实验DNA酶切连接及电泳检测

II型限制性内切酶主要特点： 识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个 或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸 以及7个、8个、9个、10个和11个核苷 酸的。在分子克隆实验中使用最普遍的 是那些识别4个或6个碱基对的限制性内 切酶。II 型限制性内切酶的识别顺序是 一个回文对称顺序，即有一个中心对称 轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全 相同。这种酶的切割可以有两种方式： 粘性末端和平头末端。
Arber W. Smith H.O. Nathans D.
第一个DNA重组分子
1972年Paul Berg等人利用限制性内切酶EcoRI和 连接酶获得了第一个DNA重组分子。标志着遗传工 程的开始。
Paul Berg The Nobel Prize in Chemistry 1980
通过DNA重组技术构建DNA重组子
混匀；点动离心将反应液甩至管底。37℃(PCR仪)保温1-2h进行酶切反应。 ↓
反应结束后， 75℃，保温10min使酶失活。 ↓
电泳检测
样品代号 ddH2O
pUC19 10*H E
成份 无菌水(μl) 质粒(μl) 酶切缓冲液(μl) EcoRI酶(μl) Total(μl)
反应1（标准pUC19) 7 10 2 1.0 20
质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图
质粒DNA的带型分析
M pUC19
环形质粒DNA 超螺旋粒DNA
Biblioteka Baidu
出现问题
电泳条带浓度和纯度 电泳条带拖尾现象（加样过多，离子浓度，
胶未完全凝固） 质粒DNA的带型分析
实验六 DNA的酶切、连接及电泳检
测
实验步骤
（一）质粒DNA酶切(注：每人一管）
在200μl 的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：μl） ↓
通过DNA重组技术构建DNA重组子
利用限制性核酸内切酶切割DNA+利用DNA连接酶连 接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。
成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主 细胞进行表达提供了有效的实验材料。
限制性内切酶的发现
1965年Werner Arber第一个描述了限制性内切现象； Hamilton O. Smith第一个纯化了限制性内切酶，并鉴定了 其性质； Daniel Nathans用这些酶将SV40病毒的DNA切割成了特定 的片段，并绘制了SV40病毒基因组的“物理图谱”。 1978年这三人获得了当年的Nobel奖。
酶切 连接
实 验 原 理 – 酶切
限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特 殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。
限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识 别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切 割双链DNA。
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切 核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制 异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无 损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种 切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶 。
实验结果分析
关于OD值分析
一40个ugO/mDl2单60n链m单DN位A相或当R于NA于50ug/ml 双链DNA 或 OD260/280: 1.8-2.0 DNA: 1.8 (RNA: 2.0) 比值<1.8：蛋白质污染 比值>2.0: RNA污染
关于电泳条带
质粒在正常情况下以共价闭合环状cccDNA构型(超螺旋scDNA)存在 ，在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发 生断裂。所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状/超 螺旋DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA）；线形DNA(LDNA)
根据限制酶的识别切割特性、催化 条件及是否有修饰酶活性，可分为 Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重 组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割 后得到的是带粘性末端或平末端的 线性DNA。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA 的甲基化，又催化非甲基化的DNA 的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催 化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ 型 切割位点则在下游 24-26bp 处 。
Buffer 连接缓冲液
T4
T4DNA连接酶
总体积
用量（μl） 7.0 10.0 2.0 1.0 20
（三）质粒酶切样品和DNA连接样品的电泳检测
琼脂糖凝胶的制备：制备2块0.7% （0.28g/40ml）和2块1.2%琼脂 糖凝胶（0.48g/40ml）。 （注：全班制备4块胶）
实验目的
1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立； 2、了解影响酶切的因素； 3、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立； 4、了解影响连接反应的因素。
酶切
样品代 号
成份
ddH2O 无菌水(μl)
pUC1 9
质粒(μl)
10*H E
酶切缓冲液 (μl)
EcoRI酶(μl)
Total(μl)
反应（标准 pUC19)
7
10
2 1.0 20
（二） DNA片段的连接(注：每人一管）
取200 μl的离心管按下表加入试剂。
↓ 混匀后点动离心，将溶液甩至管底
Ⅰ类 Ⅱ类 Ⅲ类
需Mg2+、 SAM及 ATP
仅需Mg2+
需Mg2+及 ATP
识别位点复杂， 特异性差， 切割位点距 识别点远。
识别切割特异性 强，切割发 生在识别位 点。
切割位点在识别 位点周围， 酶活性不单 一。
命名
一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两 个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如 ，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限 制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到 的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可 以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、 HpaII，MboI、MboII等。
↓ 置于已调好温度为12℃-16℃PCR仪中
↓ 保温1-2h后取出
↓ 电泳检测
样品代号 ddH2O T14 10*T4 T4
成分 ddH2O λDNA/EcoT14 I片段 连接缓冲液 T4DNA连接酶 总体积
用量（μl） 7.0
10.0 2.0 1.0 20
连接
样品代 成分 号
H
ddH2O
T14 λDNA/EcoT14 I片段