热原检测及其消除方式讨论

热原检测方法及其消除方式

目录

热原及其本质 (3)

定义 (3)

本质 (4)

二、热原发热的机理 (4)

三、热原的检测方法 (5)

1.家兔法 (5)

2.细菌毒素检测法 (6)

3.单核细胞激活实验法（检测疫苗类生物制品） (7)

4.白细胞系法 (7)

（1）THP一1细胞法 (7)

（2）MonoaM一6细胞法 (7)

（3）28SC细胞法 (8)

5.体外人全血法 (8)

四、热原消除方式 (8)

1.蒸馏法去除热原 (8)

2.离子交换法除去热原 (9)

3. 酸碱处理法除热原 (9)

4高温法 (9)

5.活性炭吸附法 (9)

6.超滤法 (9)

五、结论 (10)

热原检测方法及其消除方式讨论

[摘要] 本文较深入探讨了热原的本质及其作用机理，由此对多种检测方法和消除方式进行分析。其中，检测方法有家兔法、细菌毒素检测法、单核细胞激活实验法、白细胞系法和体外人全血法；消除方式包括蒸馏法、高温法、活性炭吸附法和超滤法。新老方法并存，每一项检测方法和消除方式都有其自身的优势和缺陷。随着科技的发展，未来热原的种类和作用机理将被研究清楚，而对应的检测方法和消除方式也将得到更新和升级。

[关键词] 热原；检测；消除

100多年前,即研发了注射剂之后，非肠道医用制品中的热原对人体的危害即热原反应已经人所共知;临床上主要表现为如下症状有:发热,寒颤,恶心,呕吐,头痛等症状。并且，热原能够导致机体发热、腰及关节痛、肤色灰白、白细胞下降、血管通透性增强，严重者造成昏迷甚至休克、死亡。为此，凡非肠道使用制品包括药品、生物制品(包括基因工程产品和基因治疗相关产品)和医疗器械装置(体使用者)都应进行热原检查。1

总之，为了达到药品的安全效果，对于药品的热原检测和消除是及其重要和必要。

热原及其本质

定义

热原(pyrogen)系指由微生物产生的能引起恒温动物异常升高的致热性物质。目前,对于热原国外仍未有完全统一的认识,但从国外文献报道中普遍认为:它是指细菌毒素的脂多糖。欧洲药典委员会副主席JVanNoordwijk提出:“严格地讲,不是每一种热原都具有脂多糖的结构,但所有已知的细菌毒素脂多糖都有热原活性”。在药品生产质量管理规(GMP)条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是:不存在细菌毒素意味着不存在热原。2

本质

人体发热的物质有源性和外源性两大类。热原检测主要是对外源性的热原进行总量控制,使其对机体不产生危害的影响。研究较多、较深人的外源性热原物质主要有2类:即革兰氏阴性菌的毒素和革兰氏阳性菌的脂磷壁酸。这也是产品中常见的热原物质。毒素主要是革兰氏阴性菌细胞壁外表层结构成分,即多糖、脂质和蛋白组成的复合体。其发热部位主要是脂多糖中由脂化的葡萄糖胺二糖为单位,通过焦磷酸醋键组成的一种独特的糖脂化合物，即脂质A。

革兰氏阳性菌致热物质在最近几年才有了深人的认识。由于一段时间,人们虽然发现革兰氏阳性菌造成发热,但在提取后,其致热性减弱或消失阁,故一直无法确定主要是何种物质引起的发热。2001年,经过改进提取方法困和随后的结构拆分测定,终于确认革兰氏阳性菌中与革兰氏阴性菌毒素相对应的发热物质是脂磷壁酸。不同革兰氏阳性菌中的脂磷壁酸结构不同,其致热活性也有很大差异图;这与不同阴性菌的毒素致热活性不同相类似。Dieninger等人根据金葡菌的UrA 结构构建了D一Ala-IJA分子结构,其分子有6个磷酸聚甘油单位组成的骨架和龙胆二糖与酞基碳链组成的附着臂组成,相对分子质量为2248.90。该结构中的龙胆二糖(核心)对LTA的活性影响不大;磷酸聚甘油骨架只有在D一丙氨酸存在时,可以加强脂附着端的作用;N一乙酞氨基葡萄糖基团可以忽略其作用;用L一丙氨酸取代D一丙氨酸可使其活性降低至少10倍,说明有立体异构选择性。LTA的附着臂结构也对LTA的致热性有影响,具有2个酞基的LTA比仅有一个酞基的LTA的致热性强。此外,随着基因工程产品和基因治疗相关产品的增多,人们也开始关注病毒类物质的致热作用,并且证明多聚核昔酸类物质确有致热活性图,但因检测方法的限制等原因,至今研究还未透彻。

二、热原发热的机理

其实，几乎所有的外源性发热物质均通过刺激免疫细胞分泌细胞因子而最终导致机体发热。首先是外源性热原进人机体后刺激免疫细胞产生源性热原如IL一6,NTaF、IL一1等细胞因子,这些因子通过终板血管器们直接或间接进人下丘脑视前区等中枢系统后,一方面通过升温介质和神经整合作用使体温上升(正调节),另

一方面又通过源性解热物质作用于腹中隔(vSA)和中杏仁核(MAN)等体温负调节中枢限制体温升高(负调节),这两方面相互作用的结果决定了调定点上移(或下移)的水平、发热幅度和时程,传统上把体温调节中枢仅局限于下丘脑视前区(PO/AH)的观点应予以修正闭。在这些因子中,IL一6和中枢的PG一2E被认为是介导发热的下游和终端介质。至于一些细胞因子最终是否能通过血脑屏障直接作用于体温调节中枢,还没有确切定论。图2显示了热原物质致发热的机理和临床表现症状。

三、热原的检测方法

1.家兔法

注射制品诞生后不久,人们就发现热原反应现象,并开始探讨、研究其检测控制的方法。第二次世界大战中,因静脉注射输液需求量增大,客观上要求药典规定热原试验,以保证其安全性。经过FDA、NIH和14个药厂协作研究,在1942年USP12版开始收载了家兔法。其基本概念是每千克体重的家兔静脉注射10mL,在10而n 之,家兔不应有发热反应,亦相当于人的致热最低闭值。当时的USP规定:3只家兔有1只体温升高)0.6℃或3只总和>1.4℃,则重复取5只家兔试验,8只家兔中体温升高0.6℃以上的家兔不多于3只,8只兔升温总和不超过3,7℃,认为合格。1900年美国药典委员会、美国FDA生物评价进行了一次协作研究和评价,并进而对家兔热原法提出如下修订建议:(l)在注射药品后1一3h之间,每隔30min记录一次体温,以便能记录到最高升温点。(2)家兔体重不影响毒素剂量对体温的反应,故建议继续按家兔每千克体重给药计算给药剂量(在此之前,美国药典论坛曾提出,按人体每千克体重计算给药剂量)。(3)应重新评价家兔接受了热原制品后休息14d重复使用的规定,应增加休息时间或不允许重复使用。(4)根据人体的致热闽值

5.0Eu·kg将体温升高由0.6℃降至0.5℃。1993年UsP22版第八增补本和以后各版本均根据这一协作研究的结论,对该方法进行了较大的修订,如将家兔最高升温0.6℃的限度降为0.5℃;复试后的8只家兔升温总和不得超过3.5℃降为不得超过3.3℃度等。其后对该检测方法及判定标准几乎没有大的变动。

因此，直到现在家兔热原检查法各国药典用于控制药品热原含量的方法，被称为