第三节 核酸的理化性质和研究方法
核酸概述
2、一级结构的表示方法
①结构表示法
碱基、戊糖、磷酸都用 结构式表示，可清楚的 表明核苷酸的连接方式 及排列顺序。
②线条式表示
单字母A,T,G,C表示碱基，竖线表示戊糖，竖线 下端为5´，中间为3´，P表示磷酸基团，斜线表 示3´，5´-磷酸二酯键。 因为体现核苷酸差别的只是碱基。
③ 字母式表示
将核酸在酸、碱或酶的催化下逐步降解，分别鉴定 降解产生的中间产物和最终产物： 核酸（nucleic acid)
核苷酸(nucleotide)
磷酸 (phosphoric acid) 核酸（DNA和 RNA）的基本结构 单位是核苷酸。
核苷(nucleoside) 碱 基 (base)
戊糖 (pentose)
2´ (O)H
作为DNA或RNA结构单元的核苷酸分别是5′脱氧核糖核苷酸和5′-核糖核苷酸。
O HO P OH OH OH 核糖核苷酸 OH2C O B HO
O P OH OH 脱氧核糖核苷酸 OH2C O B
B=腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺密啶
DNA,RNA中主要的碱基、核苷和核苷酸
核苷
腺嘌呤核苷 鸟嘌呤核苷 胞嘧啶核苷 尿嘧啶核苷
核糖 核苷
DNA
D-2-脱氧核糖
脱氧腺嘌呤核苷 脱氧鸟嘌呤核苷 脱氧核糖 脱氧胞嘧啶核苷 核苷 脱氧胸腺嘧啶核苷
修饰核苷
核酸中还存在少量修饰 核苷，有三种： 由稀有碱基参与，如： 5-甲基脱氧胞苷, 次黄嘌呤核苷 由稀有戊糖参与，如： 2’-O-甲基胞苷 碱基与戊糖连接方式特 殊，如： 假尿苷（ψ）C’1-C5
（2）rRNA的一级结构
rRNA是由大约120-5000个核苷酸组成的单链。 真核生物核糖体rRNA有四类：5S rRNA，5.8S rRNA，18S rRNA，28S rRNA。 原核生物核糖体rRNA有三类：5S rRNA，16S rRNA，23S rRNA。 这些rRNA的一级结构均已测定，甲基化修饰较 多发生在核糖上，且真核较原核修饰核苷多。
核酸的理化性质
第三节核酸的理化性质1一、核酸的分子大小一核酸的分子大小二、核酸的溶解度与粘度微溶于水，不溶于有机溶剂，常用乙醇来沉淀DNA ；DNA难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于1-2 mol/L的NaCl溶液，RNA则相反，可据此分离二者。
2三、核酸的酸碱性质核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸是两性电解质。
p对DNA来说，碱基对在pH4.0～11.0最稳定。
3四、核酸的紫外吸收4OD260的应用1.判断核酸样品的纯度–DNA纯品: OD 260/OD 280= 1.8纯–RNA纯品: OD260/OD 280= 2.0–含杂蛋白及苯酚，降低 2. DNA或RNA的定量对于纯样相当于对于纯样品，OD 260=1.0相当于•50μg/ml双链DNA•40μg/ml单链DNA（或RNA）•20μg/ml寡核苷酸5核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。
摩尔吸光系数30.98Aε）＝ε：摩尔吸光系数A：吸收值P WL（）W：每升溶液磷重量L：比色杯内径63.判断DNA是否变性核酸在变性时，紫外吸收增加的现象称为增色效应；在一定条件下，变性核酸可以复性，紫外吸收又恢复到原来水平，这一现象称为减原来水平这现象称为减色效应。
7五、核酸的变性、复性和杂交五核酸的变性复性和杂交（一）变性P260定义：核酸受到加热、极端的pH或离子强度的定义核酸受到加热极端的H降低等因素或特殊的化学试剂作用，其双螺旋区的氢键断裂变成单链的过程。
8变性后其它理化性质变化：OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失9DNA的紫外吸收光谱¾增色效应：当核酸变性时260nm处光吸收值显著增加的现象。
10¾热变性：DNA的稀盐溶液加热到80~100℃，热变性的稀盐溶液热℃几分钟后双螺旋结构被破坏，氢键断裂，两条链彼此分开形成无规则线团的现象。
11¾解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。
核酸的理化性质及应用
核酸的理化性质及应用核酸是一类含有大量核苷酸单元的生物大分子，在细胞中起着重要的生物学功能。
核酸分为两类：脱氧核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。
下面我将介绍核酸的理化性质及应用。
一、核酸的理化性质：1. 化学成分：核酸由核苷酸单元组成，单个核苷酸由一个五碳糖（脱氧核糖或核糖）、一个含氮碱基和一个磷酸基团组成。
2. 结构：DNA是由两条互补的链以双螺旋结构排列而成，RNA是以单链形式存在。
DNA的碱基对是按照互补规则特异性配对的，腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）之间有两个氢键相连，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）之间有三个氢键相连，保持了DNA分子的稳定性。
3. 酸碱性：核酸是一种多酸性物质，可与碱性染料结合。
通过电泳技术可将核酸分离，由于核酸是多酸性的，具有负电荷，在电场中可被迁移，从而实现其分离和纯化。
4. 稳定性：由于DNA中的碱基对通过氢键相连，DNA分子具有较高的稳定性，可在适宜条件下长期储存。
二、核酸的应用：1. 遗传学研究：核酸是遗传物质的重要组成部分，在遗传学研究中发挥着关键作用。
通过对DNA或RNA的序列进行分析，可以揭示生物个体之间的遗传差异，并研究基因与功能的关系。
例如，人类基因组计划（Human Genome Project）使用DNA测序技术对人类整个基因组进行了测序，从而为深入研究人类遗传学奠定了基础。
2. 诊断医学：核酸在疾病诊断中的应用日益重要。
通过PCR（聚合酶链式反应）技术可以在体液或组织中检测到微量的病原体DNA或RNA，从而实现病原体的快速检测和诊断。
例如，在新冠疫情中，核酸检测成为最常用的方法之一。
3. 基因工程：核酸在基因工程领域具有重要应用。
通过将外源DNA或RNA导入细胞中，可以实现基因的插入、删除或替换，从而实现基因改造或修复。
这种技术在生物技术、农业、医学等领域中有着广泛的应用，如转基因作物的培育、基因治疗等。
4. 疾病治疗：核酸药物被广泛应用于疾病的治疗。
核酸基础
§3-2
核酸的结构
第三章 核酸
一、核酸是通过3′,5′磷酸二酯键的多聚体,它的基本单位是核苷酸.
化学组成：核酸→核苷酸→磷酸+戊糖+含氮碱
NH2 N N P OH2 C O N
NH2 N N N N H
碱基
N
OH
H
核苷酸
HOH2C
O
OH
H3PO4
磷酸 核 酸
OH
H
戊糖
第三章 核酸
1. 含氮碱：
N N H
磷含量及紫外吸收值然后算出摩尔磷吸光系数。
(P)=A/cL
=30.98A/WL 一般天然DNA的(P)为6600，RNA为7700～7800。由于 单链核苷酸的(P)比双链的要高，所以核酸发生变性时， (P)升高，故称增色效应；复性时(P)降低，称为减色 效应。
四、核酸的变性、复性与杂交
拖尾序列和尾巴
帽子 前导序列 编码序列 拖尾序列
尾巴
蛋白质
5′—端有帽子，其结构如图
A-A-A-A-A-A-AA ……
功能：保护作用，参与蛋白质合成起始
3′—端有尾巴（多聚A200左右个核苷酸）是转录后在经poly（A）聚合酶作用添加上 去的。 功能：保护作用；
O HN H2 N N
CH3 N+ O N O CH2O P OH OH OH O O P OH O O P OH O P OH2 C 碱基 O
、稀有碱基
见表13-2（解释）
HOH2C
O
OH
HOH2C
O
OH
OH
OH
OH
H
—D—核糖
—D—脱氧核糖
第三章 核酸
3.核苷酸
核酸的性质及研究方法
Cot ½ 是指复性完成一半时的Cot值。
根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数
分子杂交
不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有 碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核 酸分子杂交（hybridization）制备特定的探针（probe） 通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。实例： southern印迹法
DNA的Tm一般在82—95℃之间
2 影响DNA的Tm值的因素
① DNA均一性 。
均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性 。
② G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。 G-C%=（Tm-69.3）×2.44
③ 介质中离子强度 离子强度高，Tm高。
三 核酸的复性
在一定条件下，变性DNA 单链间碱基重新配对恢 复双螺旋结构，伴有A260减小（减色效应）,DNA的 功能恢复。
DNA的复性历程
★ 热变性DNA在缓慢冷却时可以 复性，快速冷却不能复性。
★ DNA片段越大，复性越慢； ★ DNA浓度越大，复性越快。 ★ 复性速度可用Cot衡量。
Cot 是Co 与 t 的乘积，Co 为变性DNA（复性前） 的原始浓度，以摩尔浓度（mol/L）表示，t为复性 时间，以秒（s）表示。
部分双螺旋解开
无规则线团
DNA的变性过程
链内碱基配对
★ 变性因素 ：
热变性 酸碱变性（pH小于4或大于11） 变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）
★ 变性后的理化性质 ：
260nm吸收值升高。 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。
★ DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很 窄的温度范围内。
核酸的性质
核酸的性质核酸的理化性质及研究方法内容十分庞杂，本节只可能对若干比较重要的核酸理化性质和研究方法作概要叙述。
一、一般物理性质1. 溶解度DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，它们都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。
它们可溶于2-甲氧乙醇，但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂，因此，常用乙醇从溶液中沉淀核酸，当乙醇浓度达50%时，DNA就沉淀出来，当乙醇浓度达75%时RNA也沉淀出来。
DNA和RNA在细胞内常与蛋白质结合成核蛋白，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同，DNA核蛋白难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于高浓度（1~2mol/L）的NaCl溶液，而RNA核蛋白则易溶于0.14mol/L的NaCl溶液，因此常用不同浓度的盐溶液分离两种核蛋白。
2. 分子大小DNA分子极大，分子量在106以上，RNA的分子比DNA分子小得多。
核酸分子的大小可用长度、核苷酸对（或碱基对）数目、沉降系数（S）和分子量等来表示。
3. 形状及粘度核酸（特别是线形DNA）分子极为细长，其直径与长度之比可达1：107，因此核酸溶液的粘度很大，即使是很稀的DNA溶液也有很大的粘度。
RNA溶液的粘度要小得多。
核酸若发生变性或降解，其溶液的粘度降低。
二、核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。
DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值（图3-25），其吸光率（absorbance）以A260表示，A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。
在230nm处为吸收低谷，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。
不同核苷酸有不同的吸收特性。
所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。
实验室中最常用的是定量测定小量的DNA或RNA。
对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值，因为蛋白质的最大吸收在280nm处，因此从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。
02-2_核酸的理化性质和研究方法_核酸的结构与功能
部分变性DNA的电镜图像
DNA解链时的紫外吸收变化
➢增色效应(hyperchromic effect)：DNA变性 时其溶液OD260增高的现象。
DNA的解链曲线
连 续 加 热 DNA 的 过程中以温度相对于 A260 值 作 图 ， 所 得 的 曲线称为解链曲线。
解链温度(melting temperature，Tm)
生物化学/Biochemistry
概念、理论、研究、应用
Conception, theory, research, and application
——逻辑和自学
——Logic and LIY (Learn It Yourself)
第二章: 核酸的结构和功能
核酸理化性质和研究方法
第四节
核酸的理化性质
一、核酸分子具有强烈的紫外吸收
核酸在波长 260nm 处有强烈的吸收，是 由碱基的共轭双键所决定的。这一特性常用作 核酸的定性和定量分析。
碱基的紫外吸收光谱
紫外吸收的应用
➢DNA或RNA的定量
A260 = 1.0 相当于 50μg/ml 双链DNA(dsDNA) 40μg/ml 单链DNA (ssDNA or RNA) 20μg/ml 寡核苷酸
解链过程中，紫外 吸光度的变化达到最大 变化值的一半时所对应 的温度。
解链曲线的变化 ➢ G+C 含量越高，解链温度就越高。
三、变性的核酸可以复性或形成 杂交双链
➢当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补链 可重新配对，恢复原来的双螺旋结构，这一现 象称为DNA复性(renaturation) 。
➢热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一 过程称为退火(annealing) 。
3-3核酸的理化性质和应用
医学生物化学国家开放大学
3-3核酸的理化性质和应用
一、核酸的酸碱性质
由于DNA和RNA的多核苷酸链上既有酸性的磷酸基团，又有碱基上的碱性基团，因此它也是两性电解质。
在一定pH溶液中可带某种电荷，故可用电泳方法将其分离。
核酸通常显酸性，易与金属离子生成盐，此时可加入乙醇或异丙醇使其沉淀析出。
二、核酸的高分子性质
核酸还具有高分子化合物的某些性质，如粘度大，沉降速度快。
三、核酸的紫外吸收
核酸分子所含的碱基都有共轭双键，具有吸收紫外线的性质。
在260nm处有最大吸收峰，利用核酸的紫外吸收特性，可以对核酸进行定量测定。
四、核酸的变性、复性与杂交
DNA变性是核酸在某些条件下会发生氢键断裂，双螺旋结构松散分开，即为核酸的变性，但无共价键的断裂。
核酸热变性时，其紫外光吸收峰值达到最大值一半时的温度称解链温度(Tm)。
Tm值大小与核酸分子中的G-C对含量多少及核酸分子的长度有关。
核酸热变性后，在适当条件下，温度再缓慢下降，变性分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象。
解开的两条链又可重新缔合而形成双螺旋，此即为核酸的复性。
不同来源的变性核酸一起复性，有可能发生杂交，核酸分子杂交在分子生物学研究中是一项应用较多的重要实验技术。
核酸分子杂交在DNA复性过程中，如果将不同来源的DNA单链分子放在同一溶液中，或者将DNA和RNA分子放在一起，双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补的核酸分子间，也可以发生在那些碱基序列部分互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间。
-1-。
生物化学第三章核酸
第三节 RNA的结构与功能
Structure and Function of RNA
• DNA和RNA的区别
不同点 戊糖 碱基 二级结构 碱基互补配对 种类 RNA 核糖 G C A U 单链 忠实性较低 多 （mRNA，rRNA， tRNA 等） DNA 脱氧核糖 G C A T 双链 忠实性高 少
碱基互补配对: 腺嘌呤/胸腺嘧啶(A-T)
4.双螺旋表面存在大沟和小沟
小沟
大沟
（二） DNA二级结构的多样性
• 三种DNA构型的比较
螺距 旋向 (nm) 每圈碱 基数 螺旋直径 （nm） 骨架 走行
存在条件
A型 右手 B型 右手
2.3 3.54
11 10.5
2.5 2.4
平滑 平滑
体外脱水 生理条件
（二）碱基
碱基(base)是含氮的杂环化合物。
腺嘌呤
嘌呤 碱基 嘧啶 鸟嘌呤 存在于DNA和RNA中
胞嘧啶
尿嘧啶 胸腺嘧啶 仅存在于RNA中 仅存在于DNA中
NH2
嘌呤(purine，Pu)
N 7 8 9 NH
N
N
NH
5 4
6 3 N
1N 2
腺嘌呤(adenine, A)
O N
N
NH
NH
鸟嘌呤(guanine, G)
(二) 原核生物DNA的环状超螺旋结构
原核生物DNA多为环状，以负超螺旋的形 式存在，平均每200碱基就有一个超螺旋形成。
DNA超螺旋结构的电镜图象
(三) DNA在真核生物细胞核内的组装
真核生物染色体由DNA和蛋白质构成
基本单位是核小体
DNA染色质呈现出的串珠样结构。 染色质的基本单位是核小体(nucleosome)。
核酸理化性质
3.3 核酸的理化性质、分离纯化和含量测定一核酸的分子大小一核酸的分子大小二核酸的溶解度与黏度•核酸微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂•黏滞度：DNA 〉RNA ；dsDNA〉ssDNA•DNA变性，黏度降低三核酸的酸碱性质•核酸是多元酸，具有较强的酸性;•DNA碱基对在pH4.0~11.0之间最稳定•DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5四核酸的紫外吸收天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值1232202402602800.10.20.30.4波长（nm ）光吸收123克原子磷消光系数e(p)•以每升核酸溶液中1克原子磷为标准来计算核酸的消光系数，称为克原子磷消光系数e(p)。
e(p)=A/CL•A：吸收值C：每升溶液中磷的克原子数L：比色杯内径厚度•增色效应hyperchromic effect核酸变性时，紫外吸收值e(p)值显著升高，称为增色效应•减色效应hypochromic effect在一定条件下，变性核酸可以复性，此时紫外吸收值e(p)值又回复至原来水平，称为减色效应五核酸的变性、复性和杂交(一) 变性核酸的变性denaturation维持核酸空间结构的作用力氢键和碱基堆积力被某些理化因素破坏，使核酸的空间结构改变，从而引起核酸理化性质和生物学功能的改变。
•增色效应•Tm值•黏度降低•旋光性降低•沉降系数S增加•浮力密度大大增加•对双链DNA进行加热变性，当温度升高到一定程度时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变化。
Tm：熔解温度(melting temperature) DNA的Tm值一般在70-85℃之间。
影响Tm值的因素•1.DNA的均一性均质DNA Tm范围小异质DNA Tm范围大•ii. G-C含量G-C含量与Tm值成正比关系G-C含量越高，Tm值越大•iii. 介质中的离子强度•离子强度较低的介质中，D N A的T m较低，范围较宽•离子强度较高的介质中，情况则相反•D N A制品保存在较高浓度的缓冲液(一般1m o l/L N a C l溶液)。
第三章 核酸化学
反向平行是指一条链是 5’
一条链必为3’ 5’端。
3’ 端，则另
（二）DNA的二级结构
• 双螺旋结构模型的要点
（2）磷酸与核糖彼此通过3’,5’-磷酸 二酯键相连接位于双螺旋外侧，形成 DNA分子的骨架。碱基位于内侧。碱 基平面与螺旋轴基本垂直，糖环平面 与螺旋轴基本平行。
（二）DNA的二级结构
3.多磷酸核苷酸
A
P ～ P ～ P
O
腺苷一磷酸 （AMP） 二磷酸腺苷（ADP） 三磷酸腺苷（ATP） ATP参与多种物质代谢，为各项生命活动提供能量。
NMP NDP
dNMP
RNA
AU U C G
dNDP dNTP
DNA
A T C G
NTP
AMP UDP CTP
dGMP dADP dTTP
（ TTP ）
功能： 与蛋白质结合形成核蛋白体，是蛋白质
生物合成场所。
结构： 核蛋白体有大、小两个亚基组成。
特点：
数量最多。
（三）mRNA的分子结构与功能
“帽子结构” 的作用：
防止mRNA被降解。 蛋白质生物合成时被起始因子识别的标志。
Poly A的作用：引导mRNA由胞核转移到胞质。
点滴积累
1. DNA的一级结构实质是指碱基的排列顺序。 2. DNA的二级结构是双螺旋型，其要点包括：由两条反向 平行的多核苷酸链围绕中心轴形成；磷酸和脱氧核糖位 于螺旋外侧，碱基位于螺旋内侧；碱基配对具有一定的 规律性，即A与T配对，G与C配对。 3. DNA双螺旋结构模型要点及稳定因素。 4. 3种RNA的空间结构决定了它们在蛋白质生物合成过程 中的不同作用。
E．S
• • • • • •
核酸的理化性质与最常用的研究方法
【检验常识】核酸的理化性质与最常用的研究方法江西检验医学网> 检验与临床知识发核酸的理化性质及研究方法内容十分庞杂，本节只可能对若干比较重要的核酸理化性质和研究方法作概要叙述。
一、一般物理性质1. 溶解度DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，它们都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。
它们可溶于2-甲氧乙醇，但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂，因此，常用乙醇从溶液中沉淀核酸，当乙醇浓度达50%时，DNA就沉淀出来，当乙醇浓度达75%时RNA也沉淀出来。
DNA和RNA在细胞内常与蛋白质结合成核蛋白，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同，DNA核蛋白难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于高浓度（1~2mol/L）的NaCl溶液，而RNA核蛋白则易溶于0.14mol/L的NaCl溶液，因此常用不同浓度的盐溶液分离两种核蛋白。
2. 分子大小DNA分子极大，分子量在106以上，RNA的分子比DNA分子小得多。
核酸分子的大小可用长度、核苷酸对（或碱基对）数目、沉降系数（S）和分子量等来表示。
3. 形状及粘度核酸（特别是线形DNA）分子极为细长，其直径与长度之比可达1：107，因此核酸溶液的粘度很大，即使是很稀的DNA溶液也有很大的粘度。
RNA溶液的粘度要小得多。
核酸若发生变性或降解，其溶液的粘度降低。
二、核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。
DNA 钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值（图3-25），其吸光率（absorbance）以A260表示，A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。
在230nm处为吸收低谷，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。
不同核苷酸有不同的吸收特性。
所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。
实验室中最常用的是定量测定小量的DNA或RNA。
15-核酸的理化性质和研究方法
1Biochemistry. LuJie陆婕Lujie.jane@华中科技大学生命科学与技术学院生物物理与生物化学研究所生物化学BiochemistryBiochemistry. LuJieChapter 15Nucleic Acids:Properties and Techniques核酸的理化性质和研究方法2Biochemistry. LuJie核酸的化学结构和作为高聚物决定其理化性质：核酸的糖苷键和磷酸二酯键：可被水解；磷酸基和碱基：酸碱性质；碱基：紫外吸收特性；双螺旋结构：变性和复性。
3Biochemistry. LuJie核酸的性质溶解度：溶于水酸碱性：生理pH带负电荷分子量和形状：DNA 108~1012，d/l=10-7，“柔性棒”——高黏度不对称性——正旋光性紫外吸收——260nm有最大光吸收核酸的离心沉降DNA 的变性与复性4Biochemistry. LuJie一、核酸的水解二、核酸的酸碱性质三、核酸的紫外吸收四、核酸的变性、复性及杂交五、核酸的分离和纯化六、核酸序列的测定七、核酸的化学合成八、DNA微阵技术5Biochemistry. LuJie（一）酸水解糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解，产生嘌呤和嘧啶碱（二）碱水解: RNA→2’-核苷酸，3’-核苷酸RNA的磷酸酯键更易被碱水解（RNA的核糖上有2’-OH，在碱作用下形成磷酸三酯，极不稳定易水解，产生核苷2’，3’-环磷酸酯，继续水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸）（三）酶水解（消化）专一水解核酸的磷酸二酯键的酶称为核酸酶(nuclease)。
能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）。
67Biochemistry. LuJie限制性DNA 内切酶: 专一性的核酸内切酶，能识别双链DNA 分子的特定序列，并可在该位置或其附近同时切断双链DNA 。
Biochemistry. LuJie核酸外切酶（endonuclease）：从多核苷酸链的末端开始,逐个将核苷酸切下的酶，如：♦3’→5’外切酶(蛇毒磷酸二酯酶)：在3’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是5’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（1）；♦5’→3’外切酶(牛脾磷酸二酯酶)：在5’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是3’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（2）。
第二章(2)核酸的化学(性质)
1．核酸的两性性质及等电点
分子中既含有酸性基团（磷酸基）,也含有碱性基 团（氨基），因而核酸具有两性性质. 因而核酸具有两性性质. 因而核酸具有两性性质 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性 （氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。 核酸的等电点比较低。 核酸的等电点比较低 如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。 RNA的等电点比DNA低的原因:是RNA分子中2′-OH 通过氢键促进了磷酸基上质子的解离，而DNA没有这种 作用。
影响复性速度的因素：
1、分子量越大，复性越难。 分子量越大，复性越难。 单链片段浓度越大，随机碰撞的频率越高，复性越容易。 2、单链片段浓度越大，随机碰撞的频率越高，复性越容易。 片断内的重复序列多，则容易形成互补区，复性较快。 3、片断内的重复序列多，则容易形成互补区，复性较快。 维持溶液一定的离子强度，可加快复性速度。 4、维持溶液一定的离子强度，可加快复性速度。 此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关 的复性也与它本身的组成和结构有关。 此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。
HOCH
2
O H
OH H
HOCH
2
O H
OH H
H H OH D-核核 核
H H OH
OH
H
D-2-脱脱核核 脱
2．核酸的水解
（1）酸或碱水解
核酸分子中的磷酸二酯键可在 酸或碱性条件下水解切断。 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度 有很大差别。例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解， DNA在同样条件下则不受影响。
核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3′-端或5′核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3′-端或5′的作用方式是从多聚核苷酸链的一端 5′ 端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切 开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切 酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。 酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。
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变性后，紫外吸收值增加，粘度、比旋下降，生物 活性部分或全部丧失。
核酸的吸收光谱
增色效应：核酸变性后 紫外吸收值增加。
减色效应：核酸复性后 紫外吸收值降低。
1. 天然 DNA； 2. 变性 DNA 3. 游离核苷酸
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2, 3-环式核苷酸
3. 酶水解
核酸酶（nuclease）
根据作 核酸内切酶 用方式 根据 底物
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核酸外切酶
核糖核酸酶 脱氧核糖核酸酶
例如：
蛇毒磷酸二酯酶/牛脾磷酸二酯酶
外切酶
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粘末端
平末端
限制性内切酶 对外源DNA片 段进行切割
DNA片段 定向插入 质粒载体中
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三、核酸的酸碱性质
核苷酸、DNA和RNA含有磷酸基
和碱基，是两性电解质。
多核苷酸中，磷酸基pK1´=1.5， 因其酸性较强，所以核酸表现为 酸性。
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（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
• 以聚丙烯酰胺为 支持物。常用垂直板电泳。
• 适于分离10 ~ 1000bp 的DNA片段和RNA。
• 凝胶浓度3~ 20%。
例 : ﹤50bp 用12-20%凝胶
DNA测序用电泳槽
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核酸分子的杂交
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核酸杂交可在液相或固相进行。 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上， 而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 分子杂交（印迹法）的类型
Southern
待测 样品 探针 DNA DNA RNA
Northern
RNA DNA RNA
Western （免疫印迹） 蛋白质 （单向电泳分离） 抗体
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Southern 印迹法（Southern blotting）
DNA 中和, 转移, 烘烤 变性的单链DNA转移 并牢固 结合在硝酸纤维素薄膜上
限制性内切酶
限制片段 琼脂糖凝胶电泳 带有DNA片段的凝胶 碱液浸泡 凝胶上DNA变性
（二）RNA的提取
• 关键在于防止RNase对RNA的降解。 • 常用 酸性胍盐 /苯酚 / 氯仿法提取RNA。
不同来源变性DNA的 Cot 曲线
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（三）杂交（hybridization）
定义： 相同或不同来源的两条单链
DNA分子，或单链DNA与RNA 分子，如果在某些区域具互补序 列，则复性时根据碱基互补原则，
可形成DNA-DNA或DNA-RNA
杂交分子。
超螺旋DNA > 线性DNA> 开环DNA
凝胶浓度: 同一DNA片段在不同凝胶浓度中的泳动速度不同， 应选择适宜的凝胶浓度。
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迁移率与碱基对的关系
琼脂糖浓度与可分离片段大小 的关系
琼脂糖的浓度 （%） 线性DNA大小范围 （Kb）
0.3
0.6 0.7
四、核酸的变性、复性与杂交
（一）变性（denaturation） 定义： 高温、酸、碱及某些变性剂（如尿素等）能 破坏核酸中的氢键，使有规律的双螺旋结构变成 单链的、无规律的线团，此作用称DNA的变性。 •变性不涉及共价键的断裂。
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DNA的变性
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侧 视
样品槽模板（梳子）
凝胶托盘 凝胶
俯 视
样品槽 凝胶托盘
水平凝胶电泳示意图
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琼脂糖凝胶水平电泳示意图
Gelred (0.1l/ml)染色
适于分离0.2 ~ 20Kb 的DNA片段。 常用凝胶浓度0.5 ~ 3%。
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1. 热变性
DNA的稀盐溶液加热到 80-100º C，即可发生热变 性。变性在一个较窄的 温度范围内“爆发式” 发生。
熔点（熔解温度，Tm）
DNA双螺旋结构失去一半 时的温度。一般在82-95℃ 之间。
DNA样品的变性和熔解曲线
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常用电泳法分离鉴定核酸分子。
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核酸的凝胶电泳
核酸分子碱性环境下（pH8.0）带负电荷，在电场中 向正极移动。
核苷酸中 碱基的解离
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在碱性环境下（pH8.0）碱基不带电(C, A, G)或带负电(T)，而 磷酸基团带负电，在电场中核酸分子向正极移动。
7. 紫外吸收
嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，所以碱基、核苷、 核苷酸、核酸在240-290nm处有强烈的紫外吸收，最 大吸收峰在260nm处。
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pH 7.0 下核苷酸的吸收光谱和摩尔消光系数
252nm 259nm 267nm 262nm 271nm
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(1) 琼脂糖凝胶电泳
以琼脂糖为支持物。常用水平板电泳。
对核酸分子的分离主要依据分子大小和分子构型， 凝胶浓度对分离效果也有影响。
分子大小：线性DNA的迁移距离(迁移率) 与分子大小 (碱基对, bp) 的对数成反比。
分子构型：泳动速度
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举例：CTAB法提取细菌DNA
CTAB（溴代十六烷基三甲胺）
C19H42BrN
CTAB能与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶
液中可溶并且稳定存在。 然后用酚/ 氯仿/ 异戊醇 去
除蛋白质，用异丙醇 沉淀 DNA。
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限制性内切酶（restriction endonuclease）
是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列， 并由此切断DNA双链的核酸内切酶。 特点： （1）专一性强（识别序列具特殊的回文结构） （2）切割后的DNA片段具粘末端或平末端 DNA体外重组的重要工具酶 应用：
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二、核酸的水解
1. 酸水解
糖苷键和磷酸酯键皆可以被酸水解。 稀盐酸 可水解嘌呤糖苷键; 水解嘧啶糖苷键需要高温和 强酸条件（甲酸等）。
2. 碱水解
RNA可被碱水解为核苷酸。DNA不具2′-OH, 不
能形成碱水解的中间物，所以DNA抗碱。
碱性条件下RNA的水解
5. 特殊颜色反应
核酸的溴化乙锭（EB）染色 EB是一种荧光染料，可插入核酸相邻碱基对之间。 在紫外灯下，结合EB的核酸呈橙红色荧光。灵敏度 为10ng。
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GELred 染色
Gelred是由美国Biotium公司研 发的高灵敏、高稳定、低毒性 的荧光核酸凝胶染色试剂。
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五、核酸的提取和纯化 （一）DNA的提取
DNA与碱性蛋白结合形成核蛋白（DNP）。
• DNP溶于1M NaCl, 不溶于0.14M NaCl。
• 用苯酚、氯仿-异戊醇或蛋白酶K等去除蛋白质。 • 用RNase去除RNA。
• 用乙醇沉淀DNA。
放射性标记探针杂交
DNA-DNA(或RNA)杂交分子 放射自显影 显示出杂交分子的位置
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Southern 杂交示意图
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Northern 杂交示意图
牛胰RNaseⅠ的切割位点
（RNA内切酶）
产物为3´- 嘧啶核苷酸，或以其为尾的寡核苷酸
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DNaseⅠ和DNase Ⅱ的切割位点 （DNA内切酶）
a: DNaseⅠ，产物为5´- 核苷酸，或以其为尾的寡核苷酸
b: DNase Ⅱ，产物为3´- 核苷酸，或以其为尾的寡核苷酸
• 定义：
在一定条件下，变性DNA两条彼此分开的单链重 新缔合成双螺旋结构，这个过程称为复性。
•退火（annealing）
热变性DNA在缓慢冷却时，可以复性，此过程 称为退火。
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DNA热变性和复性过程中的步骤
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Gelred染色原理同EB，是一种 DNA插入式染料，但是它同时 解决了EB本身存在的缺陷，例 如高诱变性和高背景信号等。
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6. 旋光性