菌种的传代 保藏 复壮
微生物菌种保藏及复壮
微生物菌种保藏及复壮5.1. 微生物菌种保藏在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。
微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。
具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。
5.1.1. 蒸馏水悬浮法这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。
好气性细菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜面传代保藏斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。
它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。
但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。
因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。
斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。
此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。
如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。
5.1.3. 矿物油中浸没保藏此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。
特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。
是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。
菌种的保藏与复壮
(二)低温定期移植法
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，
定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是 将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭 菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌 体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当 温度下培养，待菌长好后即可放低温保存， 此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年 以上不发生明显变异。
• (2)保护剂 不同种类的保护剂对不同
微生物的作用是不同的，如个别菌种在 脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达 99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时 死亡率大大减少。一般情况下，那些容 易保存的菌种对保护剂的要求不很严格， 而不易保存的菌种对保护剂的要求却很 苛刻。因此，选择好的保护剂是冷冻干 燥保存菌种的关键因素。
(六)真空冷冻干燥法
• (3)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好
的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是 新鲜的。每支长好的斜面加2～3ml保护剂， 用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养 基)，制成菌悬液。如用液体培养的菌种， 则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细 胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。 悬液中菌数要求达到10 8～10 10cfu/ml 为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分 装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部， 装量可依据冷冻干燥机效能而定。
(六)真空冷冻干燥法
• (4)预冻 分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在-
30～40℃下冻结20～60min，也可以用干冰和无水 乙醇冻5～10min。
• (5)冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中开始
抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在-30℃以下， 并尽快使真度达到66Pa以下。此后可还渐升温以加 速水分升华，但升温不宜过快，以免引起样品融化。 干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而寂， 以样品最终水分含量达到1%～3%为准。具体操作时 是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空 载时最高真空；样品温度与管外温度接近。 完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封，并用高频 真空检测真空度。
《菌种传代与保藏》课件
去除杂菌和变异株
在菌种传代和保藏过程中，难免会混入杂菌或产生变异株。通过鉴定和纯化，可以去除这些杂菌和变 异株，保持菌种的纯度和一致性。这有助于保证实验的可重复性和结果的可靠性。
02 菌种传代技术
液体培养传代法
总结词
通过液体培养基进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到液体培养基中，经过一定时间的培养后，再进行菌种分离和纯化 ，用于后续的实验和研究。该方法操作简便，适用于大规模生产。
固体培养传代法
总结词
在固体培养基上进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到固体培养基表面，经过一定时间的培养后，形成菌落并进行纯化。 该方法常用于分离和鉴定微生物，能够较好地保持菌种的特性。
真空冷冻干燥保藏法
结合低温与干燥两种保藏方法，通过 真空冷冻干燥技术延长菌种存活时间 的方法。
将菌种在低温下进行真空处理，去除 水分，然后保存在干燥的环境中，这 种方法可以显著延长菌种存活时间， 并保持菌种的活性和稳定性。
液氮保藏法
通过将菌种保存在极低温度的液氮中，以延长菌种存活时间 的方法。
将菌种悬浮在液氮中，利用液氮的超低温特性（-196°C）来 延长菌种存活时间。这种方法可以长期保存菌种，但需要专 业的设备和操作技术，且成本较高。
03
及时发现并处理变异菌株
在菌种传代过程中，应密切关注菌种的生长和性状变化。一旦发现变异
菌株，应及时进行分离和鉴定，并采取相应的措施进行处理，以防止其
扩散和影响后续实验结果。
保持菌种的纯度和活性
定期进行菌种鉴定和纯化
菌种的衰退、复壮和保藏
菌种的衰退、复壮和保藏1. 内容1.菌种的衰退：菌种退化是指由于自发突变的结果，而使某一物种有一系列生物学性状发生量变或质变的现象（群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象）。
具体表现为：⏹原有的形态性状变得不典型了；⏹生长速度变慢，产生的孢子变少，或颜色改变，甚至变形；⏹代谢产物生产能力下降，在生理上常指产量的下降；⏹致病菌对宿主侵染力的下降；⏹对外界不良条件包括低温、高温或噬菌体侵染等抵抗能力的下降；等等。
2.衰退菌种的复壮狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择自发的正变个体。
（1）衰退的防止:⏹控制传代的次数⏹创造良好的培养条件⏹利用不易衰退的细胞传代⏹采用有效的菌种保藏方法（2）菌种的复壮⏹纯种分离法⏹通过宿主体复壮对于因长期在人工培养基上移种传代而衰退的病原菌，可接种到相应的昆虫或动、植物宿主体中，通过这种特殊的活的“选择性培养基”一至多次选择，就可从典型的病灶部位分离到恢复原始毒力的复壮菌株。
⏹淘汰已衰退的个体（3）菌种的保藏⏹原理人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。
这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。
⏹常用的方法：冷冻干燥保藏法、液氮保藏法、斜面保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、悬液保藏法、寄主保藏法等。
2. 练习一．填空1.某纯种微生物群体中的个别个体由于发生自发突变的结果，而使该物种原有一系列生物学性状发生衰退性的量变或质变的现象，叫做_____。
答案：衰退2. ______属于第三代的生物武器，包括高致病力的病原体和抗药菌等。
菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程
菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程传代用菌种采用甘油冷冻管保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合甘油并分装至冷冻管中，冷冻管标注菌种名称、代数、保存日期等信息，然后放置于-80℃冰箱中保存。
每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。
5.3.2.2液体石蜡保存法对于一些难以保存的菌种，采用液体石蜡保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合液体石蜡并分装至玻璃瓶中，瓶口用铝箔密封，标注菌种名称、代数、保存日期等信息，保存温度为-70℃。
每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。
5.4菌种的传代传代用菌种每年进行一次复苏和传代。
复苏后，将菌种接种至适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，按照规定的传代代数制备传代用菌种，并及时更新菌种库存记录。
5.5菌种的使用使用菌种前，应先确认菌种的品质和纯度，并按照规定的传代代数制备工作用菌种。
使用后，应及时更新菌种库存记录，并进行相应的消毒处理。
5.6菌种的销毁菌种在使用过程中，如出现变异或污染等情况，应及时进行应灭活处理，并填写《菌种销毁记录表》，经主管部门审核同意后，进行销毁处理。
菌种库存中长期未使用的菌种，应定期进行清理和销毁处理。
菌复苏、复壮；Sabouraud葡萄糖琼脂培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮；青霉素-链霉素琼脂培养基：用于铜绿假单胞菌复苏、复壮。
5.4.1.1.3复苏步骤：1.取出保存好的菌种管，用接种针在酒精灯上消毒；2.将接种针在75%酒精中消毒，再用酒精棉球擦拭消毒；3.用接种针在相应的培养基上进行接种；4.置于适宜温度下孵育，待菌落出现后进行传代或进行实验。
5.4.1.2标准菌株的确认通过形态学、生理生化特性、分子生物学等方法进行鉴定，确认菌株的纯度和种属。
5.4.1.3标准菌株的传代将菌株从原始保存方式中转移到新的保存方式中，确保菌株的保存和传承。
传代次数不宜过多，一般不超过10代。
菌种传代与保藏作业指导书
菌种传代和保藏作业指导书1.标准菌的来源标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。
储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
3.3操作步骤：a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。
e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。
f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。
g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。
观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。
h.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。
菌种的复苏传代及保存标准程序
菌种的复苏传代及保存标准程序目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。
范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。
职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。
内容：菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。
操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。
1.菌种的复苏1.1冻干菌种的复苏检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。
使用前需将其复苏。
1.1.1准备：①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。
②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。
③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。
1.1.2操作：1.1.2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。
1.1.2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。
1.1.2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。
1.1.2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。
1.1.2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。
用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。
1.1.2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。
1.1.2.7 取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。
如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。
1.2 为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。
菌种传代与保藏作业指导书
菌种传代与保藏作业指导书菌种传代与保藏作业指导书1.标准菌的来源标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。
储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、余作为储备管。
黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。
以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。
制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。
其余作为储备管。
将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。
内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。
i．储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。
3.4菌种确认用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。
然后在30～35℃下培养2～3天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。
3.5污染处理假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。
菌种的传代 保藏 复壮
借用一下标准菌验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理介绍了微生物实验中使用的标准菌的验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理规程规定了质量管理部门实验用标准菌种的验收、制备、储管、使用、以及销毁等的相关规定。
适用于微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物（效价）测定、评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果和确认灭菌效果、检验方法的验证、培养基的适用性检查，样品检验时的阳性对照等。
依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。
黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。
中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC （B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。
储存于2～8 ℃，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
菌种繁育—菌种退化与复壮(食用菌生产技术课件)
长，都能会引起食用菌菌种退化。保藏期间如果斜面母种出现子实体，有菌盖形成的情况下，条件 合适就会有孢子弹射到斜面上萌发出菌丝，有性繁殖和无性繁殖混在一起，食用菌菌种发生退化。
二、防衰措施
一、菌种退化
表现
（1）菌丝体生长缓慢、丛生，长势 稀疏、尖端生长不整齐，整齐度下降 。
（2）对环境条件（氧气、温度、酸 碱度、二氧化碳）、杂菌等的抵抗力 变弱，生活力衰退。
（3）品种变劣，出菇迟，产量降低 ，出菇潮次不明显等。
最终都是产量和质量连续性的下降。
一、菌种退化
根源
内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 操作不当：传代过多，条件不适宜
一、菌种退化
根源
内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 操作不当：传代过多，条件不适宜
外因1：培养环境不适合 温度、湿度、通气、光照、PH值、培养基过于丰富或过于贫瘠等，均可造成菌种失去自我调节的能
力，丧失应该具有的优良种性。 外因2：转代次数过多 实际的食用菌生产中，采用不规范的菌种培养和制作，转代的次数越多，引起食用菌菌种退化的可
菌种退化与复壮
目录
一、菌种退化 二、防衰措施 三、菌种复壮
一、菌种退化
概念
食用菌菌种退化是指在正常栽培条件下，食用菌菌种的优良性状及典型 性由于菌丝体的遗传物质发生变异而在传代过程中逐渐丧失的现象。
菌种退化不是某一次转代突然出现的，也不是短时间发生的。只有群体 中退化菌丝在数量上占一定优势后，才有表现，是从量变到质变的渐变 结果，需要较长的时间。食用菌产量和质量的下降是食用菌菌种退化的 最终结果。
菌种的传代、保藏及菌液
菌种保藏标签的规范与要求
菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏 的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标 签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名 称，系列号，传代次数，接种时间等。一 旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必 处理掉处理过程应记录。
严格菌种的质量控制，确保菌种的质量 菌种的质量对检验至关重要，对实验式储 备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种 进行纯度和属性确认外，还应对每一次传 代都进行确认的质量控制系统。因为微生 物菌种从上一代传到下一代时，很可能发 生污染或变异，因此每次传代中至少要对 菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必 要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到 污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实 验。
微生物菌种的使用、保存与管理、验证。 一.制定菌种使用保藏管理程序 （1）做好菌种的来源登记，确保溯源性 清楚. （2）菌种的接收与复活
标准菌种的保藏形式 我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式 包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中， 微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须 的环境条件，一般呈休眠状态。
白色念珠菌—显微镜下菌体形态
黑曲霉
形态特征： 单层和双层瓶梗、孢子头球形
放射状、褐至黑色、孢子梗无色至褐色。
培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成
菌落初为白色羊毛状 ，继而黑色或黑褐色，
粗绒状。
分离培养：快速显色培养基
黑曲霉—显微镜下菌体形态
黑曲霉—电镜下菌体形态
菌种传代的工作环境、工具及其他器皿
和培养条件、保藏方法、储存条件及保存 库址等。
3.在操作过程中，必须严格遵守实验室安 全防护措施规程，采取有效预防措施进行 自我保护。 4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处， 其他部门的人员未经允许不得进微生物实 验室。所有的意外情况，都必须立即向主 管部门报告以便得到及时解决。 5相关记录 在菌种的使用制备与保藏过程 中，应建立菌种制备、保藏和使用的记录 格式。
第六章 菌种复壮衰退及保藏(与“菌种”相关文档)共44张PPT
（5）采用有效的菌种保藏方法
菌种保藏的温度、所用的培养基等可影响自发突变。
（二）菌种的复壮（rejuvenation）
1. 定义
狭义的复壮：
是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典型
性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出 少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状 的相应措施。
（3）淘汰已衰退的个体
S. microflavus“5406”农用抗生菌的分生孢 子，采用－10～－30℃的低温处理5～7天，退 化的个体死亡，留下的10％～20％个体是未退 化的。
二、菌种的保藏
菌种（culture，stock culture）
是一种极其重要和珍贵的生物资源。
菌种保藏（preservation，conservation，maintenance）
纯种分离的方法
粗放
“菌落纯”水平（pure culture in colony lever）
“菌株纯”水平（pure culture in strain lever）
精细
（2）通过宿主体复壮
针对病原菌
衰退的病原菌 接种
活的 “选择性培养基
”
相应的昆虫或动、植物宿主体内
多次选择
从典型的病灶部分分离到恢复原始独立的复壮菌株
（1）定期移植保藏法
操作方法：
将菌种接种在斜面、液体或穿刺培养基上，待生 长完全后，置普通冰箱4℃保藏，湿度50％～70％ 以下，棉塞换成不通气橡皮塞更好。
（国一立） 典国型内菌种收藏馆（NCTC）
抗东生京素 大菌学种应保用藏微管生理物中研心究所（TAM）
创微造生一 物个菌适落合形原态种或的个生体长形条态件的，变就化可；在一定程度上防止菌种衰退 ；
第二章菌种选育、保藏与复壮
（一）样品采集
① 原则
样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。
② 土壤采样方法
土壤的细有菌机、质放线含菌量：和耕通地风、状菜园况和（近5～郊土25壤cm；深度） 土壤的酵p母H和菌植：果被园状树况根的土壤中；
•pH＜7.0 ：霉菌、酵母菌居多 地理条霉件 菌：动植物残体及霉腐土层中； 季•p节H7.条0黑件～曲7.霉5：：细稻菌场、、谷放物线堆菌积丰处富。
黑曲霉
黑曲霉 栖土曲霉 根霉 毛霉 青霉菌 木霉菌 黄曲霉菌 红曲霉
产物 谷氨酸 肌苷酸 淀粉酶 蛋白酶
葡萄糖异构酶
酒精 单细胞蛋白 乳糖酶 柠檬酸 柚苷酶、酸性蛋白
酶 单宁酶、糖化酶 蛋白酶 糖化酶、甾体激素 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 淀粉酶 糖化酶、红曲色素
用途 食用、医药 食用、医药 葡萄糖、糊精、酒精发酵、啤酒酿造 酱油速酿、饲料
❖ 控制传代次数：不超过7代，易变异的不过5代 ❖ 砂土管、冻干管保藏的原种，开启不能超过3次，以防污染。 ❖ 选择良好保藏方法：保证菌不死、不衰、保存活性及原有典型性状 ❖ 良好的培养条件：注意斜面菌株的培养条件（保藏、活化培养基） ❖ 采用不同类型的细胞进行接种
产孢子霉菌 细菌
二、菌种的复壮
❖ 自然选育的定义
利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性 状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株， 达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物 群体分离。
❖ 自然选育的方法
（1）通过表现形态淘汰不良菌株； （2）考察目的代谢产物产量； （3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度； （4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
菌种保藏与复壮
菌种保藏与复壮
一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 （二）常用保藏法 （三）保藏注意
二、菌种复壮
(一）菌种的衰退 （二）复壮方法 （三）防衰措施
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一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 目的 不死亡 不生长 不污染 使菌种 不降低或不丧失其优良性 原理
以尽量延长使用时间
创造不利于菌种生长的一切条件， 使其代谢处于休眠状态。
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口堵胶塞 淹没斜面约1cm
用时转管再转管
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3.自然基质保藏法
麦粒浸透、煮熟 基质的处理 麸皮拌湿 装管
灭菌
接种
培养
干燥器去水
防衰老 特点 保藏时间长 转接后生长旺 易污染，灭菌要彻底
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（三）保藏注意
用保种培养基
及时保藏（菌丝占斜面2/3）
最好换胶塞 用时活化
严防棉塞受潮
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二、菌种的复壮
概念 确保或恢复菌种优良性能的措施
（一）菌种的衰退 表现 形态改变、生长慢、 抗逆性差、产量及质量下降 内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 传代过多，条件不适宜
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根源
（二）复壮法 组织分离 母种 孢子分离
1.繁殖交替法
再生 母种
栽培
子实体
2. 经常改变培养条件 3.转管时只取Leabharlann 端菌丝返回本节低温
缺营养
不利 条件
干燥
无氧
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（二）常用保藏法 以母种形式保藏 1.斜面低温法 斜面菌种置4~6℃冰箱中（3~6个月） 简便 保藏时间短 易污染及退化 不适于草菇等菌类
特点
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几种菌种的保存及复苏方法
几种菌种的保存及复苏方法几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
菌种的复壮与保藏(陈)
混合分装于冻存管内； • 将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔
器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约510毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护 剂混匀后加入冻存管内； • 在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌 种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。
2、连续传代 连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。 一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突
变）的几率越高； 另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞
数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
3、不适宜的培养和保藏条件
不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重 要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、 通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不 仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖， 在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。
➢低温保藏法
•方法：-20℃ •适用：无芽孢厌气菌，放线菌等 •保藏期：1年或更长
➢麸皮保藏法——曲法保藏。
• 措施：以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在 低温干燥条件下保存。
• 方法：麸皮：水＝1：（0.8～1.5） →湿热灭菌 →接种→干燥→低温保存
• 适用：产孢子的霉菌和某些放线菌 • 保藏期：1年～数十年
于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。
3、利用不易衰退的细胞移种传代
在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至 是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核 的，用它接种时，就不会发生这种现象。
另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退， 而改用子囊孢子移种则能避免衰退。
第十三章 工业微生物菌种复壮和保藏
3. 宿主体内复壮法
对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体 病毒等，由于长期使用，其毒力会下降，导致杀虫效率 降低待衰退现象。这时可以用菌种却感染菜青虫幼虫等， 然后从致死的虫体上重新分离，经过几次重复感染与分 离，就可以逐步恢复和提高毒力。
3、干燥保藏法
（1）砂土管保藏法
常采用的保藏方法之一，创造和大自然一样的环境， 在低温、干燥、缺氧、缺营养条件下保藏。主要用于保 藏产孢子的放线菌、霉菌及产芽孢的细菌。
（2） 滤纸条保藏法
将菌体细胞或孢子吸附在湿的无菌滤纸上，再干燥后 置于低温保藏。适合霉菌、酵母和细菌的保藏。
3. 无水硅胶保藏法
三、菌种保藏机构
（一）国内重要菌种保藏机构
（二）国外重要菌种保藏机构
思考题
1、 简答菌种保藏的基本原理和原则。 2、 如何防止菌种退化？ 3、 常用的工业微生物菌种保藏技术有哪些？
（二）连续移代
菌种移接代数越多，发生突变的概率就越高。
（三）培养和保藏条件的影响
不良的培养条件，如培养基组成、pH值、通气等和 保藏条件如营养、培养基含水量，温度、氧气等，不仅 会诱导低产基因型菌株的出现，而且会造成低产基因和 高产基因细胞的数量比发生变化。
二、菌种退化的防止
要采用减少传代、经常纯化、创造良好的培养条 件，用单细胞移植传代以及科学的保藏方法等措施， 不但可以使菌种保持优良的生产能力，而且还能使 已退化的菌种得到恢复提高。
第十三章 工业微生物菌种复壮无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异； b）污染； c）死亡。
第一节 菌种的退化与复壮
菌种传代与复苏
菌种传代与复苏（实操）一、菌种传代与复苏菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。
菌种代号国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心， B——代表细菌，F——代表真菌。
金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 传代和接种菌种冻干粉复苏把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。
先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。
点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。
取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。
菌种斜面传代操作培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。
标签上注明菌种名及菌种编号。
至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。
点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。
左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。
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借用一下
标准菌验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理
介绍了微生物实验中使用的标准菌的验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理规程规定了质量管理部门实验用标准菌种的验收、制备、储管、使用、以及销毁等的相关规定。
适用于微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物（效价）测定、评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果和确认灭菌效果、检验方法的验证、培养基的适用性检查，样品检验时的阳性对照等。
依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书
1.标准菌的来源
标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。
黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。
中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC （B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。
2.标准菌的验收
从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。
储存于2～8 ℃，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备
3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球
3.2培养基
改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.
液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.
营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.
3.3操作步骤：
a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。
e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。
f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。
g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培
养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。
观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。
h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。
确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。
i.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。
以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。
每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。
其余作为储备管。
黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。
以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。
制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。
其余作为储备管。
将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。
内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。
j．储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。
3.4菌种确认
用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。
然后在30～35℃下培养2～3天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。
3.5污染处理
假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。
将此被污染了的培养物灭菌处理。
可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。
并重新制备储备菌种管
3.6菌种的传代与保藏
将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直到第3代为工作菌种。
菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代。
菌种的传代保藏过程
3.3项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。
传第三代时取1支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。
此时，工作用菌种为第3代。
工作用菌种，分为两类：一类用于定期传代(W3)，一类用于实验用（S3）。
定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：
（1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。
（2）将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。
（3）关闭紫外灯。
点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。
（4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。
（5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。
（6）取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。
（7）将已接种好的细菌管置30～35℃细菌培养箱培养22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培养箱最多培养7天。
当工作用菌种传代代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：（W3）可直接转接为（W4）。
按上述程序操作，直至（W4）转为（W5）为止，需重新接种，旧的工作菌种进行销毁。
菌种斜面的培养、保藏条件及时间
菌种培养条件及时间培养基保存条件及时间
大肠埃希菌(CMCC(B)44102) 30～35℃22～24h 营养琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月
金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003) 30～35℃22～24h 营养琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月
枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501) 30～35℃22～24h 营养琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104) 30～35℃22～24h 营养琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094) 30～35℃22～24h 营养琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月
生孢梭菌(CMCC(B)64941) 30～35℃22～24h 营养琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月
白色念珠菌(CMCC(F)98001) 23～28℃最多7天改良马丁琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月
黑曲霉(CMCC(F)98003) 23～28℃最多7天改良马丁琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月
短小芽孢杆菌(CMCC(B)63602) 30～35℃22～24h 营养琼脂培养基2℃～8 ℃保存3个月注：菌种斜面1次/周观察状态是否正常。
3.7菌种的使用及销毁
每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种。
如果要复活其他菌时，应对所用物品重新消毒灭菌。
每次操作，都应进行记录。
菌种管上应贴有牢固的标签。
标明菌种名称、菌种代号、代次、传代人、编号和传代日期、贮存条件、有效期至等。
废弃菌种及实验用品废弃物的处理：121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
并对操作过程进行记录。
药典菌悬液制备是要菌种的新鲜培养物接种至培养基中，培养18-24h再进行稀释，制备菌悬液，
哥伦比亚血琼脂平皿生长的菌落，对氧化酶试验是否有影响？菌悬液的制备过程中，接种菌种新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，这个新鲜培养物怎么理解，冰箱保存斜面菌种是新鲜培养物吗？答：没使用过哥伦比亚血琼脂及相关实验。
新鲜培养物指刚培养好的菌
株，冰箱保存斜面菌种不算新鲜培养物。