实验DNA酶切连接及电泳检测
DNA酶切电泳
DNA酶切及电泳陈瑞州 201110424108一、实验目的1.掌握DNA酶切的基本原理和方法；2.学习和掌握琼脂糖点样的基本方法；3.学习判断DNA大小的方法。
二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。
通过将酶切后的DNA片段和标准的已知酶切后片段长度的Maker一起跑电泳后，即可得到条带清晰的电泳图谱，从而推测出各DNA片段的大小。
三、实验材料λDNA；EcoR I酶；HindIII酶；BamHI酶；酶切缓冲液；琼脂糖凝胶；ddH2O；buffer四、实验步骤1.DNA酶切反应HindIII酶 2ul EcoR I酶 2ul BamHI酶 2ul ○1 10Xbuffer 2ul（M）○2 10Xbuffer 2ul（H）○310Xbuffer 2ul（H）λDNA 6ul λDNA 6ul λDNA 6ulddH2O 10ul ddH2O 10ul ddH2O 10ulEcoR I酶 1.5ulBamHI酶 1.5ul○4 10Xbuffer 2ul（H）λDNA 6ulddH2O 9ul将灭菌好的离心管编号，用微量移液枪分别加入上述四种反应体系中的试剂，用微量离心机甩一下，使液体集中在管底。
混匀反应体系后，将离心管置于试管架中，于37℃下酶切2-3小时。
2、琼脂糖凝胶电泳用微量移液枪向酶切完全后的上述四个体系的管中各加入2ul loading buffer ，吸取15ul的上述四样液点样，另外两边各用λDNA Marker点样。
于100V下跑电泳30-60分钟，使DNA片段大概跑过凝胶一半左右即可。
于紫外灯下拍照记录。
五、结果分析。
dna的酶切实验报告
dna的酶切实验报告
《探索基因密码：DNA酶切实验报告》
DNA是构成生物遗传信息的重要分子，它携带着生物体的遗传信息，决定了生
物的形态和功能。
而DNA酶切实验则是一种重要的分子生物学实验，通过该实验可以对DNA分子进行精确的切割，从而揭示出DNA的结构和特征。
本报告
将详细介绍DNA酶切实验的步骤、结果和意义。
首先，我们需要准备实验所需的材料和试剂，包括DNA样本、酶切酶、缓冲液等。
接着，将DNA样本与酶切酶和缓冲液混合，并进行恒温反应。
随后，将反应产物进行电泳分析，通过电泳图谱可以观察到DNA分子在电场作用下的迁移情况，从而确定DNA分子的大小和数量。
实验结果显示，经过酶切反应后，DNA分子被切割成不同大小的片段，这些片
段呈现出特定的条带模式。
通过比对电泳图谱和标准DNA片段的大小，我们可以确定DNA分子的酶切位点和切割情况。
这些数据对于研究DNA的结构和功
能具有重要意义。
DNA酶切实验的意义在于揭示了DNA分子的结构和特征，为我们深入了解基
因的组成和功能提供了重要的实验手段。
通过该实验，我们可以对DNA分子进行定量和定性分析，从而揭示出基因的编码规律和变异情况。
这对于生物学、
医学和遗传学等领域的研究具有重要的意义。
总之，DNA酶切实验是一种重要的分子生物学实验，通过该实验可以揭示DNA 分子的结构和特征，为我们深入了解基因的组成和功能提供了重要的实验手段。
希望本报告可以对相关领域的研究工作提供一定的参考和帮助。
DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法
DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法一、电泳前准备准备内容作用 1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净防止不必要的重复污染，减少外来的污染。
梳子干净晾干有利于梳孔的形成。
2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。
3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。
4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶实验记录备查最终越薄越好。
二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。
瓶子。
因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。
保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。
3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手制胶的桌面相对水平。
倒胶时尽量减少气泡的产生。
可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓次性倒入。
梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔度为0.5ug/ml。
不宜过低，染色成像不明显；不宜过的体积能点的下所有的样。
用枪头赶掉气泡。
高，导致背景太深。
摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。
高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。
4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。
时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。
5.拔梳子，放入电泳槽。
缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。
暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。
电泳液要浸没胶1mm。
三、上样电泳步骤注意事项 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。
DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳实验原理及步骤
实验6 DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳目的要求（1）掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。
（2）学习利用琼脂糖凝胶电泳方法测定DNA片段大小。
（3）学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术。
原理DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。
不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电脉时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭（菲啶溴红）染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。
琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅为0.5—1μg，超薄型平板琼脂糖凝胶电泳所需DNA 可低于0.5μg。
溴乙锭检测DNA，灵敏度很高，10ng（10-9g）或更少的DNA即可检出。
DNA在凝胶中的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比。
将未知DNA 的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA 片段的大小。
质粒DNA分子量一般在106—107范围内，如质粒pBR322的分子量为2.8×106。
质粒DNA在细胞内存在可以有3种形式；共价闭环(ccc DNA)、线形DNA和开环的双链环状（opDNA）。
电泳时，同一质粒超螺旋DNA的泳动速度比开环和线形DNA的泳动速度为快。
提取制备的质粒DNA中，常存在超螺旋和开环DNA，在凝胶板上即可显示出2条迁移位置不同的荧光条带（见图34.1）。
本实验采用限制性内切酶Hind Ⅲ或EcoR Ⅰ酶解λDNA的片段为标准物，建立其酶切图谱，同时以酶解各片段的分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上，连接各点绘帛出测定DNA分子量的标准曲线。
共价闭环质粒pBR322 DNA只有一个EcoR Ⅰ酶切位点，酶解后成为一条完整线状DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，测量酶解后线型DNA的迁移距离，可以直接在分子量标准曲线上得出其分子大小。
同时通过与标准pBR322 EcoR Ⅰ酶切图谱的比较分析，可以对提取质粒DNA进行鉴定。
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验目的：通过酶切实验分析质粒DNA的结构和性质。
实验原理：酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列的方法。
限制性内切酶是一种从细菌体内提取的一类酶，具有切割DNA的特异性。
实验步骤：1.实验准备：准备好所需试剂，包括限制性内切酶、缓冲液、质粒DNA等。
2.酶切反应：在一个离心管中，依次加入适量的缓冲液、质粒DNA、限制性内切酶及适量的蒸馏水，混匀后转入恒温水浴中进行酶切反应。
3.电泳分离：将酶切后的DNA溶液取出一定量，加入适量的电泳样品缓冲液，用于电泳分离。
4.染色观察：将分离出的DNA胶片浸泡于DNA染色剂中，染色后进行观察。
实验结果：通过电泳分离和染色观察，我们可以看到质粒DNA在电场作用下被分离成多个带状。
每个带状代表着一段特定长度的DNA序列，不同的长度代表着不同的DNA片段。
实验分析：1.酶切结果：酶切后的DNA片段的长度可以根据电泳结果得出。
通过比对DNA 片段与已知DNA序列的长度，我们可以推断得到质粒DNA的特异性序列。
如果我们使用了多种限制性内切酶，那么在电泳结果中会出现更多的带状。
2.质粒结构：通过酶切实验可以初步了解质粒DNA的基本结构。
如果酶切结果显示出多个相同长度的DNA片段，说明质粒DNA具有对称的环状结构。
如果酶切结果显示出不同长度的DNA片段，那么质粒DNA可能是线性的。
3.酶切效率：酶切效率是指限制性内切酶切割质粒DNA的效率。
酶切效率越高，产生的DNA片段长度越精确。
如果酶切反应时间过长或者酶切温度不合适，都可能导致酶切效率下降。
实验结论：通过质粒DNA酶切实验，我们可以初步了解质粒DNA的结构和性质。
这对于进一步研究质粒DNA的功能和应用具有重要意义。
dna酶切实验报告
dna酶切实验报告DNA 酶切实验报告一、实验目的本次 DNA 酶切实验的目的在于掌握 DNA 酶切的基本原理和操作方法，了解限制性内切酶的特性和作用，通过对特定 DNA 片段的酶切，为后续的分子生物学实验如 DNA 连接、克隆和基因分析等提供基础。
二、实验原理DNA 酶切是一种分子生物学技术，基于限制性内切酶对特定 DNA序列的识别和切割作用。
限制性内切酶能够识别双链 DNA 分子中特定的碱基序列（通常为 4 8 个碱基对），并在特定的位点进行切割，产生具有粘性末端或平末端的 DNA 片段。
不同的限制性内切酶具有不同的识别序列和切割方式。
在本实验中，我们使用了具体限制性内切酶名称，其识别序列为具体序列，切割后产生粘性末端/平末端。
三、实验材料与设备1、实验材料待酶切的 DNA 样品（如质粒 DNA 或基因组 DNA）限制性内切酶酶的名称及来源酶切缓冲液琼脂糖上样缓冲液DNA 分子量标准2、实验设备移液器恒温培养箱电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、准备酶切反应体系按照实验要求，在无菌的离心管中依次加入适量的 DNA 样品、限制性内切酶、酶切缓冲液和无菌去离子水，使总体积达到具体体积。
轻轻混匀反应体系，短暂离心使液体集中在管底。
2、酶切反应将离心管放入恒温培养箱中，在设定温度下孵育反应时间。
3、终止酶切反应取出离心管，加入适量的上样缓冲液终止反应。
4、琼脂糖凝胶电泳制备浓度的琼脂糖凝胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液。
将酶切产物与 DNA 分子量标准分别加入凝胶的加样孔中。
接通电源，以电压进行电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移到适当位置。
5、凝胶成像观察电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像系统中观察并拍照，记录酶切结果。
五、实验结果与分析1、电泳结果通过凝胶成像系统观察到清晰的 DNA 条带。
DNA 分子量标准呈现出预期的条带分布，用于估计酶切产物的大小。
酶切后的 DNA 样品显示出与预期相符的片段大小，表明酶切反应成功。
DNA的酶切与连接1.实验目的了解DNA限制性内切酶和连接的作用...
DNA的酶切与连接1. 实验目的了解DNA限制性内切酶和连接的作用原理，学习和掌握利用限制性内切酶进行DNA 消化和片段的方法和技术。
2. 实验原理DNA限制性内切酶和连接酶是遗传工程中实现DNA的切割和重组的重要工具酶，也是基因工程技术赖以生存的基础。
1970年Smith H·O等从流感病毒中提取了第一个限制性内切酶Hind II，其作用于外源DNA后，切割产生平末端。
人们经过研究发现，限制性内切酶可以识别双链DNA分子上的特异序列，通常识别区具有回纹结构，并使两个特定核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
目前已经从微生物中发现了200多种限制性内切酶，其中大部分可以切割DNA形成粘性末端。
如EcoR I，可以识别6个碱基的序列：▼5’ ――――――GA TTC――――――3’3’ ――――――CTTAAG――――――5’▲切割后形成的片段5’――――――G AA TTC――――――3’3’――――――CTTAA G――――――５’当限制性内切酶作用于DNA时可以形成的酶切片段数为：片段数目= 切点数+1 （线状DNA）片段数目= 切点数（环状DNA）切点出现的频率为1/4s（S为识别顺序所含的碱基数目）DNA连接酶则可以将切开的DNA片段连接起来，此时需要接口两端具有磷酸根。
对粘性末端的单链可以进行点接，对于平末端来说也可以进行连接，但是需要较多的酶。
在基因工程中，可以利用同一种限制性内切酶分别切割目标DNA和运载体，然后利用T4DNA 连接酶将目标序列整合到运载体中，使DNA中的3’-OH与5’-P生成磷酸二酯键。
3. 实验用具及材料电泳仪、恒温水浴锅、紫外检测仪、微量移液器、Eppendorf离心管10×酶切反应缓冲液、T4DNA连接酶缓冲液、溴酚蓝指示液、EB电泳缓冲液、PBR322质粒DNA、pXZ6质粒DNA，λphage DNA、DNA Marker EcoRI Hind III。
质粒DNA提取+电泳+质粒酶切实验报告
实验一：质粒DNA提取+琼脂糖凝胶电泳*实验目的：1.掌握质粒DNA提取的基本原理和方法2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法*实验原理：1.DNA提取原理1）DNA提取要求：①保证DNA一级结构的完整性；②排除其他分子的污染，使其纯度尽可能提高。
2）DNA样品来源：①培养细胞；②组织样本；③血液样本。
3）主要试剂和材料及仪器：试剂和材料：RNA酶A、细胞悬浮液（Buffer P1)、细菌裂解液（Buffer P2）、中和液（Buffer P3）、漂洗液PW1、漂洗液PW2、洗脱液、质粒DNA吸附柱、滤液收集管仪器：微量移液器、台式微量高速离心机、电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪或凝胶成像系统。
2.电泳原理：1）概念：电泳是指带电粒子在电场中向电势降低的方向移动的现象，移动速度与粒子大小及所带电荷多少有关。
在一定pH条件下，核酸及蛋白质等生物分子呈带电状态，可以进行电泳分析。
2）迁移方向：DNA由负极向正极迁移3）影响目标物迁移速率的因素：分子大小、构象、凝胶浓度、琼脂糖种类、电泳缓冲液、嵌入染料的存在和使用电压等。
4）荧光强度（得率）：荧光的强度是同DNA片段的大小或数量成正比的。
5）琼脂糖凝胶电泳原理：(1)关于电泳技术:电泳常用于分离和纯化那些分子大小电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子一尤其是蛋白质和核酸。
正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。
琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。
通过改变琼脂糖凝胶的浓度,应用标准的电泳技术可以分离200到50,000 bp大小的DNA片断。
一般琼脂糖胶浓度在0.5%到4%之间，琼脂糖凝胶浓度越大,凝胶就越硬。
较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离,而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。
(2)琼脂糖凝胶电泳条带的观察:通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。
质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定
质粒DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定一目的学习质粒的酶切及电泳分析。
二原理限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。
因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。
用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。
电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。
因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。
三试剂与主要仪器（一）试剂1．Eco RⅠ酶2．λ DNA3．TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍4．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油5．溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。
6．琼脂糖（二）仪器1．电泳仪系统2．紫外灯3．恒温水浴箱四操作步骤（一）质粒DNA酶切1．按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号。
管号①②③质粒DNA 10 10 10Eco RⅠ/ μl 1 1酶切Buffer（10×）/ μl 2 2 2ddH2O/ μl8 7 6RNA酶 1 2．加样后混匀，置于37℃水浴中，保温2小时。
然后每个管中加入4 μl Loading buffer。
（二）琼脂糖凝胶电泳1 琼脂糖凝胶的制备称取0.4g琼脂糖加入40ml 0.5×TBE缓冲液中，加热熔解。
冷却至65℃时加入2μl EB，混匀。
质粒DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定
质粒DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定[实验原理]限制性内切酶识别短的DNA序列并在识别序列内或旁侧特异性切割双链DNA。
对环状DNA有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。
如上次实验提取的质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称CCCDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂，(open circular DNA，简称OCDNA)，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂(linear DNA，简称L DNA)。
这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。
因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
[仪器、材料与试剂]（一）仪器与材料恒温水浴槽、电泳仪、电泳槽、紫外线透射仪、移液枪、质粒、HindI II酶、EcoRI酶(二) 试剂1 000 mL 5xTBE：Tris 54 g硼酸27.5 g 0.5 mol／L EDTA 20 mL（pH 8.0）凝胶加样缓冲液(6x)：溴酚蓝0.25％蔗糖40％琼脂糖溴化乙锭溶液(EB) 0.5ug／mL[实验步骤](一) 酶切取5uLDNA溶液，加1uL酶切缓冲液，EcoRI酶1uL(2U)，无菌水补至总体积10uL，37保温3h，加凝胶上样缓冲液(6X)2uL，准备下个实验进行电泳，分析质粒DNA的限制性酶切图谱。
DNA的酶切及电泳检测
DNA的酶切及电泳检测酶切体系：酶切应使用0.5ml灭菌炮弹和灭菌枪头（一般为10ul，也可以适当增加体系量）10ul体系：①DNA含量在0.5ug；②一般酶用0.25ul（理论上1ug DNA~1U ase，实际上，为了便于完全切割，常用1ugDNA~2-4U ase；一般1ul ase为10U, 按此计算）；③buffer 1×用1ul，0.5×用0.5ul（有时会用到1×BSA）；④最后用水补齐。
在配置相同的酶切体系时，可以先总配再分装。
不同的酶有不同的特性，我们平常使用的酶一般为37℃，1h。
双酶切体系：①若两个酶用同一种buffer（须为同一家公司），可一起酶切，至少1h。
②若两个酶不同buffer，最好分开切。
注意：●酶程太大，>100ug/ng DNA或PH>8.0，会导致星活性。
●BSA，牛血清白蛋白。
●Pr, EDTA, 酚，氯仿，SDS, 乙醇都会影响酶活。
可以通过纯化，增加酶量，增加酶切的时间等克服。
配胶：一般配置1%，20ml的琼脂糖凝胶。
0.2g琼脂糖+20ml TAE/TBE→min火（比小火还小两个点）加热2-3min液体至透明→晾至55℃（不烫手即可）→加入0.5ul EB（小分子插入DNA中，紫外显红色，积累性致癌物）→倒入叉好梳子的板内→待胶冷却凝固电泳：每个体系加入10%（1ul）的溴酚兰，混合后点入点样孔中→每块胶中点入合适的marker 以确定每个样品DNA的大小（一般10ul的marker亮度即为0.5ug DNA亮度）→80V 20min 左右溴酚兰跑到全胶的4/5左右。
（溴酚兰所处位置约为400bp）。
质粒DNA的酶切和连接
华南师范大学实验报告学生姓名闫红博学号 20122501108专业生物科学年级、班级 12级生科三班课程名称分子生物学实验实验项目：质粒DNA酶切、连接、电泳检测实验类型□验证□设计□综合实验时间 2015年4月21日实验指导老师实验评分一、实验目的1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立；2、了解影响酶切的因素；3、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立；4、了解影响连接反应的因素。
二、实验原理1、限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。
2、限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。
3、DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。
它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。
但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。
4、常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。
二者的作用机理类似。
三、实验试剂和材料1、材料与试剂酶切反应：标准pUC19(2686bp)EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液检测：0.5×TBE电泳缓冲液6×电泳载样缓冲液、Goldview、琼脂糖四、实验步骤（一）质粒DNA酶切在200μl 的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：μl）↓混匀；点动离心将反应液甩至管底。
基因工程实验2：质粒DNA的酶切及电泳鉴定
• 星号活力*
二、实验原理——琼脂糖凝胶电泳
• 1、琼脂糖凝胶
• 琼脂糖加热溶解后冷却，形成孔径结构，成为良好的电泳 介质。其孔径大小由琼脂糖的浓度决定。
• 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强； • 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2 kb~50 kb之间，常 用0.3%~2%浓度的琼脂糖凝胶，可分辨300 bp~5000 bp 的DNA片段。 • 低熔点（LMP）琼脂糖，熔点为62℃~65℃的琼脂衍生物， 一旦熔解，可在37℃下持续保持液体状态达数小时之久， 在25℃下也可持续保持液体状态约10分钟。LMP琼脂糖 可用来回收DNA分子，用于DNA片段的制备电泳。
四、实验步骤
• 1、质粒DNA的酶解（单酶切）
EcoR I 酶切位点：G’ AATTC
2、琼脂糖凝胶电泳
1、 0.8%琼脂糖凝胶的制备：称取0.16 g琼脂糖，置于锥形 瓶中，加入20 mL 0.5*TBE稀释液。（一个制胶板的量） 加热直至琼脂糖溶解。摇匀，冷却至60℃（不烫手），加 入溴化乙锭1μL （终浓度0.5 μg/mL）充分摇匀。 2、胶板的制备： 取有机玻璃内槽，洗净（注意保护电极丝）、晾干。 将有机玻璃内槽置于一水平位置，插好梳子。 将冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃 内槽上，注意排气泡，使整个有机玻璃板表面形成均匀的胶 层。室温下静置，待凝固完全后，轻轻垂直拔出梳子。 用滴管将样品槽内注满TBE稀释液以防止干裂。制备好胶 板后将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽中使用。 3、加样(见下表)
•（5）电泳缓冲液 •目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：TAE、TBE和 TPE •（6）EB
三、实验材料
• 1、仪器和材料 • 电泳仪，电泳槽，制胶板，锥形瓶(100 mL或 50 mL)，紫外检测仪/凝胶成像系统，一次性 手套，Ep管，取液器及无菌吸头，水浴锅 • 2、试剂 • (1) 质粒pMD18-T DNA • (2) DL2000 Plus • (3) EcoRI酶 (EcoRI酶解反应缓冲液10×) • (4) 琼脂糖 • (5) 溴乙锭(10 mg/mL贮藏液) • (6) TBE缓冲液(0.5×) • (7) 酶反应终止液(10×)
植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析
二、原理十六烷基三乙基溴化胺是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。
三、试剂与器材（一）、试剂1 、DNA extraction ：500ml31.885g sorbitol (山梨醇)6.05g tris PH8.2 (一般不调)2、Nuclei lysis buffer: 500ml100ml 1M Tris PH7.5100ml 0.25M EDTA200ml 5M NaCl10g CTAB100ml ddH2O3、5% lauroyl sarcosine (N-月桂酰肌氨基钠盐) 500ml用时，将上述三种溶液按1：1：0.4 比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/l），65℃预热，既为抽提液。
（二）器材恒温水浴、研钵、电泳设备四、操作步骤（一）、基因组DNA提取1 取0.15g左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中，加入700ml抽体液（65℃预热）混匀，放入65℃水浴中，裂解40-60分钟，期间温和混匀几次。
2 取出裂解好的DNA ，加入700ml氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀，离心（1000rpm，10分钟）。
3 取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃放半小时以上。
4 将析出的DNA 离心，14000rpm，10分钟。
5 去掉上清，将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，离心干燥，溶于50ml ddH2O。
实验5 DNA酶切
第一个DNA重组分子
1972年Paul Berg等人利用限制性内切酶EcoRI和 连接酶获得了第一个DNA重组分子。标志着遗传工 程的开始。
Paul Berg The Nobel Prize in Chemistry 1980
通过DNA重组技术构建DNA重组子
成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿 主细胞进行表达提供了有效的实验材料。
限制性内切酶的发现
1965年Werner Arber第一个描述了限制性内切现象； Hamilton O. Smith第一个纯化了限制性内切酶，并鉴定了 其性质； Daniel Nathans用这些酶将SV40病毒的DNA切割成了特定 的片段，并绘制了SV40病毒基因组的“物理图谱”。 1978年这三人获得了当年的Nobel奖。
材料、试剂及器具
1、材料与试剂 酶切反应： 标准pUC19(2686bp) EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液 检测： 0.5×TBE电泳缓冲液 6×电泳载样缓冲液 、Goldview、琼
脂糖
2 、器具： 水平式电泳装置 电泳仪,台式高速离心机 恒温水浴锅（用PCR仪代理） 微量移液枪 微波炉或电炉 紫外透射仪 照相机及其附件
如: EcoRI的识别顺序为：
5’…… G A A T T C ……3’ 3’…….C T T A A G …… 5’
回文结构的对称轴
限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1个酶单位 （1 Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min,完全 酶切1μg的纯DNA所用的酶量。
影响酶切的因素：在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液 中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加 酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应该注 意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶 切(星号活性)。图:构建DNA重组子
质粒DNA的酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳
4) 限制性核酸内切酶的命名法
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母 表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表 示，所以用斜体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 Rd菌株用d，即Hind。
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
质粒量 缓冲液 EcoR1 Xho1
H2O 总体积
（ng） (μl)* （μl） （μl） (μl) （μl）
I 200
2
0
0 17-19 20
II 200
2
0.5
0 15-17 20
III 200
2
0.5 0.5 14-16 20
* 缓冲液随不同的酶而不同,本实验用 H buffer。
置于37℃水浴酶解0.5-1小时。酶解完成后，分 别加入10l 3倍的上样缓冲液, 然后各取15l进 行电泳分析。
2) 琼脂糖凝胶的制备
琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8g琼脂糖， 置于三角瓶中，加入100ml TBE或TAE 工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该 三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。
3）胶板的制备
取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶 条(宽约1cm)，将有机玻璃内槽置于一 水平位置模具上，放好梳子。
将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小 心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速 度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整 个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。
片段 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10a 10b
碱基对 10,002
8,001 6,001 5,001 4,001 3,001 2,000 1,500 1,000
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酶切
样品代 号
成份
ddH2O 无菌水(μl)
pUC1 9
质粒(μl)
10*H E
酶切缓冲液 (μl)
EcoRI酶(μl)
Total(μl)
反应（标准 pUC19)
7
10
2 1.0 20
（二） DNA片段的连接(注：每人一管）
取200 μl的离心管按下表加入试剂。
↓ 混匀后点动离心，将溶液甩至管底
↓ 置于已调好温度为12℃-16℃PCR仪中
↓ 保温1-2h后取出
↓ 电泳检测
样品代号 ddH2O T14 10*T4 T4
成分 ddH2O λDNA/EcoT14 I片段 连接缓冲液 T4DNA连接酶 总体积
用量（μl） 7.0
10.0 2.0 1.0 20
连接
样品代 成分 号
H
ddH2O
T14 λDNA/EcoT14 I片段
Ⅰ类 Ⅱ类 Ⅲ类
需Mg2+、 SAM及 ATP
仅需Mg2+
需Mg2+及 ATP
识别位点复杂， 特异性差， 切割位点距 识别点远。
识别切割特异性 强，切割发 生在识别位 点。
切割位点在识别 位点周围， 酶活性不单 一。
ห้องสมุดไป่ตู้
命名
一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两 个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如 ，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限 制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到 的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可 以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、 HpaII，MboI、MboII等。
通过DNA重组技术构建DNA重组子
利用限制性核酸内切酶切割DNA+利用DNA连接酶连 接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。
成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主 细胞进行表达提供了有效的实验材料。
限制性内切酶的发现
1965年Werner Arber第一个描述了限制性内切现象； Hamilton O. Smith第一个纯化了限制性内切酶，并鉴定了 其性质； Daniel Nathans用这些酶将SV40病毒的DNA切割成了特定 的片段，并绘制了SV40病毒基因组的“物理图谱”。 1978年这三人获得了当年的Nobel奖。
混匀；点动离心将反应液甩至管底。37℃(PCR仪)保温1-2h进行酶切反应。 ↓
反应结束后， 75℃，保温10min使酶失活。 ↓
电泳检测
样品代号 ddH2O
pUC19 10*H E
成份 无菌水(μl) 质粒(μl) 酶切缓冲液(μl) EcoRI酶(μl) Total(μl)
反应1（标准pUC19) 7 10 2 1.0 20
根据限制酶的识别切割特性、催化 条件及是否有修饰酶活性，可分为 Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重 组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割 后得到的是带粘性末端或平末端的 线性DNA。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA 的甲基化，又催化非甲基化的DNA 的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催 化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ 型 切割位点则在下游 24-26bp 处 。
实验结果分析
关于OD值分析
一40个ugO/mDl2单60n链m单DN位A相或当R于NA于50ug/ml 双链DNA 或 OD260/280: 1.8-2.0 DNA: 1.8 (RNA: 2.0) 比值<1.8：蛋白质污染 比值>2.0: RNA污染
关于电泳条带
质粒在正常情况下以共价闭合环状cccDNA构型(超螺旋scDNA)存在 ，在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发 生断裂。所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状/超 螺旋DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA）；线形DNA(LDNA)
II型限制性内切酶主要特点： 识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个 或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸 以及7个、8个、9个、10个和11个核苷 酸的。在分子克隆实验中使用最普遍的 是那些识别4个或6个碱基对的限制性内 切酶。II 型限制性内切酶的识别顺序是 一个回文对称顺序，即有一个中心对称 轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全 相同。这种酶的切割可以有两种方式： 粘性末端和平头末端。
Buffer 连接缓冲液
T4
T4DNA连接酶
总体积
用量（μl） 7.0 10.0 2.0 1.0 20
（三）质粒酶切样品和DNA连接样品的电泳检测
琼脂糖凝胶的制备：制备2块0.7% （0.28g/40ml）和2块1.2%琼脂 糖凝胶（0.48g/40ml）。 （注：全班制备4块胶）
实验目的
1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立； 2、了解影响酶切的因素； 3、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立； 4、了解影响连接反应的因素。
Arber W. Smith H.O. Nathans D.
第一个DNA重组分子
1972年Paul Berg等人利用限制性内切酶EcoRI和 连接酶获得了第一个DNA重组分子。标志着遗传工 程的开始。
Paul Berg The Nobel Prize in Chemistry 1980
通过DNA重组技术构建DNA重组子
酶切 连接
实 验 原 理 – 酶切
限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特 殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。
限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识 别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切 割双链DNA。
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切 核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制 异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无 损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种 切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶 。
质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图
质粒DNA的带型分析
M pUC19
环形质粒DNA 超螺旋粒DNA
出现问题
电泳条带浓度和纯度 电泳条带拖尾现象（加样过多，离子浓度，
胶未完全凝固） 质粒DNA的带型分析
实验六 DNA的酶切、连接及电泳检
测
实验步骤
（一）质粒DNA酶切(注：每人一管）
在200μl 的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：μl） ↓