大肠杆菌电转化-精品资料
大肠杆菌电转化感受态细胞制备.
大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天:1.将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C 下过夜培养2.高温灭菌大的离心瓶(250-500ml以备第二天摇瓶用3.准备几瓶灭菌水(总量约1.5升,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天:4.转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基的1-2升挡板摇瓶中5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时8.细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天9.用灭菌的冰水重悬浮细胞。
先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升,然后加水稀释至离心管的2/3体积。
10.照上面步骤重复离心,小心弃去上清液11.照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞12.离心,弃上清液13.用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14.照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散15.用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存转化方法:1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟2. 添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡中4. 加载P1000,准备好300μl LB 或2xYT5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏(检查时间常数,应该在3以上6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA 分子的转化。
电转化条件对大肠杆菌TG1转化效率的影响
第２７卷第３期吉林农业科技学院学报Ｖｏｌ.２７Ｎｏ.３２０１８年９月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｅｐ.２０１８电转化条件对大肠杆菌ＴＧ１转化效率的影响刘㊀麒ꎬ王阔鹏ꎬ于凌娇ꎬ刘倩宏∗摘㊀要:研究探索不同条件对ＴＧ１大肠杆菌转化率的影响ꎬ以探索最适合电转化条件ꎮ研究通过对细菌生长曲线绘制ꎬ改变不同生长阶段㊁感受态细胞浓度㊁转化后复苏液以及复苏时间㊁电转化参数㊁质粒浓度㊁抗生素浓度等影响电转化率的条件ꎬ探索最适合的电转化条件ꎮ结果表明ꎬＴＧ１大肠杆菌３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ震荡活化培养时间３ｈ后ꎬ以电压１８００Ｖ㊁电容２５μＦ㊁电阻２００Ω进行电击转化ꎬ以ＬＢ液体对电击细胞复苏４５ｍｉｎꎬ为最佳转化条件ꎮ该结果具有可重复性ꎬ为后续建立基因文库奠定良好基础ꎮ关键词:大肠杆菌ꎻＴＧ１ꎻ电转化基金项目:吉林农业科技学院大学生科技创新项目(吉农院合字[２００９]第１１４３９０２４号)收稿日期:２０１８￣０３￣２６文章编号:１６７４￣７８５２(２０１８)０３￣０００６￣０４作者简介:刘麒ꎬ吉林农业科技学院动物科技学院学生ꎬ本科在读ꎻ刘倩宏ꎬ通讯作者ꎬ吉林农业科技学院动物科技学院副教授ꎬ博士ꎬ研究方向:布鲁菌病ꎮ(吉林㊀１３２１０１)转化是基因重组中的一项重要技术ꎬ是决定平末端连接效率及建立高质量基因文库的关键ꎮ将携带目的基因的质粒成功导入受体细胞的方法有两种:一种是氯化钙法ꎬ另一种是电转化法ꎮ电转化法是利用瞬间高压迫使细胞膜产生孔隙使质粒导入细胞ꎬ其转化率较高[１]ꎮ基因的平末端连接对转化率要求较严格ꎬ需要较高的转化率作为支撑ꎮ目前ꎬ在不同实验室环境的影响下ꎬ感受态细胞的制备以及转化条件都有所不同ꎮ为提高平末端连接㊁转化效率ꎬ进而建立较高质量的文库ꎬ因此本研究通过比较不同电转化条件下大肠杆菌ＴＧ１的转化效率ꎬ为后续噬菌体展示基因文库的建立奠定基础ꎮ１㊀试验材料与方法１.１㊀试验材料与主要仪器大肠杆菌菌株ＴＧ１本室－８０ħ保存ꎻｐＤＪ０１质粒为梅西大学ＪａｓｎａＲａｋｏｎｊａｃ教授惠赠ꎬ－８０ħ保存ꎻ大肠杆菌ＴＧ１株购自广州碧云天生物有限公司ꎻ质粒提取试剂盒购自康为世纪生物有限公司ꎮＬＢ液体培养液:量取胰蛋白胨２ｇꎬ酵母提取物２.０ｇꎬＮａＣｌ１.０ｇꎬ用去离子水定容补足体积至５００ｍＬꎮＳＯＣ培养液:在９５０ｍＬ去离子水中加入胰化蛋白胨２０.０ｇꎬ酵母提取物５.０ｇꎬＮａＣｌ０.５ｇꎬ加入１０ｍＬ２５０ｍｍｏｌ/ＬＫＣｌ溶液ꎬ用５ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ调ｐＨ至７.０ꎮ用去离子水定容１Ｌꎬ高压蒸汽灭菌２０ｍｉｎꎬ备用ꎮ使用前加入５ｍＬ灭菌的２ｍｏｌ/ＬＭｇＣｌ２ꎬ高压灭菌后冷却至６０ħ或６０ħ以下ꎬ加２０ｍＬ除菌的１ｍｏｌ/Ｌ葡萄糖溶液[２]ꎮＬＢ固体培养基(含２０μｇ/ｍＬ氯霉素):称取胰蛋白胨２ｇꎬ酵母提取物２ｇꎬＮａＣｌ１ｇꎬ琼脂糖４ｇꎬ用去离子水定容补足体积至５００ｍＬꎮ待蒸汽灭菌后ꎬ将培养基放置水浴锅中ꎬ待温度降至４０ħ左右添加氯霉素以２０μｇ/ｍＬ的终浓度添加于培养基中ꎮＴＧＬ２０Ｍ离心机㊁超净工作台㊁电转仪(Ｂｉｏ￣ｒａｄ)㊁无菌恒温培养箱(Ｔｈｅｒｍｏｌ)ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀ｐＤＪ０１质粒提取㊀用接种环蘸取一定的菌液在新鲜的ＬＢ(含２０μｇ/ｍＬ氯霉素)固体培养基上交错划线ꎬ３７ħ倒置过夜培养ꎮ挑取单菌落接种于５ｍＬＬＢ(含２０μｇ/ｍＬ氯霉素)液体培养基中３７ħ㊁２００ｒｐｍ/ｍｉｎ过夜震荡培养ꎬ将菌液离心ꎬ利用康为世纪质粒提取盒提取质粒ꎮ１％琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒浓度ꎮ１.２.２㊀ＴＧ１大肠杆菌生长曲线的绘制㊀取出－８０ħ保种的ＴＧ１大肠杆菌ꎬ用接种环蘸取一定的菌液在新鲜的ＬＢ固体培养基上交错划线ꎬ３７ħ过夜㊁静置培养ꎮ挑取单菌落接种于５ｍＬＬＢ液体培养液中ꎬ３７ħꎬ１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡过夜培养ꎬ此即为母液ꎮ按母液与ＬＢ液体培养液１ʒ１００比例ꎬ转接新鲜ＬＢ液体培养液中ꎬ３７ħꎬ１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡培养ꎬ每隔０.５ｈ取菌液０.５ｍＬꎬ直至培养９.５ｈꎬ取不同时间点菌液进行菌落计数ꎬ具体操作参照文献进行ꎬ绘制ＴＧ１株大肠杆菌生长曲线图[３￣４]ꎮ对经过培养的菌液用ＬＢ液体培养液进行１０倍稀释ꎬ稀释成１０－１~１０－１３ꎬ取不同稀释度菌液１００μＬ涂板计数ꎮ试验重复三次ꎮ１.２.３㊀ＴＧ１感受态细胞的制备㊀取２ｍＬ母液转接到２００ｍＬ新鲜的ＬＢ液体培养液中ꎬ３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡培养(振荡培养时间及条件根据１.２.２结果确定)ꎬ冰浴３０ｍｉｎꎮ将冰浴后的菌液分装至预冷的无菌离心管中ꎬ４ħ㊁５０００ｒｐｍ/ｍｉｎ离心２０ｍｉｎꎬ操作始终保持在冰浴环境下进行ꎮ将上清液吸出后ꎬ再用１０％无菌甘油水轻轻吹打重悬细胞ꎬ重复洗涤２次后分别用１０％无菌甘油水重悬细胞沉淀ꎮ每管１００μＬ分装至ＥＰ管中ꎬ－８０ħ保存备用ꎮ１.２.４㊀电转化㊀将２μＬｐＤＪ０１质粒加入１００μＬ感受态细胞中充分混合ꎬ电转化条件为电压１８００Ｖꎬ电容２５μＦꎬ电阻２００Ωꎬ０.１ｃｍ电击杯ꎬ进行电击ꎮ立刻加入５００μＬＬＢ保护受损细胞并转移到离心管中ꎬ再加入４００μＬＬＢ充分吹尽菌体加入到离心管中ꎬ３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡培养４５ｍｉｎꎬ用移液枪吸取１００μＬ涂于ＬＢ固体培养基(２０μｇ/ｍＬ氯霉素)ꎬ３７ħ恒温箱过夜培养ꎬ通过生长的菌落数评价转化效率ꎮ１.２.５㊀ＴＧ１菌株在不同生长阶段对电转化效率的影响㊀通过１.２.２确定的对数生长期ꎬ选取活化后１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ㊁３.０ｈ㊁３.５ｈ的ＴＧ１菌液ꎬ制备感受态细胞ꎬ进行电转化ꎬ条件同１.２.４ꎬ进行菌落计数检测电转化效率ꎮ１.２.６㊀感受态细胞浓度对转化率的影响㊀理论上感受态细胞的浓度越高其转化率越高ꎬ但过高的浓度会使菌体过于粘稠ꎬ不利于质粒与菌体混合ꎬ反而会降低其对质粒的转化率ꎮ按１.２.５优化的最佳条件制备感受态细胞后ꎬ将其分装在４管５０ｍＬ预冷的无菌离心管中ꎬ每管约１００μＬ菌体ꎬ分别加入１０％无菌甘油水进行１ʒ１㊁１ʒ３㊁１ʒ５㊁１ʒ７倍稀释ꎬ以确定感受态细胞制备最佳稀释浓度ꎮ将２μＬｐＤＪ０１质粒分别与不同稀释倍数的感受态细胞混合ꎬ电转化ꎬ其余操作同１.２.４ꎮ１.２.７㊀转化后复苏时间及复苏液对转化率的影响㊀对电击后细胞的复苏液的选取及复苏时间进行优化ꎮ将２μＬｐＤＪ０１质粒与１００μＬ感受态细胞混合ꎬ进行电转化操作同１.２.４ꎬ电击后立即加入９００μＬＬＢ液体培养液和ＳＯＣ培养液ꎬ３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡培养ꎬ分别在０.７５ｈ㊁１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ四个时间点取样ꎮ取不同复苏液及不同复苏时间的菌液样本５０μＬ进行涂板ꎬ恒温箱３７ħ倒置过夜培养ꎬ进行菌落计数ꎮ其余操作同１.２.４ꎮ图１图１.ｐＤＪ０１质粒提取结果１.提取质粒ｐＤＪ０１结果ꎻ２.１００００ｍａｒｋ(条带大小从下到上分别为１００ｂｐ.２５０ｂｐ.５００ｂｐ.７５０ｂｐ.１０００ｂｐ.１５００ｂｐ.２０００ｂｐ.３０００ｂｐ.５０００ｂｐ.１００００ｂｐ)１.２.８㊀电转化条件对转化率的影响㊀选用以下三组不同条件进行电转化:电压１８００Ｖ㊁电容２５μＦ㊁电阻２００Ω㊁０.１ｃｍ电击杯ꎻ电压２５００Ｖ㊁电容２５μＦ㊁电阻２００Ω㊁０.１ｃｍ电击杯ꎻ电压３０００Ｖ㊁电容２５μＦ㊁电阻２００Ω㊁０.２ｃｍ电击杯ꎮ电转化后操作与１.２.４相同ꎬ培养后进行观察ꎮ１.２.９㊀质粒浓度改变对转化率的影响㊀分别取１００ｎｇ/ｍＬ㊁５０ｎｇ/ｍＬ㊁２５ｎｇ/ｍＬ不同浓度的ｐＤＪ０１质粒２μＬ与１００μＬ感受态细胞充分混合ꎬ冰浴静置５ｍｉｎ进行电转化ꎬ操作与１.２.４相同ꎬ根据结果评价质粒浓度改变对转化率的影响ꎮ１.２.１０㊀抗生素浓度对转化率的影响㊀向ＬＢ固体培养基中添加氯霉素使其浓度为１０μｇ/ｍＬ㊁２０μｇ/ｍＬ㊁４０μｇ/ｍＬꎮ利用１.２.８优化的电转化参数对其进行电转化操作后ꎬ分别将其涂布于氯霉素浓度分别为１０μｇ/ｍＬ㊁２０μｇ/ｍＬ㊁４０μｇ/ｍＬ的ＬＢ固体培养基上ꎮ其余操作同１.２.４ꎬ根据结果评价抗生素对转化效率的影响ꎮ２㊀结果２.１㊀ｐＤＪ０１质粒提取结果ｐＤＪ０１质粒提取结果见图１ꎮｐＤＪ０１质粒大小约为１５００ｂｐꎬ在预期位置发现目的条带ꎬ并估算其浓度约为１００ｎｇ/μＬꎮ２.２㊀大肠杆菌ＴＧ１生长曲线的绘制分别取活化后不同时间点ＴＧ１菌液ꎬ绘制细菌生长曲线ꎬ结果见图２ꎮ从图中可看出ꎬ１.５ｈ至５ｈＴＧ１处于对数生长期ꎮ细菌处于对数生长期时的形态㊁染色特性㊁致病性㊁抗药性等生物特征最为典型ꎬＴＧ１生长曲线的绘制对于后续系列转化条件的优化至关重要ꎮ７第３期刘㊀麒ꎬ等:电转化条件对大肠杆菌ＴＧ１转化效率的影响图２大肠杆菌ＴＧ１生长曲线图３ＴＧ１菌株在不同生长阶段对转化率的影响图４细胞浓度对转化率的影响图５ＴＧ１转化时间及复苏液对转化率影响结果图６电转化条件对转化率的影响２.３㊀ＴＧ１菌株在不同生长阶段对电转化率的影响分别取活化后１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ㊁３.０ｈ㊁３.５ｈ的大肠杆菌ＴＧ１菌液制备感受态细胞ꎬ电转化ꎬ进行菌落计数ꎬ结果见图３ꎬ经统计学分析ꎬ各组间差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ因此在活化后３.０ｈ时ꎬ其电转化效率最高ꎮ２.４㊀感受态细胞浓度对转化率的影响取活化后３.０ｈ菌液制备感受态细胞ꎬ以１０％无菌甘油水稀释制备好的感受态细胞ꎬ电转化后确定不同感受态细胞浓度对转化效率的影响ꎬ结果见图４ꎮ经统计学分析ꎬ１组(１ʒ１倍稀释)㊁２组(１ʒ３倍稀释)㊁３组(１ʒ５倍稀释)之间结果无显著差异(ｐ>０.０５)ꎬ１组㊁２组㊁３组与４组(１ʒ７倍稀释)之间结果差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ试验以１ʒ１倍稀释浓度为最佳操作条件ꎮ２.５㊀电转化后复苏培养液及复苏时间对转化率的影响选用ＬＢ和ＳＯＣ不同复苏液对电击后感受态细胞进行复苏ꎬ结果见图５ꎮ用ＬＢ复苏液复苏电击后细胞效果明显优于ＳＯＣ复苏液ꎬ经统计学分析ꎬ差异极显著(ｐ<０.０１)ꎮ选取ＬＢ复苏液后分别摇动０.７５ｈ㊁１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ后ꎬ从图５看出并经统计学分析ꎬ不同复苏时间对转化效率没有影响ꎮ经统计学分析ꎬ差异不显著(ｐ>０.０５)ꎬ因此试验选用电击后复苏０.７５ｈꎮ选取ＳＯＣ复苏液后分别摇动０.７５ｈ㊁１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ后ꎬ从图５看出并经统计学分析ꎬ差异不显著(ｐ>０.０５)ꎬ不同复苏时间对转化效率没有影响ꎮ因此试验选用电击后复苏０.７５ｈꎮ２.６㊀电转化条件对转化率的影响分别设定三组不同电击参数及不同厚度电击杯ꎬ确定其对转化效率影响ꎬ结果见图６ꎮ从图中可以看出第１组即电压１８００Ｖꎬ电容２５μＦꎬ电阻２００Ωꎬ电转化效率最高ꎬ并经统计学分析ꎬ１组与２组㊁３组间差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ为最佳电转化参数ꎮ２.７㊀质粒浓度的改变对转化率的影响选取１００ｎｇ/ｍＬ㊁５０ｎｇ/ｍＬ㊁２５ｎｇ/ｍＬ不同浓度的ｐＤＪ０１质粒２μＬ与１００μＬ感受态细胞充分混合后ꎬ从图７看出１００ｎｇ/ｍＬｐＤＪ０１质粒转化效率最佳ꎬ经统计学分析ꎬ１组与２组㊁３组间差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ为最佳质粒浓度ꎮ２.８㊀抗生素浓度对转化率的影响向ＬＢ固体培养基中分别添加１０μｇ/ｍＬ㊁２０μｇ/ｍＬ㊁４０μｇ/ｍＬ浓度的氯霉素ꎬ从而确定不同浓度抗生素对转化效率的影响ꎮ结果见图８ꎬ抗生素浓度为２０μｇ/ｍＬ时转化率最高ꎬ恰好适宜转化后的细胞增殖并抑制杂菌生长ꎬ经统计学分析ꎬ１组与２组㊁３组间差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ在氯霉素含量为２０μｇ/ｍＬ的条件下ꎬ转化效率最高ꎮ８吉林农业科技学院学报㊀㊀㊀第２７卷图７质粒浓度的改变对转化率的影响图８抗生素浓度对转化率的影响３㊀讨㊀论感受态细胞的制备和转化已经成为分子生物学实验中的一项常规操作ꎬ常见转化方法包括电转化法㊁ＭｇＣｌ２￣ＤＭＳＯ法㊁ＬｉＡｃ和ＣａＣｌ２法等ꎬ而电转化法相对成本较低㊁操作简单㊁转化效率较为理想ꎬ转化条件因实验室不同ꎬ结果也不尽一致ꎬ而且不同的菌株对电转化的反映程度不同ꎬ所用的转化效率和转化条件一定不同[５￣８]ꎮ研究对大肠杆菌ＴＧ１转化条件进行了探索ꎬ为后续平端连接以及建库打下良好的基础ꎮ电压是决定电转化效率的重要参数ꎬ通过运用高电压将细胞的细胞壁电击出可以使大分子物质通过的小孔ꎮ由于利用强电压对细胞进行电击将会对细胞造成极大的损伤ꎬ在此过程中会使较多的细胞受损死亡以及生存受限而难以得到高转化率ꎬ并且死亡的菌体会严重影响细菌的生存空间从而限制其生长ꎮ因此ꎬ严格选择适宜的电压是进行电转化试验时ꎬ达到预期效果和必需条件的重点ꎮ经过试验摸索最适电压为１８００Ｖꎬ此电压电击转化率最好ꎮ研究对ＳＯＣ㊁ＬＢ两种复苏液的效果也进行了比较ꎮＳＯＣ复苏液营养物质含量较ＬＢ更加丰富ꎬ但其对电击后细菌的生长并没有明显促进作用ꎬ即使在复苏过程中ꎬ菌体沉淀量远多于ＬＢ复苏液ꎬ事实上并没有在转化率上体现出来ꎬ分析其原因可能是因为ＳＯＣ复苏液丰富的营养ꎬ相对而言只加速了未受损细胞的生长速度ꎬ而对转化率则没有明显促进作用[９]ꎮ这与黄学娟ꎬ张金迪ꎬ张壮等人的研究不符ꎬ其原因可能是由于试验条件与环境不同而造成的差异ꎮ４㊀结㊀论在本实验室条件下大肠杆菌ＴＧ１株感受态细胞最优制备条件为:ＴＧ１大肠杆菌母液按照１ʒ１００导入新鲜ＬＢ液体培养液后ꎬ３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ活化培养３ｈꎬ感受态终浓度１.４ˑ１０７ꎬ复苏液选用ＬＢ液体培养液ꎬ复苏时间为３.０ｈꎻ最佳电转化条件:为电压１８００Ｖꎬ电容２５μＦꎬ电阻２００ΩꎬｐＤＪ０１质粒浓度为１００ｎｇ/μＬꎬ氯霉素浓度２０μｇ/ｍＬꎮ参考文献:[１]唐颜苹ꎬ王小媚ꎬ何薇ꎬ等.大肠杆菌感受态细胞保存条件的研究[Ｊ].华中农业大学学报ꎬ２００８(６):７４５￣７４８.[２]萨姆布鲁克Ｊ.分子克隆实验指南[Ｍ].３版.北京:科学出版社ꎬ２００２.[３]代军.大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０１５(４):５３￣５４.[４]宋晓蕾ꎬ周芬芬ꎬ吴湜ꎬ等.ｓｐｏ０Ａ基因在艰难梭菌生长及芽孢形成中的作用[Ｊ].中国感染与化疗杂志ꎬ２０１７(１):３３￣３６.[５]ＪａｎｋｏｖｉｃＤｒａｇａｎａꎬＣｏｌｌｅｔｔＭｉｃｈａｅｌＡꎬＬｕｂｂｅｒｓＭａｒｋＷꎬｅｔａｌ.ＤｉｒｅｃｔｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙｏｆａＧｒａｍ￣ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｃｒｅｔｏｍｅ.[Ｊ].Ｇｅｎｏｍｅｂｉｏｌｏｇｙꎬ２００７ꎬ８(１２):１８６￣１９１.[６]张岚岚ꎬ徐春燕ꎬ徐昌杰.大肠杆菌感受态细胞转化能力的影响因素[Ｊ].细胞生物学杂志ꎬ２００４(０４):４２９￣４３２.[７]朱森康ꎬ黄磊ꎬ李燕飞ꎬ等.制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究[Ｊ].生物技术通报ꎬ２０１１(１０):２０６￣２０９.[８]罗锋ꎬ余腾ꎬ范丽梅.感受态细胞制备和质粒转化冰浴时间对大肠埃希菌转化效率的影响[Ｊ].江汉大学学报(自然科学版)ꎬ２０１１ꎬ３９(０３):８２￣８５.[９]黄学娟ꎬ张金迪ꎬ张壮ꎬ等.一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法[Ｊ].基因组学与应用生物学ꎬ２０１７ꎬ３６(１２):５１９９￣５２０４.ʌ责任编辑:吴艳玲ɔ９第３期刘㊀麒ꎬ等:电转化条件对大肠杆菌ＴＧ１转化效率的影响。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
第一节概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。
DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备
3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。
为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。
转化效率为109～1010转化子/µg DNA。
3.1．感受态细胞的制备（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。
（2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000 rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存1～2天）。
（3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000 rpm离心10min。
（4）重复步骤（3）1次。
（5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000 rpm离心10min。
（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。
（7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。
3.2．电转化为了降低离子浓度，待转化的质粒DNA，如质粒或酶连产物，在电转化前应该进行纯化（乙醇沉淀），以下所有步骤都需要保持无菌操作。
（1）从－80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；加入待转化的质粒DNA，冰浴10min；同时将电转化杯进行冰浴。
实际操作中，如果电转化杯浸泡在乙醇中，可提前取出电转化杯，在无菌的超净台上吹干。
（2）打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。
特别注意，不同的电转化杯，所使用的电压不同。
防止电压不够，难以有效转化，以及，电压过高，击爆电转化杯，产生火花，产生危险。
（3）将冰浴后的感受态细胞（含DNA）转移到电转化杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部（注意：其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可，具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明）。
电转化大肠杆菌实验
电转化大肠杆菌
所需试剂和器材：
无水乙醇；70%乙醇；双蒸水；感受态细菌（-80℃冰箱）；LB培养基；抗生素（根据实验目的选择）；1.5ml ep管；电转杯；电转仪
操作步骤：
1．将电转杯以此用双蒸水、70%乙醇、无水乙醇充分清洗（很重要，否则电转杯短路，实验就会失败！），置于空气中充分晾干后，放于冰上；
2．将待电转DNA与感受态细菌混合，加入电转杯的缝隙处。
（除了腺病毒同源重组外，均使用1mm电转杯）
3．选择电转仪的Mannul选项，调节电压为1.8KV，按Pulse键进行电转；用无抗生素的LB培养基500μl冲洗电转杯中细菌，随后转入含抗生素的LB培养基中培养或涂布在抗生素平板上筛选单菌落。
注意事项：
1．电转杯要充分预冷
2．在进行腺病毒的重组实验室，要选用2mm内径的电转杯，其它均使用1mm内径的电转杯。
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)随着基因工程和生物技术的发展，基因克隆和DNA转化技术已经成为生命科学研究的基本技术之一。
大肠杆菌是广泛应用的微生物基因克隆和表达系统，其中电转化是一种常用的DNA转化方法。
在电转化过程中，使用感受态细胞进行DNA 转化可以提高转化效率和获得更多的转化子。
因此，制备感受态细胞及其转化方法研究对开展基因克隆和表达等方面的研究具有非常重要的意义。
感受态细胞制备方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为Luria-Bertani（LB）培养基。
2.细胞质壁分离方法将DH5α菌株经过预培养后，用LB培养基洗涤一次，收集菌落后进行以下步骤。
•在含有1mM EDTA的冷0.5M葡萄糖缓冲液中洗涤细胞三次；•加入60mg/mL的亚胺青钾（IPTG）处理4小时取得感受态细胞。
3.细胞计数及保存使用平板计数器计数，将细胞用LB培养基稀释至约1 x 10^9/mL，添加10% v/v的甘油保存在-80℃。
电转化方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为SOC培养基（Super Optimal broth with Catabolite repression）。
2.DNA处理方法将所需构建质粒经过酶切和纯化等操作处理后，加入所需菌株中进行转化。
3.转化操作•取感受态细胞保存液用LB培养基洗涤3次；•加入所需DNA，静置30分钟使其与感受态细胞充分结合；•以1mm间隔安置两条电极在电转化仪中；•用微管脚吸取约50μL细胞转移到抗电极侧的铝箔上，用蒸馏水润湿铝箔；•将铝箔上细胞转移到电极之间的空间内，使用脉冲电压脉冲电压 1.8 kV, 25 uF, 200Ω电阻取得转化产物。
以上是大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化的实验步骤。
感受态细胞制备方法和电转化方法的优化将提高转化效率和转化获得率，从而为生命科学研究提供更好的服务。
电转化大肠杆菌试验[资料]
![电转化大肠杆菌试验[资料]](https://img.taocdn.com/s3/m/d2110659842458fb770bf78a6529647d2728348c.png)
电转化大肠杆菌
所需试剂和器材：
无水乙醇；70%乙醇；双蒸水；感受态细菌（-80℃冰箱）；LB培养基；抗生素（根据实验目的选择）；1.5ml ep管；电转杯；电转仪
操作步骤：
1．将电转杯以此用双蒸水、70%乙醇、无水乙醇充分清洗（很重要，否则电转杯短路，实验就会失败！），置于空气中充分晾干后，放于冰上；
2．将待电转DNA与感受态细菌混合，加入电转杯的缝隙处。
（除了腺病毒同源重组外，均使用1mm电转杯）
3．选择电转仪的Mannul选项，调节电压为1.8KV，按Pulse键进行电转；用无抗生素的LB培养基500μl冲洗电转杯中细菌，随后转入含抗生素的LB培养基中培养或涂布在抗生素平板上筛选单菌落。
注意事项：
1．电转杯要充分预冷
2．在进行腺病毒的重组实验室，要选用2mm内径的电转杯，其它均使用1mm内径的电转杯。
制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究_朱森康
2011 年第 10 期
朱森康等： 制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究
207
pUC18 均为本实验室保存。 1. 1. 2 主要试验仪器及培养基 分光光度计 Ultrospec 3300 pro 购自 Amersham Biosciences（ Sweden） 。 0. 2 cm 电击杯和 gene Pulser II 电脉冲基因转移仪 均购自 Bio-Rad 公司。LB 培养基： 1% （ W / V） 蛋白 胨，0. 5% （ W / V ） 酵 母 粉，1% （ W / V ） 氯 化 钠。 SOC 培养基： 2% （ W / V） 蛋白胨，0. 5% （ W / V） 酵 母粉，0. 05% （ W / V） 氯化钠，0. 186 g / L 氯 化 钾， 0. 95 g / L 氯化镁，3. 6 g / L 葡萄糖。甘油为国产分 析 纯，氨 苄 青 霉 素 （ Amp ） 购 自 TaKaRa 宝 生 物 公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 感受态细胞的制备 从新鲜活化 LB 平板 上挑取单菌落，接种于 50 mL LB 培养基中，37℃ ， 220 r / min 振 荡 培 养 过 夜 制 备 种 子 液。种 子 液 按 1% 转 接 到 一 定 装 液 量 的 LB 培 养 基 中，37℃ ， 220 r / min 振荡培养。培养一定时间，测定菌液浓度 OD600 达 到 一 定 值 后，取 出 培 养 三 角 瓶，冰 浴 冷 却 20 min，4℃ ，5 000 r / min 离心 15 min，倾去上清液； 将细胞重悬于预冷的去离子水中，4℃ ，5 000 r / min 离心 10 min，重复清洗 3 次。再将细胞重悬于预冷 的 10% （ V / V） 甘油溶液中，4℃ ，8 000 r / min 离心 10 min，重复清洗 3 次。最后细胞用 1 /1 000 初始菌 液体积的预冷 10% （ V / V） 甘油溶液重悬，100 μL 分 装至 1. 5 mL 离心管中，保存于 － 85℃ 备用。 1. 2. 2 电转化及转化效率的计算 取 100 μL 感受 态细胞，冰上融化后，迅速加入 1 ng pUC18 质粒，转 入预冷的电击杯（ 间隙 0. 2 cm） 中，一定电场强度电 击 后 迅 速 加 入 900 μL 37℃ SOC 培 养 基，37℃ ， 220 r / min 培养一定时间。以一定倍 数 稀 释 后，取 100 μL 菌液涂布于 Amp 抗性平板上，37℃ 恒温培 养过夜，菌落计数后按下式计算转化效率。转化效 率（ CFU / μg DNA） = （ 每皿转化子平均数 × 10 × 菌 悬液稀 释 倍 数） / 质 粒 微 克 数，每 一 样 本 同 时 转 化 3 份。
影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨
影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨大肠杆菌电转化是一种高效的基因转移方法，被广泛应用于基因克隆、基因表达和基因组学研究等领域。
然而，大肠杆菌电转化效率受到多种因素的影响，包括细胞状态、基因型、电场强度、电极材料、培养条件、目的基因特性、转录和翻译机制以及转导效果评估等。
本文将对这些因素进行探讨，以期提高大肠杆菌电转化效率。
1. 细胞状态细胞状态对大肠杆菌电转化效率具有重要影响。
一般来说，活细胞比死细胞更易接受外源DNA的导入。
细胞处于对数生长期时，其转化效率最高。
因为此时细胞分裂旺盛，细胞膜通透性较高，有利于外源DNA的导入。
此外，细胞密度也会影响转化效率。
当细胞密度较高时，细胞间的电阻增加，导致电场强度减弱，从而降低转化效率。
2. 基因型不同基因型的大肠杆菌具有不同的电转化特性。
一些菌株由于其基因组结构的不同，对外源DNA的接受能力也会有所不同。
因此，在电转化实验中，应选择适合该实验条件的基因型。
3. 电场强度电场强度是影响大肠杆菌电转化效率的关键因素之一。
在一定范围内，提高电场强度可以增强细胞的通透性，从而提高外源DNA的导入效率。
但是，过高的电场强度会对细胞造成伤害，导致细胞死亡或基因组不稳定。
因此，需要根据细胞的特性和目的基因的特性选择合适的电场强度。
4. 电极材料电极材料对大肠杆菌电转化效率也有重要影响。
一般来说，导电性能好的材料可以提供更稳定的电场，从而提高转化效率。
常见的电极材料包括金属、碳纤维和玻璃纤维等。
在实际应用中，应根据实验条件和设备状况选择合适的电极材料。
5. 培养条件培养条件对大肠杆菌电转化效率具有重要影响。
在培养过程中，需要控制好温度、pH值、氧气浓度等条件。
适宜的培养条件可以促进细胞的生长和分裂，提高细胞的通透性，从而提高转化效率。
6. 目的基因特性目的基因的长度、结构和性质等特性也会影响大肠杆菌电转化效率。
较短的基因片段通常更容易导入细胞，而较长的基因片段则导入难度较大。
大肠杆菌 DH5a电转化操作
Protocol 13DElectro Cell Manipulator™ECM®399/395 ELECTROPORATION PROTOCOLE.coli DH5α, DH1DNA: pUC12Cell Preparation:Growth Medium: L-Broth (10gm bacto tryptone, 5gm bacto yeast extract, 5gmNaCI per liter)Temperature: 37°CCell Density: 0.5 - 1.0 OD600 (~ 1010 cell/ml)Temperature: Chill on iceWashing procedure: Pellet 1 L of culture at 4000 x g at 4o C 15 minWash 1: Resuspend 1 volume sterile cold H2OPellet 4000 x g at 4o C 15 minWash 2: Resuspend 0.5 volume sterile cold H2OPellet 4000 x g at 4o C 15 minWash 3: Resuspend 0.5 volume sterile cold H2OPellet 4000 x g at 4o C 15 minWash 4: Resuspend 0.02 volume sterile cold H2OPellet 4000 x g at 4o C 15 minFinal Dilution: Resuspend 0.002 - 0.003 volume sterile cold 10% Glycerol (filter sterilized)(aliquots may be frozen at -70o C, thaw on ice 5 - 10 min)Electroporation Settings:Mode: HVChamber Gap: BTX Disposable Cuvette P/N 610 (1mm gap)Set Charging Voltage: 1.3 - 1.5kVDesired Field Strength: 13.0 - 15.0 kV/cmPulse Length:Automatically fixed at 5-6 msecElectroporation Procedure:Sample Volume: 40µlTransfectant Volume: 1 µl plasmid (1ng/µl in H2O, low salt TE or ligation mix diluted 1:5 in H2O) Handling: "Flick" cuvette to mix and settle mixture (Note: suspension must touch both sidewalls of cuvetteOperating Temperature: 0°C - chill filled cuvette on ice for 1 min prior to electroporationCharge: Switch the knob A from CHARGE to PULSEDilution Media: Immediately add 960µl LB or SOCThis step is critical - Do Not Delay!Briefly and gently pipet up and down to mix thoroughlyIncubate: Transfer to polypropylene tube and hold at 37°C for 1 hr (shaking at 225 rpmmay improve recovery)Plating: Transfer 1 – 100µl to appropriate agar plateSelection Method: Antibiotic resistanceResults: 1 x 108 - 1 x 109 transformants/µg DNAReference:Personal communication Dr. Steven Mayfield, Scripps Institute,San Diego, CA。
大肠杆菌电转化-精品资料
大肠杆菌电转化感受态细胞制备实验步骤和转化方法实验步骤：1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5 a）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37'C下过夜培养。
2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml ）。
准备几瓶灭菌水（总量约1.5 升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。
3、转移0.2-1ml 过夜培养物至装有500ml LB （或其他营养丰富的培养基）的1-2 升挡板摇瓶中。
4、37C下剧烈振荡培养2-6小时。
5、定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次），当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15 分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）。
6、细胞在4C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4C的10%甘油中保存一两天）。
7、用灭菌的冰水重悬浮细胞。
先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3 体积。
8、照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。
9、照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。
10、离心，弃上清液。
用20ml 灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。
11、用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。
12、将细胞按150g l等份装入微量离心管，于-80 C保存。
转化方法:2、添加1-3g l DNA，冰上培育约5分钟1、在冰上解冻电感受态细胞添加1-10g l DNA，冰上培育约5分钟3、转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中。
4、加载P1000,准备好300 g l LB 或2xYT。
3 以上）5、对电穿孔容器进行脉冲（200欧姆，25 g Fd, 2.5千伏）（检查时间常数，应该在6、立即添加300g l的LB或2xYT至电穿孔容器中。
7、37 C下培养细胞40分钟至1小时以复原。
8、转移细胞至适当的选择培养基上培养。
大肠杆菌电转和文库扩增
科隆生物医学有限公司·保密大肠杆菌基因电转化(1)(制剂范围可以放大或缩小）感应态菌制备培养液和制剂：-无任何抗生素及含有氨苄青霉素/ carbnicillin或其他适当抗生素的LB平板-2×LB或YT培养基500毫升-SOC培养基-冰冷的高压灭菌去离子水：1000毫升-冰冷的高压灭菌10 ％甘油（500毫升）-预冷却的50ml离心管，离心管和电转移杯。
方法：1．从一个新鲜的琼脂平板上接种单个大肠杆菌单菌落到含有5ml的2 ×YT培养基的烧瓶中。
孵育培养5小时或过夜，于37℃和250rpm旋转振荡器培养。
2 。
用5ml过夜的细菌培养物接种到在2升烧瓶中500毫升预热的2 ×YT培养基中。
于37℃搅拌下（250转的旋转振荡器）。
一个小时以后，每20分钟测定OD600值。
3 。
当培养物的OD 600达到0.2.5-0.3 ，迅速将烧瓶转移到冰水浴中15-30分钟。
偶尔转动培养瓶以确保冷均匀。
4 。
转移培养物至50ml冰冷的离心瓶。
在4500rpm和在2 ℃下离心10分钟，收获细胞倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水并在2 ℃下孵育3分钟。
5 。
通过在2 ℃下离心10分钟收获细胞（4500rpm）, 倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水中并孵育3分钟。
6 。
通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬细胞沉淀在25毫升冰冷的10％甘油中。
7 。
通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬沉淀在10毫升冰冷的10 ％甘油。
8 。
通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），小心地倒出上清液，并使用巴斯德吸管残余水滴。
合并和重悬沉淀于1毫升冰冷的10 ％甘油。
9 。
测量1:100稀释的细胞悬浮液的OD600值：用冰冷的10％甘油稀释细胞悬液，然后测定。
浓度应是2× 1011到3× 1010个细胞/ ml 〜OD = 800 -120 （1.0 OD 600 =约2.5× 108细胞/ ml）。
大肠杆菌转化实验(热击法)(PDF)
大肠杆菌转化实验（热击法）大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。
1原理：质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
2器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。
3材料和试剂：质粒DNA，重组DNA，培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。
4实验准备：无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
5操作步骤：（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（3）加入5μl连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。
（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。
（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h.（6）在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB 平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。
（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
大肠杆菌电击转化流程
大肠杆菌感受态制备及电转化流程1.细菌电转化感受态细胞的制备准备:50mL离心管3个10%甘油≥200mL 灭菌蒸馏水≥100mL 冰盒(50mL离心管预冷)2个1)由-80℃冰箱保存的菌种划单菌落,过夜培养16-20h。
晚上将新鲜的菌落接种于装有20mLLB培养基的250mL三角瓶中,37℃振荡培养过夜(约12h),转速控制在200rpm;2)第二天,取过夜培养物以1%接种量(可适当加大)转接入2个含50mLLB培养基的250mL三角瓶中,37℃剧烈振荡(200rpm)培养至OD600约为0.5~0.6;3)将2瓶细菌培养物分别倒入两个预冷的50mL离心管,然后至于冰水混合物中骤冷,一定要骤冷,冰水混合物中冷却至少15min(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)3)将离心管于4℃,4000rpm,离心10min,收集菌体,弃上清;4)用50ml灭菌蒸馏水(预冷至4℃)轻轻重悬菌体,先加入少量水重悬菌体,然后把水加满, 4℃,4000rpm离心10min,弃上清,再重复一次;5)再用10%甘油重复步骤4)两次,4000rpm离心10min,最后一次倒尽上清后,再用残存管底的甘油悬浮细胞,分装ep管,100μL/支(一般,25mL起始培养物最终用200-250μL l0%甘油悬浮);6)放入-80℃冰箱中速冻。
或者立即用于电转化。
注意:1)菌种最好是-80℃冻存的,活化后生长状态较好。
2)20ml培养过夜,振荡速度不要过高(一般应该是37℃,300rpm,6h,当天转接,这样一天内工作量太大,这里我们选择过夜培养,时间长,转速控制在200rpm,可以适当缩短时间,前一天晚接种,第二天早转接)3)培养完毕后一定要骤冷,是培养物在短时间内迅速冷却。
冰水混合物中摇动瓶子,大约15min。
4)使用的器皿一点要非常干净,没有化学物质残存,可以先用餐洗净洗,再加入NaOH固体和蒸馏水产热,最后用蒸馏水反复冲洗干净。
大肠BL21电转感受态制备
大肠杆菌BL21电转感受态的制备
1.菌体的培养：
（1）将BL21在平板上进行划线，37℃培养过夜；
（2）挑取单菌落于5mL试管中，37℃培养8h，之后按1%-2%接种量转接50mL 三角瓶，37℃200rpm培养至OD600=0.3-0.5；
（3）置于冰上停止培养；
2.电转感受态的制备：
（1）将菌液至50mL离心管中，分2管，每管25mL;
（2）4000rpm 5min(4℃)，弃上清；
（3）每个离心管加入10mL提前预冷的无菌水，轻轻弹动使沉淀悬浮，禁止剧烈晃动，4000rpm 5min(4℃)，弃上清，洗2次；
（4）每个离心管加入10mL提前预冷的10%甘油，轻轻弹动使沉淀悬浮，禁止剧烈晃动，4000rpm 5min(4℃)，弃上清，洗2次；
（5）每个离心管加入250uL 10%甘油，100uL分装；
3.验证感受态转化效率
将之前构建好的pET28a-A.aeo11用于电转感受态的转化效率验证，并稀释10x、100x、1000x三个梯度进行涂布，观察菌的生长情况。
电转步骤：
（1）提前将电转杯用超纯水清洗数次，放在小烧杯里照紫外，提前预冷；
（2）取2uL质粒于BL21电转感受态中置冰上5-10min，混合均匀后加入电转杯中，切记不能产生气泡；
（3）电击2.5KV 5ms，立即加入800uL LB培养基混合后吸出至1.5mL离心管中，37℃200rpm复苏45-60min；
（4）3000rpm离心2min，弃上清，剩余菌液按梯度涂布；。
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大肠杆菌电转化感受态细胞制备实验步骤和转化方法
实验步骤：
1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5 a）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37'C下过夜培养。
2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml ）。
准备几瓶灭菌水（总量约1.5 升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。
3、转移0.2-1ml 过夜培养物至装有500ml LB （或其他营养丰富的培养基）的1-2 升挡板摇瓶中。
4、37C下剧烈振荡培养2-6小时。
5、定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次），当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15 分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）。
6、细胞在4C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4C的10%甘油中保存一两天）。
7、用灭菌的冰水重悬浮细胞。
先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至
离心管的2/3 体积。
8、照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。
9、照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。
10、离心，弃上清液。
用20ml 灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。
11、用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。
12、将细胞按150g l等份装入微量离心管，于-80 C保存。
转化方法:
2、添加1-3g l DNA，冰上培育约5分钟
1、在冰上解冻电感受态细胞添加1-10g l DNA，冰上培育约5分钟
3、转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中。
4、加载P1000,准备好300 g l LB 或2xYT。
3 以上）
5、对电穿孔容器进行脉冲（200欧姆，25 g Fd, 2.5千伏）（检查时间常数，应该在
6、立即添加300g l的LB或2xYT至电穿孔容器中。
7、37 C下培养细胞40分钟至1小时以复原。
8、转移细胞至适当的选择培养基上培养。