测定蛋白酶活力实验

测定蛋白酶活力实验

一、实验目的

1.加深了解酶活力的概念。

2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。

二、实验原理

酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。

酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。

实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。

因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。

三、仪器和试剂

仪器:

恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。

原料

枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量L，磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。

试剂

1. Folin-酚试剂：

在2L 磨口

回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4 .

2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为

2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。

2. 0.2mol/L 盐酸溶液

3. L 氢氧化钠溶液

4. L 碳酸钠溶液

5. 10%三氯乙酸溶液

6. 磷酸缓冲液：

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4.12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。取A 液84mL，B 液16mL 混合后，得到磷酸缓冲液，可长期存放。临用时稀释10倍即可。

7. 标准酪氨酸溶液(50μg/mL)：称取以烘干至恒重的酪氨酸，用L 盐酸约30mL 溶解后，蒸馏水定容至250mL。

8. 酪蛋白溶液%)：称取1.25g 酪蛋白，用L 氢氧化钠溶液(20mL)溶解，再用磷酸缓冲液定容到250mL。

四、操作步骤

(一)酪氨酸标准曲线的制作

取6支试管(标号0，1~5)，按顺序分别加入，，，，和标准酪氨酸溶液，再用水

补足到，摇匀后各加入L 碳酸钠，摇匀。依次加入Folin—酚试剂，摇匀并计时，于30℃水浴锅中保温15min。然后680nm 处测定吸光值(以0号管作对照)。以酪氨酸含量(μg)作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

(二)酶活力测定

1.酶反应：取一支试管，加入的酪蛋白溶液，于30℃水浴中预热5分钟，再加入已预热好的枯草杆菌蛋白酶液，立即计时，水浴中准确保温10min，从水浴中取出后，立即加入的10%三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟，干滤纸过滤，收集滤液(样品液)。另取一试管，先加入已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和的10%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数分钟，再加入的酪蛋白溶液，然后于30℃水浴保温10min，同样干滤纸过滤，收集滤液(对照液)。

以上两过程，应各做一次平行实验。

2.滤液中酪氨酸含量的测定

取3支试管，分别加入水、A 液、B 液，然后各加入 mL L 碳酸钠溶液和酚试剂，摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。根据吸光度值，由标准曲线查出A、B 液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力单位。

五、计算

A 样品—样品液的吸光度值

A 对照—对照液的吸光度值

K—标准曲线上A=1时对应的酪氨酸μg 数

V—酶促反应液的体积(本实验为5mL)

T—酶促反应时间(本实验为10min)

N—酶溶液稀释倍数