通 道秒可转运106-107个离子，高出100﹣1000倍，转运效率 高。原因：经载体蛋白转运离子需要与特定的离子结合， 结合的部位数量有限，具有饱和现象，而离子通道则没 有。）
3) 由于电百度文库钳微电极尖端很细( 电阻大) , 会影响记录电流的能力。
膜片钳技术是用微玻管电极膜片电极或膜片吸管接触细胞膜, 以千兆 欧姆以上的阻抗使之封接, 使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域膜片 与其周围在电学上分隔, 在此基础上固定电位, 对此膜片上的离子通道的 离子电流（pA级）进行监测记录的方法.
分析膜上的离子通道，细胞间的离子运输，气孔运动，光受体， 激素受体，及信号传导，广泛应用。
细胞壁
液泡 叶绿体
质膜
植
物
细
胞
液泡膜
膜
系
统
叶绿体、线粒体 等其他细胞器膜
植物离子通道的概念
植物吸收离子涉及到质膜上的转运蛋白。膜转运蛋白分为 两类：
⑴载体蛋白也称载体或转运体。它与特定的离子结合，发 生构象变化，把离子转运过膜。
2. 快流动型通道(FV型) 具有电压依赖性,对阳离子具有选择性。
3. 钾离子通道(VK) 4. 钙离子(VCa) 通道 5. 阴离子通道
与FV型通道类似,VK通道是一种不连续的瞬 间激活的通道。它不具有电压依赖性,这是 该通道与FV 通道的最大区别。
电压激活的液泡钙(VVCa) 通道 肌醇1 ,4 ,5-三磷酸( IP3) 门控的钙通道 cADPR 门控的液泡通道
这两个基因已导入水稻和烟草,具有较强吸收钾离子能力.
⑶ KCOI：从拟南芥数据库中筛选出来的外向型钾离子通道，转运钾离子时依赖 胞质中钙离子，在植物各个部位均有表达，在亚细胞水平上在液泡暯上。
⑷ LKTI：从西红柿根毛特化的cDNA 库克隆出来，LKTI 的 m RNA 在 根中表达。
⑸ ZMK1 和 ZMK2：从玉米胚芽鞘中分离的钾离子通道基因，ZMK1在外部酸性 化时激活 Kin通道，ZMK2电压依赖型。
原生质体的制备
（1）在28℃、60转/分的摇床上用酶解液解离0.5-2小 时左右，根据不同消化时间的细胞状态判断消化程度， 在显微镜下清晰地看到游离 细胞。
（2）用200目尼龙网过滤，基本介质冲洗后60g离心710分钟，弃去上清液，再用50％基本介质洗涤2-3次， 最后将原生质悬浮于溶液中，0～4℃静置恢复。
蚕豆保卫细胞钾通道实验溶液 （1）基本缓冲液：KCl 50mmol/L、Mes 10mmol/L、pH6.1(KOH) （2）基本介质：甘露醇0.45mol/L、CaCl2 0.5mmol/L、MgCl2 0.5mmol/L、抗坏血酸 0.5mmol/L、KH2PO4 10mol/L、Mes 10mmol/L、pH5.5(KOH)。 （3）第一酶液：Cellulysin 0.7%、PVP-40 0.1%、牛血清白蛋白 （BSA）0.25%，溶于45%的基本介质中。 （4）第二酶液：Cellulase RS 1.2%、Pectolyase Y-23 0.01%、BSA 0.25%、抗坏血酸 0.5mmol/L，溶于45%的基本介质中。 （5）细胞外液：谷氨酸钾 10mmol/L、MgCl2 2mmol/L、CaCl2 1mmol/L、KOH 1mmol/L、Mes 10mmol/L、pH5.5(KOH)，用甘 露醇调节渗透压为460mOmol/Kg。 （6）电极溶液：谷氨酸钾 100mmol/L、MgCl2 2mmol/L、KOH 4mmol/L、MgATP 1.1mmol/L、CaCl2 0.1mmol/L、Hepes 10mmol/L、pH7.2 (KOH), 用甘露醇调节渗透压为510mOmol/Kg 。
⑺AtKUPI： 该基因是通过校母突变体 互补性分析得到的，呈现 “两 相”
形式，从高亲和相﹙Km 为44μM﹚性到低亲合相﹙Km值为11mM﹚
性的转变范围在100～200μM外界钾离子浓度.高低和 亲系统受到
植物细胞离子通道
植物根系不仅从土壤中吸收水分，还要吸收各种矿质 元素，以维持正常的生命活动，促进植物的生长发育目 的获得高产优质｡如：小麦、水稻、玉米、烟草、蔬菜 、水果等 植物吸收矿质元素首先细胞从环境中吸收，这个环境可 以是植物的生存外部环境，如土壤，也以是植物本身的 内部环境｡ 肥料→离子→吸附→交换→细胞 被动吸收：外液浓度＞细胞浓度 吸收 主动吸收：外液浓度＜细胞浓度 吸收 积累离子
⑴ KATI：从拟南芥中鉴定出来的钾离子运输蛋白，是电压依赖型内向性通道， 在拟南芥保卫细胞和茎根的维管组织中表达，参与气孔开发，并向维管组织中 转运钾离子，不能从土壤中吸收钾离子。拟南芥中的KATI可编码667个AA, 分子 量为79KD.
⑵ AKTI：从效母突变体中采用互补法筛选出来。在根组织中表达，能从土壤 中吸收钾离子，可编码856个AA, 分子量为97KD.
( 3) 机械敏感性: 由细胞膜表面的应力变化控制通道的开放与关闭 状态。 其中以电压依赖性通道最常见
根据生物学功能的特性将离子通道分为三类:
( 1) 电压门控的离子通道,包括Na+、K+、Ca2+ 通道等;
( 2) 受体激活的离子通道, 包括神经递质、激素等外源 性化学物质以及机械和渗透压力刺激所激活的离子通 道;
2.渗透和代谢调节, 例如，气孔运动
3.信号传导， 例如，钙离子是细胞中重要的第二信使之一
4.调节膜电位，例如，植物细胞的动作电位
5.决定细胞的分裂和生长方向，钙离子通道能调节细胞分裂和 生长。
植物体内的离子通道参与了植物生长发育衰老死亡的全过程。
保卫细胞离子通道参与了ABA信号转导过程
离子通道分子水平的研究概况
根据影响离子通道开放的条件可将离子通道分为三大类:
( 1) 电压依赖性: 这种离子通道的开启和关闭状态取决于膜电位的电 压。细胞内钠、钾、钙、氯通道都属于电压依赖性通道。
( 2) 配体门控性: 这种离子通道的开启和关闭取决于各种递质与通 道上受体的结合状态。例如神经细胞膜上的乙酰胆碱受体通道, 该 通道的递质为乙酰胆碱, 其与特异性受体结合时则通道开放, 解离时 则关闭。
膜片钳实验
（1）玻璃微电极使用硬质有芯玻璃毛细管在拉制仪 （PC-10,Narishige）上拉制，实验前用抛光仪（MF900，Narishige）进行抛光。
单通道记录法（Single channel mode）:细胞吸附式(Cell-attached mode)、膜内面向外 Inside out）、膜外面向外(Outside-out)、开放的细胞吸附式膜内面向外(Open cell-attached inside-out mode)和穿孔囊泡膜外面向外（Perforated-vesicle outside-out mode）; 全细胞模式记录法（Whole-cell mode）:孔细胞模式(Hole cell mode)、穿孔膜片模式 (Perforated patch mode)或制真菌素膜片模(Nystatin patch mode)，也称缓慢全细胞模式（Slow whole-cell mode ）。
5mM 和更高浓度的抑制.也受到钾离子通道阻断剂的抑制,在根中表达, 不同钾含量的土壤中吸收钾.
木质部壁细胞含有3个阳离子通道：
⑴ KORC： 为外向型钾离子通道, 调节钾从木质部壁细胞释放到导管 中.
⑵ KIRC：为内向型钾离子通道,调节钾从木质部转移到周围壁细胞重 新吸收
⑶ NORC： 非选择性外向整流阳离子通道，能把盐分释放到木质部的 导管，还负责电信号和水力学信号的传导。
全细 胞钾 离子 通道 电流
单通 道记 录钙 离子 通道 电流
抛光仪
拉制仪
显微镜操作系统及可见光源
冷 光 源
膜片钳放大器、操作系统
低 温 水 浴 摇 床
材料的 好坏直 接影响 膜片钳 实验的 成败！
要根据不同的实验目的来栽培材料。 根细胞：通常根长度在2厘米左右，但突变体要 根据该基因起作用的发育阶段来确定； 保卫细胞：通常在土壤中生长4-6周，但绝不能 抽苔；叶肉细胞对光照要求较高，因为光照直 接影响叶绿体的活动。
K+通道
内向整流通道 : K+in 外向整流通道 ：K+out
阴离子通道
Cl- , NO3-
Ca2+通道
1. 慢流动型通道(SV型)
对阳离子具有选择性,许多一价阳离子( K+ , Na+ , Cs+ ) 和二价阳离子(Ca2 + , Mg2 + , Ba2+ ) 都可通过此通道，而且Cl - 也能极少量的通过。
1) 双微电极钳位法只适用于巨大的神经轴突、肌肉纤维和卵母细胞等较大 的细胞, 对于直径小于10 微米的细胞, 胞内插入两根电极就很困难, 虽然此时可 用单根吸附电极进行电压钳位, 但是对细胞膜的损伤也不可避免;
2) 只能采用全细胞记录模式, 记录到的是整个细胞膜上所有开放通道的电 流总和, 无法了解单通道电流的情况;
( 3) 第二信使激活的离子通道, 包括由细胞内Ca2+、 IP3、G 蛋白及蛋白激酶激活的离子通道。
质膜上的离子通道
植
阴离子通道
物
细
胞
液泡膜上的离子通道
离
子
通 道
阳离子通道
其他细胞器膜上的离子通道
自从在蚕豆保卫细胞膜上发现植物离子通道以来，人们对植物细 胞乃至作为细胞器的液泡膜上离子通道的认识迅速深入,到目前为 止，已经发现植物细胞及其内膜上存在多种离子通道。
离子通道问题和展望
⑴生理作用 ⑵调控的分子机理 ⑶基因的转化和应用
电 压 钳 技 术 示 意 图
电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流, 抵消离子通道开放时所产生 的离子流, 从而使细胞膜电位固定在某一数值. 由于注射的电流与离子流大小相 等、方向相反, 因此它可以反映离子流的大小和方向. 电压钳技术是一种研究可 兴奋细胞电生理特征的基本手段和方法, 但在应用上具有其局限性:
苹果酸(VMAL) 通道 氯离子(VCl) 通道
内向型K+通道AKT1结构模型示意图
具有6个保守的跨膜结构域，其中S4结构域具有电压感 应作用，S5与S6之间有一个形状如发卡的疏水区域，这个 结构区域构成离子通道的孔道部分，具有结合离子的位点。
钙离子通道调节细胞生理活动的模型
1.离子的吸收和转运 研究K离子吸收有二 种途径： ⑴高亲和性 K离子吸收途径,一般浓度为1－200μmol﹒L-1范 围内起作用 ⑵ 低亲和性K离子吸收途，一般浓度为1－10μmol﹒L-1范围 内 起作用径
被动吸收： ⒈扩散作用：指分子或离子沿着化学势梯度或电化学势 梯度转移的现象｡
楞思特方程式：
⒉协助扩散：指小分子物资经膜转运蛋白顺浓度梯度或电化学势梯 度的转运｡
转运蛋白：膜上具有转运功能的蛋白质又称传递蛋白｡ 分为二类：载体蛋白
通道蛋白 ⑴载体蛋白：是一类内部蛋白，由载体蛋白转运的物质首先与载体 蛋白的活性部位结合，结合后载体蛋白发生构象变化，被转运的物质 释放到细胞内。 载体蛋白转运物质具有饱和现象。 ⑵通道蛋白：由细胞膜中一类内部蛋白构成的孔道，或有的称膜中 由大分子组成的孔道 又叫离子通道。可被化学方式或电化学方式激活，控制离子顺势流 过细胞膜，在形成维持跨膜离子梯度和信号传导等生理过程起重要作 用。 检测：膜片钳技术 取几平方微米细胞膜或者全细胞膜，测定跨膜离子电流的大小，即 在保持跨膜电压恒定的条件下，测定通过膜上离子通道的离子流大小 。 其原理，欧姆定律 ：
⑵通道蛋白也称离子通道是由膜中大分子组成的孔道或是 由膜中一类内在蛋白组成的孔道。当这些通道打开时，准 许特定的离子跨膜通过。
植物离子通道的特点
1. 离子转运的被动性 2. 离子的选择性和导度(离子导度：离子跨暯的能力，电阻的 倒数，反应通过离子通道通过离子多少。 ) 3. 通道门控特性 4. 离子转运的高效性 5. 饱和现象 （离子跨膜运输可 分 为被动运输和主动运输 两类。由 扩散作用或物理 过程所决定的运输属于被动运 输；逆浓度梯度或电位梯度 运输 ，需要消耗能量属于主 动运输。离子通道 与载体蛋白都能准许离子沿浓度梯度或 电势梯度扩散，但二者的转运离子的速度有明显差异。载 体蛋白每秒可转运104-105个离子，转运效率低，而离子通 道秒可转运106-107个离子，高出100﹣1000倍，转运效率 高。原因：经载体蛋白转运离子需要与特定的离子结合， 结合的部位数量有限，具有饱和现象，而离子通道则没 有。）
3) 由于电百度文库钳微电极尖端很细( 电阻大) , 会影响记录电流的能力。
膜片钳技术是用微玻管电极膜片电极或膜片吸管接触细胞膜, 以千兆 欧姆以上的阻抗使之封接, 使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域膜片 与其周围在电学上分隔, 在此基础上固定电位, 对此膜片上的离子通道的 离子电流（pA级）进行监测记录的方法.
分析膜上的离子通道，细胞间的离子运输，气孔运动，光受体， 激素受体，及信号传导，广泛应用。
细胞壁
液泡 叶绿体
质膜
植
物
细
胞
液泡膜
膜
系
统
叶绿体、线粒体 等其他细胞器膜
植物离子通道的概念
植物吸收离子涉及到质膜上的转运蛋白。膜转运蛋白分为 两类：
⑴载体蛋白也称载体或转运体。它与特定的离子结合，发 生构象变化，把离子转运过膜。
2. 快流动型通道(FV型) 具有电压依赖性,对阳离子具有选择性。
3. 钾离子通道(VK) 4. 钙离子(VCa) 通道 5. 阴离子通道
与FV型通道类似,VK通道是一种不连续的瞬 间激活的通道。它不具有电压依赖性,这是 该通道与FV 通道的最大区别。
电压激活的液泡钙(VVCa) 通道 肌醇1 ,4 ,5-三磷酸( IP3) 门控的钙通道 cADPR 门控的液泡通道
这两个基因已导入水稻和烟草,具有较强吸收钾离子能力.
⑶ KCOI：从拟南芥数据库中筛选出来的外向型钾离子通道，转运钾离子时依赖 胞质中钙离子，在植物各个部位均有表达，在亚细胞水平上在液泡暯上。
⑷ LKTI：从西红柿根毛特化的cDNA 库克隆出来，LKTI 的 m RNA 在 根中表达。
⑸ ZMK1 和 ZMK2：从玉米胚芽鞘中分离的钾离子通道基因，ZMK1在外部酸性 化时激活 Kin通道，ZMK2电压依赖型。
原生质体的制备
（1）在28℃、60转/分的摇床上用酶解液解离0.5-2小 时左右，根据不同消化时间的细胞状态判断消化程度， 在显微镜下清晰地看到游离 细胞。
（2）用200目尼龙网过滤，基本介质冲洗后60g离心710分钟，弃去上清液，再用50％基本介质洗涤2-3次， 最后将原生质悬浮于溶液中，0～4℃静置恢复。
蚕豆保卫细胞钾通道实验溶液 （1）基本缓冲液：KCl 50mmol/L、Mes 10mmol/L、pH6.1(KOH) （2）基本介质：甘露醇0.45mol/L、CaCl2 0.5mmol/L、MgCl2 0.5mmol/L、抗坏血酸 0.5mmol/L、KH2PO4 10mol/L、Mes 10mmol/L、pH5.5(KOH)。 （3）第一酶液：Cellulysin 0.7%、PVP-40 0.1%、牛血清白蛋白 （BSA）0.25%，溶于45%的基本介质中。 （4）第二酶液：Cellulase RS 1.2%、Pectolyase Y-23 0.01%、BSA 0.25%、抗坏血酸 0.5mmol/L，溶于45%的基本介质中。 （5）细胞外液：谷氨酸钾 10mmol/L、MgCl2 2mmol/L、CaCl2 1mmol/L、KOH 1mmol/L、Mes 10mmol/L、pH5.5(KOH)，用甘 露醇调节渗透压为460mOmol/Kg。 （6）电极溶液：谷氨酸钾 100mmol/L、MgCl2 2mmol/L、KOH 4mmol/L、MgATP 1.1mmol/L、CaCl2 0.1mmol/L、Hepes 10mmol/L、pH7.2 (KOH), 用甘露醇调节渗透压为510mOmol/Kg 。