蛋白质的稳定性优秀PPT
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蛋白质的稳定性和稳定化
A
B
C
A.用多功能试剂交联；B.共价或非共价连于载体上 C.包埋到载体的紧密孔中
二、非共价修饰
反相胶束 添加剂
蛋白质间非共价相连，形成的多聚体或者
聚合体的活力和稳定性常比单体高
反胶束是由两性化合物在占优势的有机相中形 成的。它不仅可以保护酶，还能提高酶活力， 改变酶的专一性。
反相胶束示意图
固定化可通过下列效应影响酶的稳定性：
空间障碍：由于空间障碍可以防止蛋白水解
酶的作用，阻挡酶与化学失活剂的接触，同时
阻碍氧向酶的扩散可以保护对氧不稳定的酶
扩散机制: 使酶发生交联或包埋在载体紧
密的孔中可以使酶的构象更加坚牢，从而阻止
酶构象从折叠态向伸展态过渡。
一 酶固定到载体上后可产生空间障碍，结果其他大
质信息进行基因和蛋白质序列的改造， 通过定
点突变使得所表达的蛋白质产生相应的特征改
变。
组合设计（combinational design）
和数据驱动设计（data-driven design）
是另外两种最新的可以提高蛋白质稳定
性的蛋白质工程技术。
组合设计:
是通过一种策略使得在基因水平上产生 差异化，同时，通常需要大量的高通量筛选 来鉴别设计是否获得成功。组合设计方法的 目标在于通过在蛋白质随机位点引入随机突
进化目的的一种技术。
随着突变方法、突变体高通量筛选技术、基因结
构与功能研究的突破，特别是PCR 技术的进一步
成熟，DNA 改组技术(DNA shuffling)更加成熟，
使得DNA 改组成为蛋白质体外分子进化的主流技
术。
DNA 改组技术具有许多重要优点， 例如不需要
事先了解结构信息，也不需要了解蛋白质的功能
蛋白质的稳定性
蛋白质稳定性与活性的关系
蛋白质的稳定性与其功能活性 密切相关。
稳定的蛋白质能够更好地维持 其构象和功能，从而在生理条 件下发挥其作用。
蛋白质的稳定性不足可能导致 其构象变化和功能丧失，从而 影响生物体的正常生理活动。
影响蛋白质稳定性的因素
温度
高温会导致蛋白质构象发生变化，破坏其稳 定性。
离子强度
THANKS
感谢观看
高离子强度可能影响蛋白质的构象和稳定性。
pH值
过酸或过碱的环境可能导致蛋白质的变性失 活。
有机溶剂和重金属离子
某些有机溶剂和重金属离子能够与蛋白质结 合，破坏其构象和稳定性。
02
蛋白质的化学稳定性
酸碱稳定性
总结词
蛋白质在酸碱环境中容易发生变性， 失去原有的生物活性。
详细描述
蛋白质的稳定性与所处的酸碱环境密 切相关。在酸性或碱性环境中，蛋白 质的二级结构会受到破坏，导致其失 去原有的生物活性。
光学稳定性
光学稳定性是指蛋白质在一定条件下保持其光学性质的稳定性。这包括对紫外线和 可见光的稳定性以及对荧光标记的稳定性。
紫外线照射和可见光照射可能会引起蛋白质的变性，这通常会导致其光学性质的改 变。因此，在实验中应尽量避免长时间暴露于紫外线和可见光下。
对于荧光标记的蛋白质，应选择与蛋白质结合稳定的荧光染料，并避免在实验过程 中发生荧光淬灭或漂白。
详细描述
氧化剂和还原剂可以与蛋白质中 的氨基酸残基发生反应，导致蛋 白质的空间构象发生变化，从而 失去原有的生物活性。
压力稳定性
总结词
蛋白质在高压环境下容易发生变性，失去原有的生物活性。
详细描述
在高压环境下，蛋白质的空间构象会发生变化，导致其失去 原有的生物活性。压力可以改变蛋白质的水合状态和构象， 从而影响其稳定性。
《蛋白质性质试验》PPT课件
实验 蛋白质的部分性质
第一部分、蛋白质的颜色反应
一、试验原理
❖ 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。 不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全 相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产 生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物 是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测 定的依据。
精选PPT
9
（二）有机溶剂沉淀蛋白质
原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引 起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质 点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。
操作：取一试管加蛋白液1ml，，加入晶体氯化钠少许， 待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。
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10
（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质
原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为生物碱。 能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如 鞣酸等。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易 与生物碱试剂的负离子发生反应而沉淀。
操作：
1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化
成液体， 此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，至
液体重新结晶出现白色固体时， 停止加热，冷却。然后
加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% 液，混匀，观察有无紫色出现。
CuSO4溶
2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加24滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。
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7
二、实验仪器
1、移液管 2、吸管 3、试管 4、电炉
三、实验试剂
1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液 放在冰箱里冷藏备用。
第一部分、蛋白质的颜色反应
一、试验原理
❖ 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。 不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全 相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产 生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物 是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测 定的依据。
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9
（二）有机溶剂沉淀蛋白质
原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引 起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质 点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。
操作：取一试管加蛋白液1ml，，加入晶体氯化钠少许， 待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。
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10
（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质
原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为生物碱。 能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如 鞣酸等。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易 与生物碱试剂的负离子发生反应而沉淀。
操作：
1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化
成液体， 此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，至
液体重新结晶出现白色固体时， 停止加热，冷却。然后
加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% 液，混匀，观察有无紫色出现。
CuSO4溶
2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加24滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。
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二、实验仪器
1、移液管 2、吸管 3、试管 4、电炉
三、实验试剂
1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液 放在冰箱里冷藏备用。
蛋白质的研究方法优秀课件.ppt
就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上，并使蛋白 完全变性的特性。
这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。
蛋白质的研究方法优秀课件
18
非离子去污剂：
相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]＜其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候，去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
蛋白质的研究方法优秀课件
22
细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。
沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成；
蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层 的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒 而沉淀。
蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI， 所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分 散能力。
蛋白质的研究方法优秀课件
25
#
蛋白质的研究方法优秀课件
26
等电点（PI）：
1.能破坏蛋白质分子水化作用 2.是减弱分子间同性相斥作用的因子
蛋白质的研究方法优秀课件
5
制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态
• 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。
2. 通常都在低温条件下操作。
3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
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这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。
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18
非离子去污剂：
相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]＜其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候，去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
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22
细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。
沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成；
蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层 的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒 而沉淀。
蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI， 所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分 散能力。
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26
等电点（PI）：
1.能破坏蛋白质分子水化作用 2.是减弱分子间同性相斥作用的因子
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5
制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态
• 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。
2. 通常都在低温条件下操作。
3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
蛋白质的研究方法优秀课件
生物化学课件之蛋白质(共119张PPT)
缬氨酸 valine Val V
亮氨酸 leucine Leu L
异亮氨酸 isoleucine Ile I
苯丙氨酸 phenylalanine Phe F
脯氨酸 proline Pro P
目录
2. 极性中性氨基酸
色氨酸 tryptophan Try W
丝氨酸 serine
Ser S
酪氨酸 tyrosine Try Y
第一节 蛋白质是生命的物质基础
一、什么是蛋白质?
蛋白质(protein)是由许多氨基酸 (amino acids)通过肽键(peptide bond)相连 形成的高分子含氮化合物。
二、蛋白质的生物学重要性
1. 蛋白质是生物体重要组成成分 分布广：
普遍存在于生物界，动物、植物、微生物主要是由 蛋白质构成。
蛋白质元素组成的特点
各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。
由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只 要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式 推算出蛋白质的大致含量：
100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数× 6.25×100
1/16%
二、氨基酸 —— 组成蛋白质的基本单位
赖氨酸 lysine Lys K
精氨酸 arginine Arg R
组氨酸 histidine His H
目录
几种特殊氨基酸
• 脯氨酸
（亚氨基酸）
半胱氨酸
+
-HH
二硫键
胱氨酸
（二）氨基酸的理化性质
1. 两性解离性质 2. 紫外吸收性质 3. 茚三酮反应
1. 两性解离及等电点
氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的 酸碱度。
第4章 蛋白质的稳定性和稳定化
辐射可产生自由基(.OH,H2O2,O2-.等)直接或间接地作用于蛋 白质分子.
一○．冷冻和脱水：
一一．辐射作用:
第三节 蛋白质的稳定化
一是如何防止蛋白质的可逆伸展， 可以开发出普遍适用的方法； 二是一旦酶发生了可逆伸展，如何 防止其不可逆失活反应的发生，对 此针对不同的失活原因采取不同的 特殊稳定化方法。
蛋白质的稳定性: 蛋白质抵抗各种 因素的影响,保持其生物活力的能 力. 蛋白质的特定功能是由其特定的 空间结构决定的,要保持其生物活 理解蛋白质 力,必须保持其空间结构,稳定蛋白 稳定性的概念? 质空间结构的因素是什么?
维持蛋白结构稳定的主要因素:
① 金属离子、底物、辅因子和其他相对低分 子质量配体的结合作用 ② 蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用 ③ 盐桥和氢键 ④ 二硫键 ⑤ 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 ⑥ 氨基酸残基的坚实装配 ⑦ 疏水相互作用(思考题)
2. 小分子修饰酶
原因：
修饰有时会获得不同于天然蛋白质构象的更稳定 的构象； 修饰关键功能基团也会达到稳定化； 由化学修饰引入到蛋白质的新的功能基有可能形 成附加氢键或盐键； 用非极性试剂修饰可加强蛋白质中疏水相互作用； 蛋白质表面基团的亲水性； 交联酶晶体
四．蛋白质工程：
第四章 蛋白质的稳定性和稳定化
生命科学学院: 柯德森 Desenke@ QQ270820679
研究意义:
了解蛋白质稳定性与结构的关系
是理解蛋白质分子自我装配过程 的关键. 研究蛋白质稳定性机制是实现酶 工程研究目标的重要基础.
第一节: 蛋白质的稳定性
一.
蛋白质稳定性的分子原因
用基因操纵技术高度专一性地改变目标蛋白质。
一○．冷冻和脱水：
一一．辐射作用:
第三节 蛋白质的稳定化
一是如何防止蛋白质的可逆伸展， 可以开发出普遍适用的方法； 二是一旦酶发生了可逆伸展，如何 防止其不可逆失活反应的发生，对 此针对不同的失活原因采取不同的 特殊稳定化方法。
蛋白质的稳定性: 蛋白质抵抗各种 因素的影响,保持其生物活力的能 力. 蛋白质的特定功能是由其特定的 空间结构决定的,要保持其生物活 理解蛋白质 力,必须保持其空间结构,稳定蛋白 稳定性的概念? 质空间结构的因素是什么?
维持蛋白结构稳定的主要因素:
① 金属离子、底物、辅因子和其他相对低分 子质量配体的结合作用 ② 蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用 ③ 盐桥和氢键 ④ 二硫键 ⑤ 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 ⑥ 氨基酸残基的坚实装配 ⑦ 疏水相互作用(思考题)
2. 小分子修饰酶
原因：
修饰有时会获得不同于天然蛋白质构象的更稳定 的构象； 修饰关键功能基团也会达到稳定化； 由化学修饰引入到蛋白质的新的功能基有可能形 成附加氢键或盐键； 用非极性试剂修饰可加强蛋白质中疏水相互作用； 蛋白质表面基团的亲水性； 交联酶晶体
四．蛋白质工程：
第四章 蛋白质的稳定性和稳定化
生命科学学院: 柯德森 Desenke@ QQ270820679
研究意义:
了解蛋白质稳定性与结构的关系
是理解蛋白质分子自我装配过程 的关键. 研究蛋白质稳定性机制是实现酶 工程研究目标的重要基础.
第一节: 蛋白质的稳定性
一.
蛋白质稳定性的分子原因
用基因操纵技术高度专一性地改变目标蛋白质。
蛋白质 ppt课件
蛋白质缺乏症
蛋白质缺乏症是指由 于蛋白质摄入不足或 吸收障碍导致的营养 缺乏病。
在儿童中，蛋白质缺 乏症还可能导致生长 发育迟缓、智力发育 不良等。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
症状包括体重减轻、 肌肉萎缩、贫血、免 疫力下降等。
蛋白质过量的危害
01
02
03
04
虽然蛋白质是人体必需的营养 素，但摄入过多也会对健康造
成负面影响。
蛋白质的分类
根据结构
可分为简单蛋白质和结合蛋白质。
根据功能
可分为酶、激素、抗体、载体、血红蛋白等。
蛋白质的结构与功能
结构
蛋白质的结构可分为一级、二级、三级和四级结构。一级结构是指蛋白质中氨基酸的排列顺序；二级 结构是指蛋白质中局部主链的构象；三级结构是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置；四级 结构是指蛋白质分子中各个亚基的空间排布及相互作用。
蛋白质 PPT 课件
目录
CONTENTS
• 蛋白质简介 • 蛋白质的合成与分解 • 蛋白质与疾病 • 蛋白质在生物体内的应用 • 蛋白质研究的前沿与展望
01 蛋白质简介
定义与组成
定义
蛋白质是由氨基酸组成的大分子 有机化合物，是构成细胞和组织 的主要物质之一。
组成
蛋白质由20种不同的氨基酸通过 肽键连接而成，其分子量通常在 10,000道尔顿以上。
高蛋白饮食可能导致肾脏负担 加重，引发肾脏疾病。
过量的蛋白质在体内代谢过程 中会产生大量的氨和尿素，增 加肝脏负担，并可能导致肝病
。
此外，高蛋白饮食还可能引发 肥胖、心血管疾病等健康问题
。
04 蛋白质在生物体内的应用
蛋白质在食品工业中的应用
蛋白质作为食品添加剂
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8、二硫键剪切后形成新氨基酸（赖氨丙氨 酸、） 9、天冬酰胺脱氨
辅酶分子从活性部位上解离
寡聚蛋白解离成亚基
吸附到容器表面
“不可逆”构象改变 流体中的剪切失活
变性条件
加热，变性剂脲，盐酸胍, SDS, 振动
极端pH值，加热，蛋白水解酶 氧气（特别在加热时）氧气代谢产物，辐射 加热，高pH，巯基化合物,二硫化物 金属离子，二硫化物 蛋白激酶 底物
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Hale Waihona Puke 四、氧化作用各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、 半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧，H2O2和氧自由基是常 见的蛋白质氧化剂。在过渡金属离子（如Cu2+存在下） ，于碱性pH，半胱氨酸可氧化成胱氨酸。氧化剂强度不 同，半胱氨酸也可转变成次磺、亚磺或磺（半胱氨）酸 。
H2O2是非专一性氧化剂。在酸性条件下，它主要把蛋 氨酸氧化成它的亚砜。
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五、表面活性剂和去污剂
表面活性剂是由疏水基团和亲水基团组成的化合物。 去污剂有离子性和非离子性两大类，都含有长链疏水尾巴 但“头”部基团不同，有带电的，有不带电的
去污剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈的相互作用，导 致蛋白质不可逆变性。
去污剂的关键物理性质是其溶解度。如图4-7所示，当去 污剂单体加入水溶液时，一部分溶解，一部分在气-水界 面形成单层。
7
7、疏水相互作用
带有非极性侧链的氨基酸大约占蛋白质分子总体积 的一半。它们与水的接触从热力学上来说是不利的 ，因为非极性部分加入水中，会使水的结构更有序 地排列。 水分子的这种结构重排，显然能引起系统的熵降低 和蛋白质折叠状态的改变：蛋白质的非极性部分总 是倾向于使其不与水接触，并尽可能地隐藏在蛋白 球体内部。从而蛋白质稳定性增加。
3
4． 二硫键
大分子的分子内交联可增强其坚实性，并提高 其在溶液中的稳定性。
稳定化指的是熵性质：由于交联即蛋白质中形 成二硫键，伸展蛋白质的熵急剧降低
4
物质的熵是它所处状态的分子混乱度 (也称无序度)的度量。熵值小的状态对 应比较有序的状态,熵值大的状态对应比 较无序的状态。 一种物质从固态到液态到气态,分子热运 动的混乱程度依次增强,而熵值也依次增 大。
10
1、必须发生单分子构象变化，导致蛋白质可逆变性。这 个过程使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂。 2、这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合，以最大 限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露。 3、如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发 生分子间二硫交换反应。 与许多其它蛋白质失活原因不同，聚合并不一定是不可 逆的。使用变性剂破坏分子间的非共价力（氢键或疏水 相互作用）并且在无变性剂时，通过还原和再氧化再生 天然二硫键，则有可能使蛋白质再活化。
5
5、对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 结构上重要的氨基酸残基（如活性部位氨基酸） 的氧化作用是蛋白质失活的最常见的机理之一。 半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别 敏感，因此，这些不稳定氨基酸的数目，在高度 稳定的嗜热蛋白质中比在相应的嗜温蛋白质中显 著偏低。
6
6、氨基酸残基的坚实装配
蛋白质结构中存在有空隙。按照Chothia说法，蛋白球 体积的大约25%仍未充满，即不是被氨基酸占据。但溶质 分子可以包埋在这些孔隙中。这些孔隙通常为水分子所充 满。分子量为2―3万的蛋白质中约有个5―15水分子 。由 布朗运动调节的极性水分子与球体疏水核的接触会导致蛋 白质不稳定。随着水分子从孔隙中除去，蛋白质结构变得 更坚实，蛋白质的稳定性也增加。因此，蛋白质的坚实化 可作为一种人为稳定蛋白质的方法。
1
2、蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用
在体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用，形成复合物， 从而显著增加蛋白质稳定性。
当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳 定到疏水簇上，因而防止疏水簇与溶剂的接触， 屏蔽了蛋白质表面的疏水区域，从而显著增加蛋 白质稳定性
2
3、盐桥和氢键 蛋白质中盐桥的数目较少，但对蛋白质稳定性贡 献很显著。嗜热脱氢酶亚基间区域有盐桥协作系 统，这是嗜温脱氢酶没有的。因此嗜热酶的催化 活力的变性温度和最适温度都比嗜温酶高出约 20℃。 用定点突变法定性定量地测定了引入的氢键对蛋 白质的稳定性的贡献，发现加入的氢键与蛋白质 稳定性无关。
第四章 蛋白质的稳定性和稳定化
第一节 蛋白质的稳定性
一、蛋白质的稳定性指的是蛋白质抵抗各种因素的影 响，保持其生物活力的能力。
二、蛋白质稳定性的分子原因
1、金属离子、底物、辅因子和其它低分子量配体的结 合作用。
金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是弯曲处）， 因而可以显著增加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子和其 它低分子量配体相互作用时，也会看到蛋白质稳定性的增加。
加热，极端pH 加热，高pH
加热，高PH
螯合剂、透析、加热，金属离子
化学修饰，极端pH, 脲，表面活性剂，高温或低
温 蛋白质浓度低, 加热
加热，极端pH, 有机溶剂,盐酸胍
流体形变
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一、 蛋白水解酶和自溶作用 蛋白水解酶可催化肽键水解。当蛋白质底物也是一种蛋 白水解酶时，就会发生自我降解现象，叫作自溶。 二、聚合 聚合分三步进行：N ← U → A → As 其中N U代表可逆伸展，A是聚合的蛋白质，As是发生了二硫 交换反应的蛋白质聚合物。
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第二节 蛋白质不可逆失活的原因和机理
失活机理
聚合（有时伴随形成分子间二硫键）
一级结构改变
1、酸、碱催化的肽键水解，蛋白水解作用和 自溶作用 2、功能基氧化（半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚 环） 3、二硫键还原，分子间二硫交换
4、必需巯基的化学修饰
5、蛋白质磷酸化
6、在催化过程中由于反应中间物（主要是自 由基）引起的“自杀”失活 7、氨基酸的外消旋化
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三、极端pH
硫代半胱氨酸残基
图4-6 碱催化的β-消除反应破坏二硫键，产生新的分子内交联键（赖氨丙氨 酸）。
12
肽键水解也容易在强酸条件下或中等pH和高温相结合的条 件下发生。 在极端条件下（6 mol/L HCI，24h, 110℃）蛋白质可完全 水解成氨基酸。 在强酸、中性和碱性pH下容易发生天冬酰胺和谷氨酰胺的 脱氨作用，结果在蛋白质的疏水性内部引进入负电荷，导 致酶失活。
辅酶分子从活性部位上解离
寡聚蛋白解离成亚基
吸附到容器表面
“不可逆”构象改变 流体中的剪切失活
变性条件
加热，变性剂脲，盐酸胍, SDS, 振动
极端pH值，加热，蛋白水解酶 氧气（特别在加热时）氧气代谢产物，辐射 加热，高pH，巯基化合物,二硫化物 金属离子，二硫化物 蛋白激酶 底物
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Hale Waihona Puke 四、氧化作用各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、 半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧，H2O2和氧自由基是常 见的蛋白质氧化剂。在过渡金属离子（如Cu2+存在下） ，于碱性pH，半胱氨酸可氧化成胱氨酸。氧化剂强度不 同，半胱氨酸也可转变成次磺、亚磺或磺（半胱氨）酸 。
H2O2是非专一性氧化剂。在酸性条件下，它主要把蛋 氨酸氧化成它的亚砜。
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五、表面活性剂和去污剂
表面活性剂是由疏水基团和亲水基团组成的化合物。 去污剂有离子性和非离子性两大类，都含有长链疏水尾巴 但“头”部基团不同，有带电的，有不带电的
去污剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈的相互作用，导 致蛋白质不可逆变性。
去污剂的关键物理性质是其溶解度。如图4-7所示，当去 污剂单体加入水溶液时，一部分溶解，一部分在气-水界 面形成单层。
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7、疏水相互作用
带有非极性侧链的氨基酸大约占蛋白质分子总体积 的一半。它们与水的接触从热力学上来说是不利的 ，因为非极性部分加入水中，会使水的结构更有序 地排列。 水分子的这种结构重排，显然能引起系统的熵降低 和蛋白质折叠状态的改变：蛋白质的非极性部分总 是倾向于使其不与水接触，并尽可能地隐藏在蛋白 球体内部。从而蛋白质稳定性增加。
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4． 二硫键
大分子的分子内交联可增强其坚实性，并提高 其在溶液中的稳定性。
稳定化指的是熵性质：由于交联即蛋白质中形 成二硫键，伸展蛋白质的熵急剧降低
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物质的熵是它所处状态的分子混乱度 (也称无序度)的度量。熵值小的状态对 应比较有序的状态,熵值大的状态对应比 较无序的状态。 一种物质从固态到液态到气态,分子热运 动的混乱程度依次增强,而熵值也依次增 大。
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1、必须发生单分子构象变化，导致蛋白质可逆变性。这 个过程使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂。 2、这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合，以最大 限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露。 3、如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发 生分子间二硫交换反应。 与许多其它蛋白质失活原因不同，聚合并不一定是不可 逆的。使用变性剂破坏分子间的非共价力（氢键或疏水 相互作用）并且在无变性剂时，通过还原和再氧化再生 天然二硫键，则有可能使蛋白质再活化。
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5、对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 结构上重要的氨基酸残基（如活性部位氨基酸） 的氧化作用是蛋白质失活的最常见的机理之一。 半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别 敏感，因此，这些不稳定氨基酸的数目，在高度 稳定的嗜热蛋白质中比在相应的嗜温蛋白质中显 著偏低。
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6、氨基酸残基的坚实装配
蛋白质结构中存在有空隙。按照Chothia说法，蛋白球 体积的大约25%仍未充满，即不是被氨基酸占据。但溶质 分子可以包埋在这些孔隙中。这些孔隙通常为水分子所充 满。分子量为2―3万的蛋白质中约有个5―15水分子 。由 布朗运动调节的极性水分子与球体疏水核的接触会导致蛋 白质不稳定。随着水分子从孔隙中除去，蛋白质结构变得 更坚实，蛋白质的稳定性也增加。因此，蛋白质的坚实化 可作为一种人为稳定蛋白质的方法。
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2、蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用
在体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用，形成复合物， 从而显著增加蛋白质稳定性。
当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳 定到疏水簇上，因而防止疏水簇与溶剂的接触， 屏蔽了蛋白质表面的疏水区域，从而显著增加蛋 白质稳定性
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3、盐桥和氢键 蛋白质中盐桥的数目较少，但对蛋白质稳定性贡 献很显著。嗜热脱氢酶亚基间区域有盐桥协作系 统，这是嗜温脱氢酶没有的。因此嗜热酶的催化 活力的变性温度和最适温度都比嗜温酶高出约 20℃。 用定点突变法定性定量地测定了引入的氢键对蛋 白质的稳定性的贡献，发现加入的氢键与蛋白质 稳定性无关。
第四章 蛋白质的稳定性和稳定化
第一节 蛋白质的稳定性
一、蛋白质的稳定性指的是蛋白质抵抗各种因素的影 响，保持其生物活力的能力。
二、蛋白质稳定性的分子原因
1、金属离子、底物、辅因子和其它低分子量配体的结 合作用。
金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是弯曲处）， 因而可以显著增加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子和其 它低分子量配体相互作用时，也会看到蛋白质稳定性的增加。
加热，极端pH 加热，高pH
加热，高PH
螯合剂、透析、加热，金属离子
化学修饰，极端pH, 脲，表面活性剂，高温或低
温 蛋白质浓度低, 加热
加热，极端pH, 有机溶剂,盐酸胍
流体形变
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一、 蛋白水解酶和自溶作用 蛋白水解酶可催化肽键水解。当蛋白质底物也是一种蛋 白水解酶时，就会发生自我降解现象，叫作自溶。 二、聚合 聚合分三步进行：N ← U → A → As 其中N U代表可逆伸展，A是聚合的蛋白质，As是发生了二硫 交换反应的蛋白质聚合物。
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第二节 蛋白质不可逆失活的原因和机理
失活机理
聚合（有时伴随形成分子间二硫键）
一级结构改变
1、酸、碱催化的肽键水解，蛋白水解作用和 自溶作用 2、功能基氧化（半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚 环） 3、二硫键还原，分子间二硫交换
4、必需巯基的化学修饰
5、蛋白质磷酸化
6、在催化过程中由于反应中间物（主要是自 由基）引起的“自杀”失活 7、氨基酸的外消旋化
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三、极端pH
硫代半胱氨酸残基
图4-6 碱催化的β-消除反应破坏二硫键，产生新的分子内交联键（赖氨丙氨 酸）。
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肽键水解也容易在强酸条件下或中等pH和高温相结合的条 件下发生。 在极端条件下（6 mol/L HCI，24h, 110℃）蛋白质可完全 水解成氨基酸。 在强酸、中性和碱性pH下容易发生天冬酰胺和谷氨酰胺的 脱氨作用，结果在蛋白质的疏水性内部引进入负电荷，导 致酶失活。