第三节 核酸的理化性质和研究方法

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1. 热变性
DNA的稀盐溶液加热到 80-100º C，即可发生热变 性。变性在一个较窄的 温度范围内“爆发式” 发生。
熔点（熔解温度，Tm）
DNA双螺旋结构失去一半 时的温度。一般在82-95℃ 之间。
DNA样品的变性和熔解曲线
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限制性内切酶（restriction endonuclease）
是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列， 并由此切断DNA双链的核酸内切酶。 特点： （1）专一性强（识别序列具特殊的回文结构） （2）切割后的DNA片段具粘末端或平末端 DNA体外重组的重要工具酶 应用：
牛胰RNaseⅠ的切割位点
（RNA内切酶）
产物为3´- 嘧啶核苷酸，或以其为尾的寡核苷酸
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DNaseⅠ和DNase Ⅱ的切割位点 （DNA内切酶）
a: DNaseⅠ，产物为5´- 核苷酸，或以其为尾的寡核苷酸
b: DNase Ⅱ，产物为3´- 核苷酸，或以其为尾的寡核苷酸

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3. 粘度：
DNA分子粘度要比RNA大得多。 粘度大小：线性分子 > 不规则线团 > 球形分子 变性DNA粘度下降。
4. 溶解性：
核苷酸易溶于水，DNA、RNA微溶于水，皆不溶 于有机溶剂。 核酸钠盐比游离酸易溶于水。
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四、核酸的变性、复性与杂交
（一）变性（denaturation） 定义： 高温、酸、碱及某些变性剂（如尿素等）能 破坏核酸中的氢键，使有规律的双螺旋结构变成 单链的、无规律的线团，此作用称DNA的变性。 •变性不涉及共价键的断裂。
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DNA的变性
放射性标记探针杂交
DNA-DNA(或RNA)杂交分子 放射自显影 显示出杂交分子的位置
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Southern 杂交示意图
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Northern 杂交示意图
7. 紫外吸收
嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，所以碱基、核苷、 核苷酸、核酸在240-290nm处有强烈的紫外吸收，最 大吸收峰在260nm处。
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pH 7.0 下核苷酸的吸收光谱和摩尔消光系数
252nm 259nm 267nm 262nm 271nm
超螺旋DNA > 线性DNA> 开环DNA
凝胶浓度: 同一DNA片段在不同凝胶浓度中的泳动速度不同， 应选择适宜的凝胶浓度。
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迁移率与碱基对的关系

琼脂糖浓度与可分离片段大小 的关系
琼脂糖的浓度 （%） 线性DNA大小范围 （Kb）
0.3
0.6 0.7
不同来源变性DNA的 Cot 曲线
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（三）杂交（hybridization）

定义： 相同或不同来源的两条单链
DNA分子，或单链DNA与RNA 分子，如果在某些区域具互补序 列，则复性时根据碱基互补原则，
可形成DNA-DNA或DNA-RNA
杂交分子。

常用电泳法分离鉴定核酸分子。
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核酸的凝胶电泳
核酸分子碱性环境下（pH8.0）带负电荷，在电场中 向正极移动。
核苷酸中 碱基的解离
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在碱性环境下（pH8.0）碱基不带电(C, A, G)或带负电(T)，而 磷酸基团带负电，在电场中核酸分子向正极移动。
RNA DNA RNA
Western （免疫印迹） 蛋白质 （单向电泳分离） 抗体
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Southern 印迹法（Southern blotting）
DNA 中和, 转移, 烘烤 变性的单链DNA转移 并牢固 结合在硝酸纤维素薄膜上
限制性内切酶
限制片段 琼脂糖凝胶电泳 带有DNA片段的凝胶 碱液浸泡 凝胶上DNA变性
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应用： （1）定性定量鉴定各种核苷酸 （2）核酸纯度鉴定
纯DNA: A260 / A280 > 1.8 纯RNA: A260 / A280 = 2.0
（3）核酸纯品定量鉴定
A260 =1, 相当于 50g / ml 双螺旋DNA 40g / ml 单链DNA（RNA） 20g / ml 寡核苷酸


核糖核酸酶 RNaseⅠ
限制性核酸内切酶
RNA 内切酶 DNA内切酶
脱氧核糖核酸酶 DNaseⅠ、DNase Ⅱ
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蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶的切割位点（外切酶）
蛇毒磷酸 二酯酶
牛脾磷酸 二酯酶
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复性的速度与变性DNA的浓度、片段大小及顺序的 复杂性有关。 DNA的浓度越大，片段越小，复性越快。 基因组越小、顺序越简单, 复性越快。 复性的速度可用C0t1/2 表示。
Cot1/2 : 复性一半时的C0t值。
Co: 变性DNA复性时的初始浓度(mol/L) t: 时间（秒）
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举例：CTAB法提取细菌DNA
CTAB（溴代十六烷基三甲胺）
C19H42BrN
CTAB能与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶
液中可溶并且稳定存在。 然后用酚/ 氯仿/ 异戊醇 去
除蛋白质，用异丙醇 沉淀 DNA。
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• 定义：
在一定条件下，变性DNA两条彼此分开的单链重 新缔合成双螺旋结构，这个过程称为复性。
•退火（annealing）
热变性DNA在缓慢冷却时，可以复性，此过程 称为退火。
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DNA热变性和复性过程中的步骤
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部分变性DNA的电镜照片
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变性后，紫外吸收值增加，粘度、比旋下降，生物 活性部分或全部丧失。
核酸的吸收光谱
增色效应：核酸变性后 紫外吸收值增加。
减色效应：核酸复性后 紫外吸收值降低。
1. 天然 DNA； 2. 变性 DNA 3. 游离核苷酸
第三节 核酸的理化性质 和研究方法
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一、核酸的一般性质
1. 状态：
核苷酸为无色晶体或粉末, DNA为白色纤维状固体， RNA为白色粉末。

2. 分子大小：
核苷酸分子量： 1个脱氧核苷酸对 618D. DNA和RNA皆是高分子量物质。
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粘末端
平末端
限制性内切酶 对外源DNA片 段进行切割
DNA片段 定向插入 质粒载体中
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三、核酸的酸碱性质

核苷酸、DNA和RNA含有磷酸基
和碱基，是两性电解质。

多核苷酸中，磷酸基pK1´=1.5， 因其酸性较强，所以核酸表现为 酸性。
Tm与以下因素有关：
DNA的均一性 均质DNA 例：poly(A-T) 异质DNA
G-C含量 (G+C)% = (Tm- 69.3) 2.44
介质的离子强度 离子强度越大，Tm越大。
Tm 和（G+C）%的关系
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（二）复性（renaturation）
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五、核酸的提取和纯化 （一）DNA的提取
DNA与碱性蛋白结合形成核蛋白（DNP）。
• DNP溶于1M NaCl, 不溶于0.14M NaCl。
• 用苯酚、氯仿-异戊醇或蛋白酶K等去除蛋白质。 • 用RNase去除RNA。
• 用乙醇沉淀DNA。
5. 特殊颜色反应
核酸的溴化乙锭（EB）染色 EB是一种荧光染料，可插入核酸相邻碱基对之间。 在紫外灯下，结合EB的核酸呈橙红色荧光。灵敏度 为10ng。
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GELred 染色
Gelred是由美国Biotium公司研 发的高灵敏、高稳定、低毒性 的荧光核酸凝胶染色试剂。
核酸分子的杂交
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核酸杂交可在液相或固相进行。 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上， 而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 分子杂交（印迹法）的类型
Southern
待测 样品 探针 DNA DNA RNA
Northern
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(1) 琼脂糖凝胶电泳

以琼脂糖为支持物。常用水平板电泳。

对核酸分子的分离主要依据分子大小和分子构型， 凝胶浓度对分离效果也有影响。

分子大小：线性DNA的迁移距离(迁移率) 与分子大小 (碱基对, bp) 的对数成反比。

分子构型：泳动速度
60 ~ 5
20 ~1 10 ~ 0.8
0.9
1.2 1.5
7 ~Βιβλιοθήκη Baidu0.5
6 ~ 0.4 4 ~ 0.2
2.0
3 ~ 0.1
缓冲液：0.5TBE , 电泳条件:1V/cm, 16h
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不同分子构型的DNA的迁移率
开环的双链环状DNA （open circular DNA） 直线DNA（lineal DNA） 共价闭环DNA (Covalently closed circular DNA, cccDNA)
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侧 视
样品槽模板（梳子）
凝胶托盘 凝胶
俯 视
样品槽 凝胶托盘
水平凝胶电泳示意图
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琼脂糖凝胶水平电泳示意图
Gelred (0.1l/ml)染色

适于分离0.2 ~ 20Kb 的DNA片段。 常用凝胶浓度0.5 ~ 3%。
（二）RNA的提取
• 关键在于防止RNase对RNA的降解。 • 常用 酸性胍盐 /苯酚 / 氯仿法提取RNA。
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2, 3-环式核苷酸
3. 酶水解
核酸酶（nuclease）
根据作 核酸内切酶 用方式 根据 底物
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核酸外切酶
核糖核酸酶 脱氧核糖核酸酶
例如：

蛇毒磷酸二酯酶/牛脾磷酸二酯酶
外切酶
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（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
• 以聚丙烯酰胺为 支持物。常用垂直板电泳。
• 适于分离10 ~ 1000bp 的DNA片段和RNA。
• 凝胶浓度3~ 20%。
例 : ﹤50bp 用12-20%凝胶
DNA测序用电泳槽
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二、核酸的水解
1. 酸水解
糖苷键和磷酸酯键皆可以被酸水解。 稀盐酸 可水解嘌呤糖苷键; 水解嘧啶糖苷键需要高温和 强酸条件（甲酸等）。
2. 碱水解
RNA可被碱水解为核苷酸。DNA不具2′-OH, 不
能形成碱水解的中间物，所以DNA抗碱。
碱性条件下RNA的水解
Gelred染色原理同EB，是一种 DNA插入式染料，但是它同时 解决了EB本身存在的缺陷，例 如高诱变性和高背景信号等。
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6. 旋光性

核酸分子是高度不对称的，具旋光性。
DNA的比旋值 []D = + 150°（右旋）

核酸变性，比旋值下降。