叶绿体色素的提取分离和理化性质
叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定
过滤入三角瓶中
观察荧光现象 透射光 色，反射 光 光。
定性实验 无需移液管量 皂化反应(约1ml)
加KOH数片剧烈摇均， 加石油醚1ml和H2O 1ml 分层后观察 上层呈 吸收 下层呈 吸收 色，为 光。 色,为 光。 ， ,
取代反应（约1mL）
在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝 卜素和叶绿素的吸收峰
• 3．叶绿素定量分析：
称取鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取2份 0.2ml 分别加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心 5min, 上清液在 649 ， 652 ， 665 测定 OD ，计算 Chla,Chlb 和Chl总量的值。
5、定量分析：叶绿素吸收红光和兰紫光，红
光区可用于定量分析，其中665 和649用于定量 叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量测定
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 400 500 Waverlength(nm) 600 700
a
b
• 实验步骤 1．定性分析：
加醋酸约1ml，变褐 为_________叶绿素 , 取1/2加醋酸铜粉,加热变 色，为 叶绿素。
2、叶绿素和类胡萝ຫໍສະໝຸດ 素的吸收光谱测定：皂化反应的上层 黄色石油醚溶液 弃上层，反复用石油醚萃取,直 到无类胡萝卜素, 得叶绿素(盐)
（稀释470nm OD 0.5-1） （稀释，665nm OD 0.5-1）
• 五、实验数据记录和处理
• Ca(mg/L)=13.95A665-6.88 A649 • Cb (mg/L) =24.96A649-7.32 A665 • CT (mg/L) = Ca+ Cb 或A6521000/34.5
叶绿体色素的提取分离与理化性质实验报告
叶绿体色素的提取分离与理化性质
二、实验原理：
叶绿体中主要成分为叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素、叶黄素，这些色素不溶于水而易溶于有机溶剂，所以用乙醇做提取剂。
提取液用薄层层析法加以分离。
由于硅胶对不同色素的吸附性不同，在展开剂带动各种色素向上移的过程中，有的速度慢有的速度快，从而彼此分开成单独的色带。
叶绿素可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，盐能溶于水，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
叶绿素吸收光量子而转变为激发态，变回基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素容易受强光破坏，而类胡萝卜素较稳定。
叶绿素中的镁可被氢离子取代而成褐色的去镁叶绿素，去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素。
三、实验仪器和材料：
1.菠菜叶
2.体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂，苯，醋酸铜粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸—醋酸铜溶液，氢氧化钾—甲醇溶液。
3.天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸，刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10ml移液管。
四、实验步骤：。
叶绿体色素的提取分离及理化性质检测实验报告
实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质系别：机械工程系班级：机械11实验者：潘霖学号：2011010389同组姓名：肖鹤翀实验日期：2011.10.22Ⅰ提取与分离一、实验目的：1.学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。
2.了解叶绿素的组成、性质和测定叶绿素有助于理解光合作用的本质。
二、实验原理:叶绿体是进行光合作用的细胞器。
叶绿体中的叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。
提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。
薄层层析色谱法是将吸附剂均匀地涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。
由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。
植物活性成分的分离常用薄层层析法和柱层析法，其中柱层析适用于大量制备。
本实验采用薄层层析色谱法，其中固定相用硅胶预制板。
三、实验材料与试剂:1.新鲜的菠菜叶片。
2.体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7:5:1，体积比）。
3.研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸。
四、实验步骤:（一）色素提取液的制备1.取新鲜叶片4~5片，洗净，擦干叶表面，去除中脉剪碎，放入研钵中。
2.向研钵中加入少量CaCO3粉末，再加2~3ml体积分数为95%的乙醇，充分研磨至糊状，再加10~15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤出，残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。
提取液应避光保存，因提取量较大，可用于其他相关实验（如后面的叶绿素理化性质的验证）。
（二）叶绿体色素的分离1.取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，保证划线细直。
实验五 叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定
• 二、叶绿体色素的理化性质 • 1、叶绿体的荧光现象：取上述色素提取液少许于试管
中，分别观察反射光和透射光，比较观察到的颜色不同 并分析原因。
• 2、光对叶绿素的破坏：取上述色素提取液少许分别加 入两个试管中，一支试管放在暗处，一支试管放在强光 下照射，2 h后观察颜色变化，分析原因。
• 3、铜代反应：取上述色素提取液加入试管，逐滴加入 浓盐酸，直至溶液呈现褐色，此时叶绿素分子已经遭到 破坏，称为去镁叶绿素，然后加入醋酸铜结晶少许，慢 慢加入溶液，直至出现鲜亮的绿色，此时即形成了铜代 叶绿素。
• 4、黄色素与绿色素的分离：取上述色素丙酮提取液10 ml，加入盛有20 ml乙醚的分液漏斗，并沿漏斗边缘加 入30 ml蒸馏水，轻轻摇动分液漏斗，静止片刻，溶液 分为两层。色素已经全部转入上层乙醚总，弃去丙酮和 水，再加入5 ml30%KOH甲醇溶液，用力摇动分液漏斗， 静置10分钟，再加入蒸馏水10 ml，摇动后静置分离， 得到黄色素层和绿色素层，分别保留，分析实验结果和 原因。
• 2、把展层用的驴子中间搞一个圆洞，把新华滤纸 剪成20 cm的长条卷成圆柱，一端多次滴上色素提取 液，插入圆形滤纸中间孔中，上面与圆形滤纸齐平
• 3、在培养皿中加入展层用的四氯化碳，把上部做 成的滤纸下的含色素圆柱下端浸入展层液，盖上培 养皿上盖，开始展层。等展层液扩散到培养皿边缘 时，取出滤纸，观察同心圆色素带，做好记录。
• 三、器材与试剂
• •仪器：带盖培养皿、台天平、研钵、量筒、 烧杯、漏斗、软木塞、新华滤纸、毛细滴 管、剪刀、分液漏斗、移液管、分光计。 • 实验试剂：丙酮、甲酯、醋酸铜、盐酸、 氢氧化钾、石英砂、碳酸钙、无水硫酸钠、 四氯化碳、乙醚。 •材料：菠菜叶片
• 一、叶绿体色素的提取与分离
叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定
实验日期：2011.9.28叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定1、实验原理叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a 、叶绿素b 、胡萝卜素和叶黄素组成。
它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。
1. 叶绿体色素的结构与分离叶绿素a为蓝黑色固体，在乙醇溶液中呈蓝绿色；叶绿素b为暗绿色，其乙醇溶液呈黄绿色。
Chla与Chlb是吡咯衍生物与镁的络合物，它们很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。
Chla与Chlb 是植物进行光合作用必需的催化剂，易溶于石油醚等非极性溶剂中。
通常植物中叶绿素a的含量是叶绿素b的三倍。
其结构式如下：类胡萝卜素是一种橙色的天然色素，属于四萜，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中β异构体含量最多。
β-胡萝卜素(R=H)和叶黄素(R=OH)叶黄素是一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体内，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在石油醚中溶解度较小。
秋天，高等植物的叶绿素被破坏后，叶黄素的颜色就显示出来。
叶绿素与类胡萝卜素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
提取液可用色谱分析的原理加以分离。
因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
2. 叶绿体色素的物理性质叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它从第一单线态返回基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
因为分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长。
3. 叶绿体色素的化学性质叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定
植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定引言：叶绿体是植物细胞中的一个重要细胞器，其中主要存在着叶绿素等色素，它们在光合作用中起着重要的作用。
研究叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定，对于了解光合作用的机理以及研究植物生理生化过程具有重要意义。
本实验旨在通过实验手段提取叶绿体色素，进行色素的分离、理化性质的研究和叶绿素含量的测定。
材料与方法：材料：菠菜叶片、研钵、磨杵、丙酮、乙醇、石油醚、叶绿素提取液、测色皿、高锰酸钾溶液、浓硫酸。
方法：1.取适量菠菜叶片放入研钵中，加入适量丙酮，用磨杵捣碎成糊状。
2.将捣碎的菠菜糊状物转移到玻璃漏斗中，用石油醚冲洗3次，使叶绿体附着物进一步析出。
3.将漏斗中的上清液收集，并加入适量乙醇，振摇混合，使叶绿素慢慢析出。
4.将释放出的叶绿体颗粒通过离心机离心沉淀10分钟，收集沉淀。
5.取收集到的叶绿体沉淀，加入适量叶绿素提取液，用乳钙酸钠解离剂进行叶绿素含量的测定。
6.将其中一部分叶绿体溶液加入高锰酸钾溶液，观察颜色变化。
7.将其余叶绿体溶液与浓硫酸混合，观察颜色变化。
结果与讨论：通过上述方法，我们成功地提取并分离出菠菜叶片中的叶绿体色素。
加入石油醚可以去除一部分杂质，使叶绿体进一步纯化。
加入乙醇可以使叶绿素从叶绿体中溶出。
通过离心沉淀，我们收集到了叶绿体的沉淀物。
叶绿体的提取液与高锰酸钾溶液反应后呈现蓝色或紫色，这是由于高锰酸钾通过氧化反应将一些具有现菌酮结构的物质氧化为合成叶绿素的前体物质所引起的。
这种反应也证实了叶绿体的存在。
叶绿体溶液与浓硫酸混合后呈现蓝绿色，这是由于浓硫酸通过剥离叶绿体周围的蛋白质和其他有机物质，将叶绿素分子释放出来，产生颜色变化。
叶绿素的含量测定是通过与乳钙酸钠解离剂反应来进行的。
乳钙酸钠解离剂能够与叶绿体中的叶绿素结合，并形成稳定的叶绿素-乳钙酸钠络合物。
这种络合物通过光密度的测定，可以根据比色法来测量叶绿素的含量。
叶绿体色素(chloroplast pigment)的提取分离和理化性质
叶绿体色素（chloroplast pigment）的提取分离和理化性质一、叶绿体色素的提取与分离【原理】叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。
它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。
提取液可用色层分析的原理加以分离。
因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。
【仪器与用具】研钵2套；漏斗；100ml三角瓶；玻璃棒；剪刀；滴管；培养皿（直径1 1cm）；康维皿或平底短玻管（也可用塑料药瓶盖代替）；药勺；圆形滤纸（直径11cm）；滤纸条（5cm×1.5cm）。
【试剂】95%乙醇；石英砂；碳酸钙粉；推动剂：按石油醚�U丙酮�U苯（10�U2�U1）比例配制（体积比）。
【方法】1．叶绿体色素的提取（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4～5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。
（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2～3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10～15ml 95%乙醇，提取3～5min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。
如无新鲜叶片，也可用事先制好的叶干粉提取。
取新鲜叶片（以菠菜叶最好），先用105℃杀青，再在80℃下烘干，研成粉末，密闭贮存。
用时称叶粉1g放入小烧杯中，加95%乙醇20～30ml浸提，并随时搅动。
待乙醇呈深绿色时，滤出浸提液备用。
（3）另取一研钵，放入剪碎的新鲜叶片，放入少量石英砂（不加碳酸钙粉），用水研磨。
先加2ml蒸馏水，研至糊状，再加蒸馏水30ml，搅均，不过滤。
2．叶绿体色素的分离（1）取圆形定性滤纸一张（直径11cm），在其中心戳一圆形小孔（直径约3mm）。
实验3叶绿体色素的提取、分离及理化性质的测定
实验3叶绿体⾊素的提取、分离及理化性质的测定实验三叶绿体⾊素的提取、分离及理化性质的测定【实验原理】叶绿体⾊素⼜称光合⾊素，在⾼等植物中可分为叶绿素和类胡萝⼘素两⼤类，前者包括叶绿素a（蓝绿⾊）和叶绿素b（黄绿⾊），后们类囊体膜上的蛋者包括胡萝⼘素（橙⾊）和叶黄素（黄⾊），它与⽩质结合形成⾊素蛋⽩复合体，不溶于⽔，易溶于酯，因此可⽤丙酮、⼄醇、⽯油醚等有机溶剂进⾏提取。
叶绿体⾊素的分离有多种⽅法，本实验仅介绍纸层析法。
层析的基本原理：在分离过程中，由⼀种流动相（即⼀种液体或⽓体）带动着试样经过固定相（⼀种⽀持物，如纸）向外扩散，由于试样在两相中的溶解度不同和固定相对试样中不同成分的吸附程度有别，当⽤适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过⼀定时间层析后，可使试样中的各种组分得到分离，在做纸层析时，由于纸对光合⾊素中各种⾊素分⼦的吸附程度不同，以及这些⾊素分⼦在溶剂四氯化碳（推进剂）中溶解度也有差异，以致溶剂带动⾊素分⼦向四周移动时，各种⾊素分⼦沿纸扩散的速度也就不同，使混合⾊素分离，出现不同颜⾊的环。
将提取的叶绿素溶液置于光下，在透射光呈绿⾊，在反射光下呈这现象称为荧光现象。
在反射光下叶绿素溶液之所以呈樱桃红⾊，种发态，激发态的叶樱桃红⾊，是因为叶绿⾊分⼦吸收光能后处于激状绿素分⼦很不稳定，当它回到基态时，将所获得的能量以辐射能的形式发射出红光量⼦。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光、⾼温等的破坏，特别是当叶绿素与蛋⽩质分离以后，破坏更快，⽽类胡萝⼘素则较稳定。
叶绿素中的镁可以被H＋所取代⽽成褐⾊的去镁叶绿素，后者遇铜后，其中的氢（H＋）⼜被铜（Cu2＋）取代，形成了铜代叶绿素，便由褐⾊转变成蓝绿⾊，铜代叶绿素很稳定，且⽐原来的绿⾊还要稳定些，在光下也不易被破坏。
设备试剂】【材料、与1. 材料新鲜的菠菜或⼩⽩菜等其他绿⾊植物叶⽚。
2. 设备电⼦天平、研钵、烧杯、量筒、培养⽫、刻度试管、试管夹、试管架、酒精灯、剪⼑、圆形滤纸、⼩漏⽃等。
叶绿体色素的提取分离及理化性质的鉴定
（脱镁叶绿素） ↓
↓ 分离色素
Cu取代 ↓
扫描光谱 花色素实验
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四. 结果与分析
对实验现象作好详细记录， 并加以解释 请对皂化反应现象做出合理解释，而不是
单单用反应方程式来表示
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五. 注意事项
实验中注意安全，石油醚、丙酮等试剂要 远离火源。
研磨过程中丙酮要少量多次加入，以免研 磨时四处飞溅。
– B环上羟基和甲氧基数目 羟基数多，吸收光向长波迁移，颜色偏蓝 羟基被甲氧基替代，吸收光向短波迁移，颜色偏红
– 芳香酸对主要骨架的酯化 – 液泡中pH值 酸红碱蓝 – 营养状况 低温、缺氮、缺磷 促进化色素的形成和积累
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不同花色素的取代基和颜色
花色素
3’
4’
花葵素
-H
-OH
花青素
-OH -OH
根据三碳桥的氧化程度可分为：
花色素苷：呈现颜色。紫色锌化物、红色的碱盐、无色化合物
黄酮
防御伤害。 存在于花器官和绿叶中。
黄酮醇 紫外光保护剂，吸收UV-B，避免细胞受到伤害。
异黄酮
功能多样。鱼藤酮杀虫，植物防御素抑制微生物。
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花色素苷分布广，溶解于细胞液中，与花、果、叶的颜色有关。 颜色受多因素影响：
6.3 如何判断呈橙黄色的花和果实中含的是类 胡萝卜素还是花色素？
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（2）荧光和磷光 荧光现象：Chl溶液在透射光下呈绿色，而反射
光下呈红色的现象。强度大，寿命短（10-9秒） 磷光： Chl溶液停止光照后，仍能在一定时间内
放出暗红色的光。 寿命长（10-2秒——10-3秒）
5
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பைடு நூலகம் 1.2 类胡萝卜素
植物生理学实验4叶绿体色素的提取、分离及理化性质(纸层析法)
结果分析
1. 仔细观察和记录实验结果。 2. 画图说明叶绿体色素纸层析结果，并
解释原因。 3. 解释叶绿素的荧光现象。 4. 解释叶绿体色素分子的替代作用现象。
思考题
1. 研磨提取叶绿素时，为何要加入 CaCO3？
2. 铜在叶绿素分子中具有替代镁的作用， 这有何实用意义？
实验试剂：丙酮、碳酸钙、石英砂、四 氯化碳、无水硫酸钠、浓盐酸、醋酸铜 晶体。
叶绿素的提取
称取新鲜菠菜叶片2g，剪碎放入研钵中，加入 丙酮5 ml、少许CaCO3(中和细胞中的酸防止 Mg2+从叶绿素中心释放)和石英砂，研磨成匀浆， 再加入适量的丙酮（5 ml），然后用漏斗过滤， 即得叶绿体色素液。
铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏， 故常用此法制做植物的原色标本。
实验目的
掌握叶绿体色素的提取方法。 掌握纸层析法分离叶绿体色素的原理和
步骤。 掌握叶绿体色素的部分理化性质。
实验器材和试剂
植物材料: 菠菜叶片
实验器材：试管25 ml量筒、软木塞、 台式天平、研钵、10 ml量筒、试管、 酒精灯、毛细滴管、滤纸、剪刀（自 备）。
3. 在量筒中加入四氯化碳3-5毫升及少量硫酸钠，将滤纸悬 于塞子上。扦入试管，使窄端浸入溶剂中，立于暗处层 析0.5-1小时后观察分层现象。
4. 注意：要求每个同学做一份。
胡萝卜素
最上端橙黄色 的是胡萝卜素， 其次为叶黄素， 于下面蓝绿色 为叶绿素a，最 后的黄绿色为 叶绿素b.
叶黄素
叶绿素a
叶绿素b
韩山师范学院生物系
植物生理学实验
实验四 叶绿体色素的提取、分离及理化 性质（纸层析法)
实验原理
叶绿体色素的提取分离、理化性质和含量测定
叶绿体色素的提取分离、理化性质和含量测定1 实验目的（1）学习用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法；（2）验证叶绿体素的理化性质。
2 实验原理2.1 叶绿素的提取叶绿体是进行光合作用的细胞器。
叶绿体中的叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合称为色素蛋白复合体。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。
提取液可用薄层色谱法加一分离和鉴别。
2.2 叶绿素的分离薄层层析色谱法是将吸附剂均匀的涂在玻璃板上称一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂做流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。
流动相通过毛细血管作用由下而上浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断地吸附、脱吸附、再吸附、再脱附……的过程。
由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一点，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。
2.3 叶绿素理化性质测定叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较为稳定。
叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜带叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多只植物的浸渍标本。
2.4 叶绿素含量的测定根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。
叶绿体色素的提取分离和理化性质
叶绿体色素的提取分离和理化性质组员：陆文文刘亚丽刘三许麻桃霞罗娟娟班级：11生科3班日期：2013-11-19一实验目的：1 掌握叶绿体色素的提取方法；2 掌握用纸层析法提取叶绿体色素；3 掌握叶绿体色素的部分理化性质。
二实验原理：叶绿体中的叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素不溶于水，但可溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。
薄层层析色谱法是将吸附剂均匀涂在玻璃板上成一薄层。
把待分离的样品溶液点在薄层板的下端并把薄层板下端浸入展开剂中后，展开剂通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品在吸附剂和展开剂之间不断地吸附脱附。
由于吸附剂对样品中不同成分的吸附能力不同，从而使各成分有不同的移动速度而彼此分离。
将提取的叶绿素溶液置于光下，在透射光呈绿色，在反射光下呈樱桃红色，这种现象称为荧光现象。
在反射光下叶绿素溶液之所以呈樱桃红色，是因为叶绿色分子吸收光能后处于激发状态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它回到基态时，将所获得的能量以辐射能的形式发射出红光量子。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光、高温等的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
叶绿素中的镁可以被H＋所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜后，其中的氢（H＋）又被铜（Cu2＋）取代，形成了铜代叶绿素，便由褐色转变成蓝绿色，铜代叶绿素很稳定，且比原来的绿色还要稳定些，在光下也不易被破坏。
三实验材料和仪器：1. 材料新鲜的菠菜或小白菜等其他绿色植物叶片。
2.设备电子天平、研钵、烧杯、量筒、培养皿、刻度试管、试管夹、试管架、酒精灯、剪刀、圆形滤纸、小漏斗等。
3.试剂丙酮、四氯化碳、无水硫酸钠、6?mol/L盐酸、醋酸铜粉末、碳酸钙等。
四实验步骤：1.叶绿体色素的提取2.叶绿体色素的分离纸层析分离法纸层析装置如图所示。
具体操作为：（1）先用滤纸条（2cm×4cm）沿长度方向卷成一个紧实的纸芯。
叶绿体色素实验
叶绿体色素的提取、分离、理化性质和含量测定实验一、叶绿体色素的提取、分离1.实验名称叶绿体色素的提取、分离实验2.实验原理叶绿体中色素与内囊体膜结合成为色素蛋白复合体。
这些色素不溶于水，而溶于有机溶剂，可用乙醇等有机溶剂提取。
提取液用薄层色谱法加以分离和鉴别。
本实验采用酒精提取。
层析法原理： K=Cs/Cm。
3.实验试剂与材料新鲜菠菜叶体积分数百分之九十五的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7:5:1）天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸4.实验步骤1．叶绿体色素的提取（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4~5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。
（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2~3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%乙醇，暗处放置3~5min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。
2.色素分离：取硅胶预制板一个，用毛细管吸取提取液，在板短边据下端1厘米处划一细线，待干后再次划线，重复3,4次。
在层析缸中加入层析液，高度0.5厘米，将预制板放入层析液中进行层析。
改好缸盖。
待色素较好分离后，取出硅胶预制板，迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。
5.实验结果与分析滤纸条上出现4条色素带，从上到下依次是：橙黄色胡萝卜素（最快）黄色叶黄素蓝绿色叶绿素a（最多）黄绿色叶绿素b（最慢）二.理化性质1.实验目的验证叶绿素的理化性质。
2.实验原理叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
叶绿体色素的提取、分离及理化性质鉴定
叶绿体色素的提取、分离及理化性质鉴定
实验目的了解叶绿素提取分离原理、方法，验证理化性质
实验原理叶绿素易溶于乙醇、丙酮，类胡萝卜素更易溶于苯；
叶绿素是双羧酸脂类，能与强碱发生皂化反应；
叶绿素分子中络合的镁能依次被H+、Cu2+取代；
叶绿素溶液光照后有荧光现象。
实验器材试管、研钵、太平、毛细滴管、剪刀、移液管、展层缸、滤纸、漏斗、50ml容量瓶、酒精灯、试管夹
实验试剂乙醇、丙酮、苯、盐酸氯化铜混和液、甲醇、氢氧化钾、石英砂
实验材料菠菜叶片
实验步骤
一、叶绿体色素的提取、分离
1、提取：叶片2g剪碎，放入研钵，加乙醇（或丙酮）5ml研磨匀浆，再加10ml，
过滤。
2、分离：滤纸一张，用毛细管在圆心处分次滴加提取液，圆心处穿孔，然后
插入滤纸圆芯；将其放入盛有展层液（汽油或丙酮：苯：石油醚＝9：1：
0.1混和液）的展层缸内，30min.后观察结果。
叶绿体色素被分离成从内
到外的篮绿（叶绿素a）、黄绿（叶绿素b）、浅黄（叶黄素）、橙黄（胡萝卜素）四个同心圆环。
二、叶绿素理化性质鉴定
1、荧光现象观察：浓提取液向光观察呈绿色，背光观察呈血红色（荧光）
2、皂化反应：加提取液0.5ml至试管，加入氢氧化钾的甲醇饱和液2ml，沿
管壁加水2ml，管内有乳白色沉淀出现（皂化）。
加苯1ml，静置5min，上层苯层呈深黄色（类胡萝卜素）。
3、取代反应：加提取液0.5ml至试管，加水2ml，加盐酸氯化铜混和液2ml，
用酒精灯慢慢加热，仔细观察溶液颜色依次有绿变褐（氢取代）再变篮绿（铜取代）。
实验七叶绿体色素的提取分离及理化性质的鉴定讲解
实验七叶绿体色素的提取及理化性质的鉴定一、目的1、学习应用提取分离叶绿体色素的实验方法。
2、验证叶绿素的理化性质。
3、了解叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。
二、原理1、叶绿体色素：植物叶绿体色素主要有三类：1）叶绿素2）类胡萝卜素3）藻胆素。
高等植物叶绿体中含有前两类，藻胆素仅存在于藻类植物中。
高等植物体内叶绿素（chlorophyll两种）主要有两种：叶绿素a、b（简写为chla、chlb，其结构式见图7-3），chla通常呈蓝绿色，而chlb呈黄绿色，chlb是chla局部氧化的衍生物。
chla是chlb的三倍，二十世纪30年代，知道了叶绿素的分子结构，50年代末期，人工合成了叶绿素a，其它色素也几乎在同时发现。
叶绿体中的类胡萝卜素主要包括胡萝卜素（carotene）和叶黄素（lutein）两种，前者呈橙黄色，后者呈黄色。
叶黄素是胡萝卜素的二倍。
一般植物叶绿素是类胡萝卜素的三到四倍；胡萝卜素：C40H56 （有α、β、γ三种同分异构体）叶黄素：C40H54（OH）2 (同分异构体很多)。
2、理化性质：这二大类四种色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮等。
通常用80%的丙酮或丙酮：乙醇：水为4.5：4.5：1的混合液来提取叶绿素。
按化学性质来说，叶绿素是叶绿酸的酯，在碱的作用下，可使其酯键发生皂化作用，生成叶绿酸的盐，能溶于水，但由于它保留有Mg核的结构，仍保持原来的绿色。
而类胡萝卜素中，胡萝卜素是不饱和的碳氢化合物，β—胡萝卜素水解可生成2分子维生素A，叶黄素是由胡萝卜素衍生的二元醇，不能与碱发生皂化反应，根据这一点，可以将叶绿素和类胡萝卜素分开。
此外，叶绿素还可以在酸的作用下，其中的Mg被H所代替形成褐色的去Mg叶绿素：去Mg叶绿素能与其他金属盐中的铜、锌、铁盐等代H，又重新呈现绿色，比原来的绿色更稳定。
根据这一原理可用醋酸铜处理来保存绿色标本。
3、功能：1．叶绿体色素的功能叶绿素和类胡萝卜素都包埋在类囊体膜中，与蛋白质结合在一起，组成色素蛋白复合体，根据功能来区分，叶绿体色素可分为二类：（1）作用中心色素：叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾部”，呈蝌蚪型，大卟啉环由四个小吡咯环以四个含有双键的甲烯基（-CH=）连接而成。
叶绿体色素的提取分离和理化性质实验报告
生物学导论实验报告叶绿体色素的提取分离和理化性质一、提取与分离1、实验目的学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。
2、实验原理提取：叶绿体色素为有机酯类化合物，根据相似相容原理，常用有机溶剂提取。
如酒精、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等。
分离：薄层层析法是将吸附剂均匀的涂抹在玻璃板上形成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待测分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。
流动相通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组成分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱吸附、再吸附……的过程。
由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对移动慢一些，儿媳妇能力弱的物质相对移动快一些，从而使各组分有不同移动速度而彼此分开。
3、实验材料与试剂（1）新鲜的菠菜叶；（2）体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末、展开剂（3）钵体、漏斗、三角瓶、剪刀、点样本、毛细管、层析缸、硅胶预制板、滤纸。
4、实验步骤（1）色素提取液的制备取叶4~5片新鲜叶片，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入钵体中。
加入少量碳酸钙，加2~3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加入10m l乙醇，上清液过滤，残渣再用10ml乙醇冲洗过滤。
（2）叶绿体色素的分离取硅胶预制板一个，用点样毛细管取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，风干，重复操作3~4次；在干燥的层析缸中加入适量展开剂，高度0.5cm，将硅胶预制板带有色素一端放入，使其下端浸入展开剂中；当色素较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板的上端边缘时，取出，画线。
Rf=斑点中心到原点距离/溶剂前沿到原点距离5、实验结果与分析从上至下为胡萝卜素（橙色）：Rf=6.95/7.35=0.946叶绿素a（蓝绿色）：Rf=5.35/7.35=0.728叶绿素b（黄绿色）：Rf=4.95/7.35=0.673叶黄素（黄色）：Rf=4.10/7.350.558可知，胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素极性依次增大，与硅胶吸附能力依次增强。
17叶绿体色素的提取分离及其理化性质
实验目的
以植物叶片组织为材料,提取叶绿体色素;以纸层析法分离其成 分;鉴定叶绿体色素的理化性质.
实验器材和试剂
1、材料：菠菜
2、用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、 分光镜、量筒、烧杯、试管等
3、试剂：丙酮、碳酸钙、层析液（石油醚：丙酮=25：3)， 20%KOH-甲醇、乙醚、1%HCl、醋酸铜
理化性质的观察: 叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发 生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而 成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素， 叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶 液呈血红色。叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特 别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。
纸层析分离叶绿体色素
1.层析样纸制备,将优质滤纸剪成3cm×9cm的长条,将一端剪成中央留约 1cm×0.5cm的窄条; 2.点样,用细玻璃棒蘸取叶绿体色素提取液点于层析纸的窄条上端中央部, 用吹风机吹干后在原处重复点样7-8次; 3.展层,在层析缸中加入3-5ml层析推动液,然后将已点样的层析纸插入缸的 側壁槽内,调节纸条使窄条1/2部分浸入推动液中,盖好盖子,于阴暗处展层 约10min,即可在层析纸上分辨出4种不同的清楚色层;
实验步骤
叶绿体理化性质的观察
荧光现象的观察 取浓的叶绿体色素提取液化5ml,在透射 光和反射光下观察叶绿体色素提取液的颜色.
皂化作用 在观察过荧光现象的叶绿体色素提取液中加 入1.5ml的20%KOH-甲醇溶液,充分混匀.再加入5ml的苯液, 并混匀;沿试管壁缓慢加入1.5ml的蒸馏水,边滴加边摇动,直 至看到溶液逐渐分为两层为止.
叶绿素a：C55H72O5N4Mg，MW=893.4891
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叶绿体色素的
提取分离和理化性质主讲：张海森博士
一、实验目的
因此，测定叶绿体色素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在实际生产中也有着广泛的应用。
1、学习叶绿体色素的提取方法。
2、了解叶绿素和类胡萝卜素的
一些主要理化性质。
绿色植物的光合作用是离不开叶绿体色素的，了解叶绿体色素的组成和性质对于理解光合作用的本质很有帮助。
叶绿体色素分为叶绿素和类胡萝卜素两类。
它们与类
囊体膜上的蛋白质相结合，成为色素蛋白复合体，不溶于水，溶于有机溶剂，因此，可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。
二、叶绿体色素的提取原理
三、实验材料：
菠菜叶片
五、叶绿体色素的理化性质
1.光对叶绿素的破坏作用
叶绿素（a，b）的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当色素分子与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
水提取液暗光乙醇提取液暗光
1) 取四支小试管，分别加入两种提取液2ml，稀释2-3倍；
2) 各取两只试管放于暗处; 另两只试管置于强光下，进行光破坏；
3) 30min后，对比观察光破坏的结果。
光对叶绿素破坏的操作步骤：
2.提取液中各成分分离：
用色层分析的原理加以分离
因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在流动相和固定相之间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。
叶绿体色素的结构决定了它们极性的不同，因而在滤纸上的迁移速率不同。
叶绿体色素
叶绿素
类胡萝卜素叶绿素a 叶绿素b
叶黄素胡萝卜素
问题：请根据这四种色素分子的结构比较它们极性的大小。
步骤：
（1）取圆形滤纸1张，用细头的吸管在其中心戳一圆形小孔。
（滤纸直径为11cm）
（2）另取一张长方形滤纸条（5cm×1.5cm），沿纸条长边方向涂抹色素，风干后，重复涂抹数次。
十次涂抹之后，沿长边方向卷成纸捻。
（3）纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使之与滤纸刚刚平齐（勿凸出）。
（4）将康维皿置于培养皿内，向康维皿中央小室加入推动剂。
（5）把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。
盖好培养皿。
（6）当推动剂到达滤纸外边缘2/3时，取出滤纸，风干。
实验结果：
将圆形滤纸剪下一部分附到实验报告中，用铅笔标出各种色素的位置和名称。
3、荧光现象
叶绿素的荧光现象: 叶绿体色素乙醇提取液在透射光下为翠绿色，在反射光下为棕红色。
这红光就是叶绿素受光激发后发射的荧光。
步骤：取20ml刻度试管一支，加入叶绿体色素乙醇提取液5ml，观察荧光现象。
4、皂化作用
C 32H 30ONMg
COOCH 3
COOC 20H 39
+ 2KOH
C 32H 30ON 4Mg
COOK
COOK
+ CH 3OH + C 20H 39OH
叶绿醇
甲醇
叶绿素是一种二羧酸酯，可与碱发生皂化反应，生成醇和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水，用这种方法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。
步骤：
1）向观察过叶绿素荧光的试管中加入 1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀；
2）稍后，加入5ml苯，摇匀；
3）沿试管内壁缓慢加入蒸馏水1-1.5ml，轻轻混匀后至于试管架上，静置分层。
注意：如果分层后下部的溶液浑浊，可以剧烈震荡，对试管加温后，溶液会很快分层，白色絮状物消失。
5、吸收光谱的观察
把观察过皂化
反应的试管置
于光源和分光
镜之间，分别
观察上层溶液
和下层溶液的
吸收光谱。
H +
Cu 2+
叶绿素分子中的Mg 2+被H +所取代会生成褐色的去镁叶绿素;Cu 2+取代H +形成铜代叶绿素;
铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
6、H +和Cu 2+对叶绿素分子中Mg 2+的取代作用
小试管，编号1#
步骤：
加乙醇色素提取液2ml
稀释3倍，混匀取出1/3放到2＃（CK1）
加5％盐酸1滴
摇匀取出1/2放到3＃（CK2）加入醋酸铜粉末少许
不断摇动，文火加热（严禁放到火上烧）
3支试管进行比较，观察并记录颜色变化。