TUNEL染色
Tunel染色步骤
Tunel染色步骤染色是生物学实验中常用的一种技术手段，它可以标记和可视化细胞或组织中的特定分子或结构。
TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）染色技术是一种常用于检测细胞凋亡的方法。
以下是TUNEL染色的步骤：准备工作：1.去离子水：除去离子，避免离子干扰反应。
2. 去氧核酸酶（DNase）的酶标：新鲜制备，如购买的DNase酶标已开封或保存时间较长，需要用氧化热焓（将无水乙酸用过氧化氢气化后灭菌）处理一晚才可以使用。
步骤一：样本固定1.取细胞或组织样本，放入离子缺失的缓冲液中，使其完全被液体覆盖。
2. 加入4%的 paraformaldehyde（或其他细胞或组织固定液），室温下固定10-15分钟。
3.将样本漂洗3次，每次10分钟，使用冷PBS漂洗。
4.用细胞色素染色法染色检测固定细胞总蛋白质。
步骤二：处理样本1. 将细胞或组织样本渗透处理：将固定的细胞或组织置于PBS中含有0.5% Triton X-100（或0.1-0.2%的Bis-vinylsulfonyl] ethane等亲水试剂）的溶液中，室温下渗透30分钟。
2.将样本漂洗3次，每次10分钟，使用冷PBS漂洗。
3. 用DNase酶标法探测样本中DNA裂解。
步骤三：TUNEL反应1.取TUNEL反应液，根据实验需要，在冷冻时保持在冰上。
2.用比色皿将样本恢复到PBS中，将足量的TUNEL反应液加入标本中，使标本完全浸润，尽量避免气泡。
3.在37℃下孵育1-2小时。
步骤四：反应终止1.将标本移至冷藏，室温下用PBS漂洗3次，每次10分钟。
2.用缓冲液漂洗标本3次，每次10分钟。
步骤五：可视化与分析1.在镜下放置标本。
2.加入螢光抑制剂或DAPI等染料，使用荧光显微镜检测标本。
总结：TUNEL染色技术是一项用于检测细胞凋亡的重要方法。
它通过检测DNA的断裂末端来间接检测细胞凋亡。
整个TUNEL染色过程包括样本固定、样本处理、TUNEL反应、反应终止和可视化与分析等步骤。
TUNEL染色
TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡实验原理和方法原理：细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。
然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。
DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。
实验方法TUNEL检测对于贴壁细胞或细胞涂片a. PBS或HBSS洗涤一次。
b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。
c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。
d. 用PBS或HBSS洗涤一次。
e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。
f. 转步骤5。
TUNEL检测对于悬浮细胞或细胞悬液a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。
b. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。
为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。
c. 用PBS或HBSS洗涤一次。
d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。
e. 转步骤5。
TUNEL检测对于石蜡切片a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。
换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。
无水乙醇5分钟。
90%乙醇2分钟。
tunel 染色原理
tunel 染色原理
隧道染色原理是一种用来观察细胞结构和功能的重要技术。
它基于荧光染料的特性，在细胞内部或细胞表面标记特定的分子或结构，以便研究者可以通过显微镜观察其位置和行为。
在隧道染色原理中，首先需要选择合适的荧光染料。
这些染料通常具有特定的光谱特性，可以发射出明亮的荧光信号，以便在显微镜下进行观察。
常用的荧光染料有荧光素、罗丹明和荧光蛋白等。
接下来，需要将荧光染料引入细胞内或细胞表面。
这可以通过多种方法实现，如细胞渗透、细胞转染或直接染色等。
不同的方法适用于不同类型的细胞和研究目的。
染色后的细胞可以通过荧光显微镜观察。
荧光显微镜配备了特殊的滤光片，可以选择性地捕捉特定波长的荧光信号。
这样，就可以将荧光信号与细胞结构或分子相对应，从而确定它们的位置和行为。
隧道染色原理在生物学研究中应用广泛。
例如，在细胞生物学中，研究者可以使用隧道染色技术来观察细胞器的分布和动态变化。
在分子生物学中，隧道染色可以用来标记特定的蛋白质或核酸序列，以研究它们在细胞内的功能和相互作用。
隧道染色原理是一种重要的技术，可以帮助研究者观察和理解细胞的结构和功能。
通过选择合适的荧光染料，并结合荧光显微镜的使用，隧道染色技术为生物学研究提供了强大的工具。
随着技术的不
断发展，相信隧道染色原理将在未来的研究中发挥越来越重要的作用。
TUNEL染色
TUNEL染⾊相关疾病：产品名称：罗⽒(Roche)公司Tunel试剂盒英⽂名称：Tunel产品货号：11684817910产品规格：50T试剂级别：试剂级产品产地：USA产品商标：RocheIn situ cell death detection kit-POD法⼀、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是⽤来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作⽤下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3‘-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者⼜与HRP底物⼆氨基联苯胺（DAB）反应产⽣很强的颜⾊反应（呈深棕⾊），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因⽽在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞⼏乎没有DNA断裂，因⽽没有3?-OH形成，很少能够被染⾊。
本试剂盒适⽤于组织样本（⽯蜡包埋、冰冻和超薄切⽚）和细胞样本（细胞涂⽚）在单细胞⽔平上的凋亡原位检测。
还可应⽤于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双⾊法确定细胞死亡类型和分化阶段。
⼆、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、⼩型染⾊缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻⽚或封⼝膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；⾃备试剂：PBS、双蒸⽔、⼆甲苯、梯度⼄醇（100、95、90、80、70%）、DAB⼯作液（临⽤前配制，5 µl 20×DAB+1µL 30%H2O2+94 µl PBS）、Proteinase K⼯作液（10-20µg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临⽤前配制）、苏⽊素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
TUNEL 凋亡染色-罗氏公司
TUNEL 凋亡染色
参照罗氏公司的TUNEL凋亡试剂盒说明书进行并适当改进
1、石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；
2、蒸馏水缓慢冲洗后室温下干燥；
3、切片置于250ml柠檬酸（0.1M，pH6.0，10.505g C6H8O7.H2O+500ml H2O）中微波加热至沸腾，静置5min后加入100ml ddH2O；
4、15min后取出切片，标本上滴上10%山羊血清（0.5%BSA），于37°C封闭15min（室温封闭45min）；
5、TUNEL试剂1和试剂2按照1:9比例充分混匀，离心，滴加至标本（试剂覆盖组织即可），37°C孵育1h；
6、PBS清洗3次，每次10min，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜摄像。
（5、6需避光操作）
7、去掉盖玻片，PBS清洗3次，每次5min；
8、滴加POD至标本，37°C孵育30min；
9、PBS清洗3次，每次5min，DAB显色；
10、苏木素复染，光学显微镜摄像。
凋亡指数（AI）计算：采用IPP随机选取5个高倍（X400）视野，计数至少1000个细胞，阳性细胞占细胞总数的百分比即为AI。
数据采用均数+/-标准差表示，采用SPSS17.0统计软件，多个样本均数比较采用ANVOA分析，以SNK-q检验进行均数间多重比较，以p<0.05有差异统计学意义。
Tunel染色实验-检测细胞凋亡
Tunel染色操作流程及步骤：实验准备：1、固定溶液：4%的聚甲醛。
2、封闭溶液：3%H2O2的甲醇溶液，共计4ml。
其中30%H2O2 ：甲醇为1:9即：400ul30%H2O2+3.6ml甲醇。
3、透化溶液：0.1g柠檬酸+100mlddH2O+100ulTriston[1]。
实验步骤：1、磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次每次5min[2-3]。
2、固定溶液：4%的聚甲醛固定1h[3-5]。
3：PBS洗4次每次7min[3]。
以下步骤全部避光:4、在15-25℃下与封闭溶液200ul孵育10min[3,6]。
5、PBS洗4次每次7min[3]。
6、透化溶液5min（4℃摇床）。
7、PBS洗4次每次7min[3]。
8、tunel溶液配制瓶1：瓶2=1:9（遮光），每孔加200mltunel混合物孵育60min[3,7] 。
8、PBS洗4次每次7min[3]。
9、加DAPI 200ml 15min[3,8]10、PBS洗4次每次7min[3]。
11、荧光显微镜拍片。
待学习…心得体会及注意事项：1、因柠檬酸量太少直接配制所需溶液量误差较大所以配制100ml体系。
2、洗去培养液。
3、加完液后放在摇床上。
4、每孔加200ul4%的聚甲醛。
5、为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。
6、封闭细胞内的氧化酶。
7、染凋亡细胞的DNA。
8、DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，能够与DNA强力结合的荧光染料，用于荧光显微镜对比观测。
所有细胞DNA均可染色。
目的及原理目的：检测细胞凋亡原理：TUNLE染色即原位末端转移酶标记技术。
凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3′-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3′末端，从而进行凋亡细胞的检测。
细胞tunel染色步骤
细胞tunel染色步骤细胞 Tunnel 染色步骤细胞Tunnel 染色是一种常用的细胞凋亡检测方法，通过染色分析可以定量评估细胞凋亡的程度。
本文将介绍细胞Tunnel 染色的步骤。
1. 固定细胞需要将待检测的细胞固定在载玻片上。
固定可使用4%的无水乙醇或4%的甲醛进行，固定时间一般为10-30分钟。
2. 透化细胞固定后的细胞需要进行透化处理，以便Tunnel 酶能够进入细胞内部。
透化可使用0.1%的Triton X-100进行，透化时间一般为5-10分钟。
3. 准备 TUNEL 反应液TUNEL 反应液是细胞Tunnel 染色的核心。
一般来说，TUNEL 反应液包含 Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 酶和标记有荧光或酶的dUTP。
根据实验需求，可以选择不同的标记物，如荧光染料FITC、Rhodamine 或者酶标记物如辣根过氧化物酶（HRP）。
4. 进行 TUNEL 反应将TUNEL 反应液加到透化后的细胞上，尽量覆盖整个玻片表面。
然后，将玻片置于湿度高的环境中，如湿箱或湿化瓶中，温度为37°C。
反应时间一般为1-2小时。
5. 停止反应反应结束后，需要停止TUNEL 反应，以保证结果的准确性。
停止反应可使用缓冲液，如PBS缓冲液或甘氨酸缓冲液，反应时间一般为10分钟。
6. 染色在停止反应后，需要对细胞进行染色，以便观察和分析。
染色可使用荧光显微镜或透射电子显微镜进行观察。
如果使用荧光显微镜，可以直接观察细胞的荧光信号。
如果使用透射电子显微镜，需要进行金粒子染色，将金粒子标记的抗体与TUNEL 反应产物结合，形成可见的电子密度。
7. 细胞计数和分析对染色后的细胞进行计数和分析。
可以使用图像处理软件对细胞进行定量分析，评估细胞凋亡的程度。
可以通过测量染色阳性细胞的数量，计算细胞凋亡指数（Apoptosis Index）。
细胞Tunnel 染色是一种简单而有效的细胞凋亡检测方法，可以广泛应用于生物医学研究中。
tunel染色 作用
tunel染色作用Tunel染色的作用什么是Tunel染色？Tunel染色是一种常用的细胞和组织样本检测方法，用于检测细胞凋亡的发生与程度。
Tunel是”Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling”的缩写，即末端脱氧核苷酸转移酶-去氧尿嘧啶核苷酸末端标记法。
这种染色技术通过标记DNA断裂末端的dUTP来检测细胞凋亡。
Tunel染色的原理Tunel染色的原理基于细胞凋亡时DNA断裂的现象。
在细胞凋亡发生时，DNA会断裂并形成自由的断裂末端。
Tunel染色利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在这些断裂末端上加入标记的dUTP。
通过连接这些标记的dUTP，我们可以利用荧光或颜色物质的发射来显示细胞凋亡的发生和程度。
Tunel染色的应用Tunel染色在生物医学领域中具有广泛的应用。
以下是一些Tunel 染色的主要应用：•细胞凋亡研究：Tunel染色可以帮助科学家们研究各种生理和病理条件下细胞凋亡的发生机制、调控因子以及凋亡信号通路。
•药物研发：许多抗癌药物通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤生长。
Tunel染色可以评估药物对细胞的作用，并帮助科学家们筛选和优化药物候选物。
•疾病诊断：凋亡在许多疾病的发展中起着重要作用。
Tunel染色可以用于检测和诊断与细胞凋亡相关的疾病，如癌症、神经系统疾病和心血管疾病等。
Tunel染色的优点Tunel染色作为一种检测细胞凋亡的方法，具有以下几点优点：•高灵敏度：Tunel染色能够检测到细胞凋亡的微弱信号，可以提供准确的凋亡检测结果。
•易于操作：相比其他凋亡检测方法，Tunel染色的操作相对简单且迅速，可广泛应用于实验室和临床领域。
•可定量化：Tunel染色结果可以通过计算染色阳性细胞百分比或强度来量化细胞凋亡的程度，提供定量化的数据支持。
•多重应用：Tunel染色可以与其他染色方法相结合，如免疫组化染色、细胞形态学分析等，扩展其应用领域。
tunel 染色原理
tunel 染色原理
引言概述：
Tunel染色是一种常用的细胞学技术，用于检测细胞凋亡。
通过检测DNA断裂末端的3'-OH基团，Tunel染色可以准确地识别凋亡细胞，并在细胞核内形成明亮的荧光信号。
本文将详细介绍Tunel染色的原理，包括染色步骤、染色反应的机理、染色结果的解读以及其在研究中的应用。
正文内容：
1. Tunel染色的步骤
1.1 细胞固定和透化
1.2 凋亡诱导
1.3 染色反应
1.4 洗涤和封片
1.5 观察和分析
2. Tunel染色的机理
2.1 DNA断裂
2.2 TdT酶介导的标记
2.3 荧光探针的结合
2.4 染色信号的放大
2.5 荧光显微镜观察
3. Tunel染色结果的解读
3.1 正常细胞
3.2 凋亡细胞
3.3 背景噪声
3.4 阳性对照和阴性对照
3.5 图像分析和数据统计
4. Tunel染色在研究中的应用
4.1 细胞凋亡机制研究
4.2 肿瘤治疗效果评估
4.3 神经退行性疾病研究
4.4 肝脏损伤评估
4.5 胚胎发育研究
总结：
Tunel染色是一种可靠而广泛应用的细胞学技术，通过检测细胞凋亡的DNA断裂末端，可以准确地识别凋亡细胞。
在实验中，正确的染色步骤和机理的理解对于获得准确的结果至关重要。
Tunel染色在细胞凋亡机制研究、肿瘤治疗效果评估、神经退行性疾病研究、肝脏损伤评估以及胚胎发育研究等领域都具有重要的应用价值。
通过深入了解和熟练掌握Tunel染色的原理和操作技巧，我们可以更好地应用这一技术来推动相关领域的研究进展。
tunel和dapi染色原理
TUNEL 和 DAPI 染色原理近年来，细胞生物学和病理学领域的研究对于细胞凋亡和核酸染色方法的需求逐渐增加。
TUNEL 和 DAPI 染色方法作为常用的细胞学染色技术，被广泛运用于细胞凋亡和核酸检测方面。
下面将对 TUNEL 和DAPI 染色原理进行详细介绍。
TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling）染色原理：1. TUNEL 染色原理概述TUNEL 技术是一种用于检测细胞凋亡的方法。
在细胞凋亡过程中，DNA 断裂是一个重要的特征。
TUNEL 技术利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在 DNA 断裂端引入标记的 dUTP 的原理，通过检测 DNA 断裂端的标记来识别凋亡细胞。
2. TUNEL 染色方法步骤（1）取样处理：将样本固定和包埋后，进行脱水和脱脂等处理。
（2）蛋白酶预处理：利用蛋白酶处理打开细胞核膜，提高核酸的透过性。
（3）TUNEL 反应：在 TdT 的作用下，未修饰的末端脱氧核苷酸与荧光素化的 dUTP 形成共价结合。
（4）显微镜观察：使用荧光显微镜观察并拍摄图像。
3. TUNEL 染色原理应用TUNEL 染色方法被广泛应用于许多领域，如肿瘤研究、病理学、药理学等。
通过检测细胞中凋亡的程度，可以对生物样品进行定量和定性分析。
DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）染色原理：1. DAPI 染色原理概述DAPI 是一种结合到 DNA 的蓝色荧光染料，具有高度亲和力和高度特异性。
DAPI 与 DNA 结合后在核型显微镜下会呈现出亮蓝色的荧光。
2. DAPI 染色方法步骤（1）细胞固定：利用适当的方式将细胞固定在载玻片上。
（2）DAPI 染色液：将含有 DAPI 的染色液滴在载玻片上，让细胞充分吸收。
（3）显微镜观察：利用蓝光激发荧光显微镜观察并拍摄图像。
3. DAPI 染色原理应用DAPI 染色方法在细胞学和病理学领域有着广泛的应用。
TUNEL染色.
TUNEL染色检测空肠黏膜细胞凋亡注：染胸腺也是相同方法。
TBS（PH7.5）配置：1L双蒸馏水中加入8.5g NaCl,1.2g Tris和0.45—0.5ml纯乙酸（用NaOH调PH）空肠石蜡切片常规脱蜡入水。
切片常规脱蜡复水：二甲苯I（15min）——二甲苯II（15min）——100%酒精I（10min）——100%酒精II（10min）——95%酒精（5min）——85%酒精（5min）——75%酒精（5min）——蒸馏水（5min）（1）新鲜配置3%H2O2,室温处理10分钟。
蒸馏水洗涤2分钟/3次。
容器：小烧杯即可（2）标本片加0.01M TBS1：200新鲜稀释Proteinase K37℃消化1—15分钟（10min），0.01M TBS洗2分钟/3次。
注：用EP管盛装（500μl左右）：取1μl或2μl Proteinase K，用0.01M TBS200倍稀释；（3）标本片加标记缓冲液（Labeling Buffer）20μl/片，以保持切片湿润。
按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl，加入18μl标记缓冲液中，混匀。
甩去切片上多余液体后加标记液，20μl/片。
置样品于湿盒中，37℃标记2小时。
注（用小EP管，准备两个）：8（样品）+0（阳性对照），8*（1+1+18）=160=8+8+1444（阴性对照）0.01M TBS，4*（2+18）=80=8+72（4）0.01M TBS洗2分钟/3次。
（5）加封闭液50μl/片，室温30分钟，甩掉封闭液，不洗。
（6）用抗体稀释液1：100稀释生物素化抗地高辛抗体：（取1ml 抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μl），混匀后50μl/片加至标本片上。
置样品于湿盒中，37℃反应30分钟。
0.01M TBS洗2分钟/3次。
地高辛抗体：10μl（总共20μl）；抗体稀释液：1ml；用EP管盛装（600μl左右）：（6+1+4）*50=550μl（7）用抗体稀释液1：100稀释SABC:取1ml抗体稀释液加SABC 10μl，混匀后50μl/片加至切片。
tunel白光染色流程
tunel白光染色流程1.取组织切片，固定。
Take the tissue slices and fix them.2.脱水。
Dehydrate.3.清洁。
Clean.4.染色，使之可视化。
Stain to make it visible.5.加入透明剂。
Add the clearing agent.6.进行包埋。
Embedding.7.制备切片。
Prepare slices.8.干燥。
Dry.9.固定在载玻片上。
Fix on the slide.10.进行脱脂。
Remove fat.11.放入脱水剂中。
Place it in the dehydrating agent.12.沉积暴露在化学溶液中。
Deposition exposed to chemical solution.13.用染料染色。
Stain with dye.14.添加白光增强剂。
Add white light enhancer.15.挂片干燥。
Dry the slices.16.使用显微镜检查。
Examine under a microscope.17.拍照记录。
Take photos.18.检查结果。
Check the results.19.重复必要步骤。
Repeat necessary steps. 20.分析数据。
Analyze the data.21.进行结果比较。
Compare the results. 22.研究结论。
Study the conclusion. 23.品质检验。
Quality check.24.阅读文献。
Read literature.25.协作讨论。
Collaborate and discuss.26.改进方法。
Improve methods.27.找出问题。
Identify issues.28.对比不同实验条件。
Compare different experimental conditions.29.检测效果。
TUNEL染色
TUNEL染色检测空肠黏膜细胞凋亡注：染胸腺也是相同方法。
TBS（PH7.5）配置：1L双蒸馏水中加入8.5 g NaCl,1.2g Tris 和0.45—0.5ml纯乙酸（用NaOH调PH）空肠石蜡切片常规脱蜡入水。
切片常规脱蜡复水：二甲苯I（15min）——二甲苯II（15min）——100%酒精I（10min）——100%酒精II（10min）——95%酒精（5min）——85%酒精（5min）——75%酒精（5min）——蒸馏水（5min）（1）新鲜配置3%H2O2,室温处理10分钟。
蒸馏水洗涤2分钟/3次。
容器：小烧杯即可（2）标本片加0.01M TBS 1：200新鲜稀释Proteinase K 37℃消化1—15分钟（10min），0.01M TBS洗2分钟/3次。
注：用EP管盛装（500μl左右）：取1μl或2μlProteinase K，用0.01M TBS 200倍稀释；（3）标本片加标记缓冲液（Labeling Buffer）20 μl/片，以保持切片湿润。
按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1 μl，加入18 μl标记缓冲液中，混匀。
甩去切片上多余液体后加标记液，20 μl/片。
置样品于湿盒中，37℃标记2小时。
注（用小EP管，准备两个）：8（样品）+0（阳性对照），8*（1+1+18）=160=8+8+1444（阴性对照）0.01M TBS，4*（2+18）=80=8+72（4）0.01M TBS洗2分钟/3次。
（5）加封闭液50 μl/片，室温30分钟，甩掉封闭液，不洗。
（6）用抗体稀释液1：100稀释生物素化抗地高辛抗体：（取1 ml 抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10 μl），混匀后50 μl/片加至标本片上。
置样品于湿盒中，37 ℃反应30分钟。
0.01M TBS洗2分钟/3次。
地高辛抗体：10μl（总共20μl）；抗体稀释液：1ml；用EP管盛装（600μl左右）：（6+1+4）*50=550μl（7）用抗体稀释液1：100稀释SABC:取1ml抗体稀释液加SABC 10 μl，混匀后50 μl/片加至切片。
TUNEL染色方法
U /100µl
1000 U-2000 U 2000 U-3000 U 3000 U-5000 U
DNaseⅠ(50 U/µl) 用量
20μl-40μl
40μl-60μl
60μl-100μl
DNaseⅠBuffer 用量
80μl-60μl
60μl-40μl
40μl-0μl
9. 在一张样本上滴加 100µl 上述配制好的 DNaseⅠ反应液，室温～37℃处理 10～30min，
Streptavidin-HRP，即用即配，注意避光；
15. 样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加 50µl Streptavidin-HRP 工作液，加盖玻片放入温盒中，37℃
避光反应 30min；
16. 反应后的样本片浸入 1×PBS 漂洗三次，每次 5min;
17. 配制 DAB 工作液: 计算好样本数量集中配制， 每个样本样本用量为：50 µl dH2O 加入 2.5µl DAB -A
一、TUNEL 检测原理
凯基快速型 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核 DNA 的断裂情况， 其原理是生物 素（Biotin）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的 3′-OH 末端，并可与连接辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨 基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微 镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂，因而没有 3′-OH 形成，很少能 够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片或爬片）的凋亡原位检 测。
tunel染色原理
tunel染色原理Tunel染色原理（ TUNEL技术，简称TUNEL），又称多核苷酸链断裂检测（Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick-end Labeling）技术，是一种定量的检测细胞凋亡的一种重要的技术，它可以检测细胞凋亡的碱基链断裂，主要应用于细胞学及免疫学研究和药物筛选。
TUNEL技术基本原理是采用编码表观遗传信号的DNA用作靶点来定量检测细胞凋亡。
这种技术采用了核苷酸链断裂的去脱基转移反应技术，利用了终端脱氧核苷酸去脱基反应酶（Terminal deoxynucleotidyltransferase， TdT）的特殊功能，将有机染料缀合到DNA上，从而检测出细胞凋亡。
TUNEL技术的过程是这样的：首先，样品中所有细胞形态被固定，然后将其渗染成开放链状；然后，细胞核内DNA以3\ '-OH端作为反应位点，利用免疫化学方法将TdT这种特定核酸酶配以可溶性二聚体DNA-聚变素；之后，将缀有聚变素的TdT添加到细胞核；当添加了可连接少数脱氧基团的含有模板的dNTP（嵌入式的核苷酸缩写）（如dUTP）后，TdT会在每个DNA断链的3' -OH羧基端，捕获并将dNTP扩展到DNA的另一个头部，而这种dNTP又有能够与特定染色剂结合的基团；最后，经由流式细胞仪技术和对比染色，检测渗染得到特定染料缀合在核苷酸链缝合端的细胞，就可以检测出细胞凋亡。
TUNEL技术不但可以用来检测细胞死亡，还可以用来确定细胞凋亡途径及其分子机制，从而定位相应的药物作用点，是药物筛选中不可或缺的重要技术和工具。
TUNEL技术也可以用作细胞自噬的检测工具，其特殊的装置体系，可以检测不同类型的细胞自噬事件，其真实性、灵敏性等指标有一定的改善。
tunel染色步骤
tunel染色步骤Tunnel染色步骤随着科技的不断发展，计算机网络已经成为人们生活中不可或缺的一部分。
而在网络通信中，Tunnel（隧道）技术的应用日益广泛。
Tunnel染色步骤是在网络通信中对Tunnel进行染色的过程，本文将从准备工作、染色步骤和染色结果三个方面，详细介绍Tunnel染色步骤。
一、准备工作在进行Tunnel染色之前，首先需要做好一些准备工作。
具体步骤如下：1. 确定Tunnel的类型：根据网络的需求，确定Tunnel的类型，比如MPLS（多协议标签交换）Tunnel、GRE（通用路由封装）Tunnel等。
2. 配置Tunnel端点：根据Tunnel类型的不同，配置相应的Tunnel端点。
例如，对于MPLS Tunnel，需要配置源和目的的LSP（标签交换路径）。
3. 确定染色规则：根据网络的需求，确定Tunnel染色的规则。
染色规则可以是基于源IP地址、目的IP地址、源端口、目的端口等。
二、染色步骤在准备工作完成后，就可以开始进行Tunnel染色的步骤了。
具体步骤如下：1. 配置染色策略：根据染色规则，配置相应的染色策略。
染色策略可以是基于ACL（访问控制列表）、路由映射、QoS（服务质量）等。
2. 应用染色策略：将配置好的染色策略应用到Tunnel上。
这样，Tunnel就会根据染色策略对经过它的数据包进行染色。
3. 检查染色结果：通过查看染色结果，验证染色是否成功。
可以通过抓包工具等方式来查看数据包的染色信息，确保染色规则按预期生效。
三、染色结果经过上述步骤，Tunnel染色完成后，就可以得到染色结果。
染色结果是Tunnel染色的最终效果，用于指导网络通信。
具体内容如下：1. 染色标记：染色结果中包含了对数据包进行染色的标记信息。
这些标记信息可以是特定的标签、头部字段等，用于标识染色规则。
2. 染色路径：染色结果还包括了Tunnel染色路径的信息。
染色路径指的是数据包经过的Tunnel路径，可以是单一路径，也可以是多条路径。
tunel染色方法
tunel染色方法图涅尔染色法：神经组织的神秘探索图涅尔染色法是一种先进的神经组织染色技术，为神经科学研究打开了一扇新窗口。
通过可视化神经元的复杂结构，它使科学家能够深入了解大脑的内在运作。
原理及机制图涅尔染色法的基础是甲苯胺蓝（TB）和高锰酸钾（KMnO4）的反应。
TB是一种阳离子染料，而KMnO4是一种氧化剂。
当这两种物质结合时，它们会产生一种不溶性的蓝色化合物。
神经元对图涅尔染色法具有特殊的亲和力，因为它们的细胞膜富含阴离子成分。
这些阴离子成分与TB阳离子相互作用，允许染料渗入神经元并与内膜结合。
染色步骤图涅尔染色法的过程涉及以下步骤：1. 固定：将组织固定在甲醛中以保持其结构。
2. 脱水：将组织通过一系列梯度乙醇进行脱水以去除水分。
3. 甲苯胺蓝染色：将组织浸泡在甲苯胺蓝溶液中，让染料渗透入神经元。
4. 高锰酸钾染色：将组织转移到高锰酸钾溶液中，使其与甲苯胺蓝反应形成蓝色化合物。
5. 分化：使用乙醇和二甲苯溶液洗涤组织以去除多余的染料。
6. 透明：将组织浸泡在二甲苯中使其透明，以便在显微镜下观察。
应用及重要性图涅尔染色法在神经科学研究中有着广泛的应用，包括：神经元形态学研究：可视化神经元的突触、树突和轴突，揭示神经网络的复杂性。
神经退行性疾病研究：识别和表征阿兹海默症、帕金森症等神经退行性疾病中的病变。
神经发育研究：追踪神经元的形成和成熟，了解大脑发育的机制。
神经可塑性研究：研究学习和记忆过程中神经网络的变化。
图涅尔染色法的独特之处在于它能够提供神经元的高对比度图像，突出显示其形态特征，同时保持组织的整体性。
这使得它成为神经科学研究中一个极其有价值的工具。
局限性尽管图涅尔染色法功能强大，但也有一些局限性：选择性：该方法对神经元具有特殊亲和力，但可能会错过神经胶质细胞和其他神经系统细胞。
灵敏度：它可能无法检测到非常细小的神经元或突触，导致可能低估神经网络的复杂性。
时间消耗：染色过程需要数小时到数天，这对于某些研究流程来说可能不切实际。
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相关疾病：•脱水产品名称：罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒英文名称：Tunel产品货号：11684817910产品规格：50T试剂级别：试剂级产品产地：USA产品商标：RocheIn situ cell death detection kit-POD法一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
三、实验步骤操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。
具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）或者加细胞通透液8min；5. PBS 漂洗2次；6. 制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。
7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。
8. PBS漂洗3次；9. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；10. 玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
11. PBS漂洗3次；12. 在组织处加50~100μlDAB底物，反应15~25℃×10min；13. PBS漂洗3次；14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。
梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
15. 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。
可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）对于培养细胞的预处理：①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸（见备注4），干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4℃保存；②适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛（见备注2）中固定25min；④PBS 浸洗二次，每次5min；⑤将吸附细胞的载玻片在0.2%的Triton X-100（见备注5）中处理5min；⑥PBS浸洗二次，每次5min；后续操作如同石蜡包埋切片的6—15四、注意事项1. 进行PBS 清洗时，每次清洗5 min。
2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。
3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
4. TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。
不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。
5. 如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。
6. 用甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴比妥PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。
然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。
如果此时使用80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。
7. 荧光素标记的dUTP液含甲次*酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。
8. 试剂保存；未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解冻，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 m内稳定，避免再次冻存；TUNEL 反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。
9. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DN**断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。
可以选择使用Biotium公司的Tunel试剂盒，是荧光法的效果非常的好，价格也有优势，如果有需要可以联系《上海开放生物》-Biotium中国总代理，另外还有生物素标记的dUTP试剂（包括不同连接臂长度的产品），可以为您的实验提供更多的选择性，希望可以帮到您！A、B二液混合，30μl/每片37℃1hPBS洗3×3minStreptavidin-HRP 1:200 37℃30minPBS洗3×3min0.04% DAB+0.03%H2O2显色10min，水洗苏木素衬染1min，水洗蓝化吹干后常规树脂封片观察：凋亡指数（apoptosis inde×，AI）在普通光镜下连续观察10个高倍视野计数阳性细胞数，换祘为平均每平方毫米的凋亡细胞数，即为AI。
其他IRAM: 我在做Tunel检测细胞凋亡，用的是Roche公司的试剂盒，步骤如下：细胞固定（4%多聚甲醛室温40分钟后70%乙醇-20度1小时）--3%H2O2in甲醇室温10分钟--0.1%TritonX-100in0.1%枸橼酸钠4度冰箱冰上通透3分半钟--加入TUNEl反应混合物，37度湿盒90分钟--加入POD，37度湿盒40分钟--加入DAB100微升，室温10分钟--苏木素2分钟。
其间每步均用PBS洗涤3次，共5分钟。
我做了两次，但效果均步理想，好象没有看到有细胞核被染成黄色的凋亡细胞（我的细胞应该是有凋亡的），因为试剂有限未做阳性对照，阴性对照结果与实验组无明显差距，实在不知道是怎么回事。
是我的试剂没有配对还是染色出了问题？Nevin: 因为我也在用tunel检测细胞的淍亡，看了你的步骤后，提几点意见：1、“3%H2O2in甲醇室温10分钟”的方法好像有点问题，我认为H2O2的浓度偏高，有两种选择：A，0.3%H2O2in甲醇；或B，3%H2O2。
请注意浓度的变化。
因为H2O2会减弱TdT 的活性，可致假阴性。
2、加入TUNEl反应液，要新鲜配制，后放置冰浴中备用。
这也是tunel成功的关键。
3、可以用蛋白酶K消化试试。
totoo: 我的实验是做兔角膜的切片的TUNEL的检测，用的是promega的荧光的试剂盒用FITC标记dUTP反应。
蛋白酶k消化的浓度20ug/ml .10ug/ml.5ug/ml.37度30分钟。
我的正常的角膜应该有阳性的结果，但是没有阳性？midas: 对角膜进行的什么处理？可以先用您盒子做一张已有明确凋亡细胞的阳性对照，如果可以染出来则可以证明您的盒子应该是没有什么问题的。
totoo: 我已经用盒子做一张已有明确凋亡细胞的阳性对照，阳性对照出结果，而我做的角膜片子而不出结果pljgirl：请教各位大侠：有谁做过细胞凋亡的Tunel染色的吗？我用的是博士得得MK1020试剂盒1080元20个反应，可是他们得石蜡阳性片我染的很好，就是细胞片不怎么着色？我做Tunel时，加TDT标记液是37度2小时，之前加蛋白酶K消化30秒，没加Trtrion，因为试剂盒没要求，博士得的试剂盒说细胞涂片连蛋白酶K消化都不用，这些操作步骤合理吗？newfish：我用的是中山的蛋白酶K不是石蜡片采用么？细胞不用吧！做这个实验有几个关键的地方，不能干片固定我们一般用4％多聚甲醛30分钟。
染色时不要只是看试剂盒怎么说，还要一张一张染，在镜下观察看到染上了再终止。
另外你可以用苏木素复染！！DONGHAIJU：我现在正在做细胞凋亡的TUNEL检测，用的是Boehringer mannheim 公司的试剂盒，结果还不错，3600元50次反应，你的实验步骤是如何进行的？可否写下来讨论一下原因？刚开始我的实验也是没有结果，后来改变的实验步骤，结果就出来了，效果也不错。
我的实验步骤大概如下：1、石蜡切片脱蜡至水，2、0.3%H2O2的甲醇液室温作用5分钟，0.01mol/lPBS清洗两次，每次5分钟3、20ug/ml蛋白酶K处理，湿盒内37℃孵育30min，PBS清洗，4、加入TUNEL反应混合液50ul,盖上蜡膜，湿盒内37℃孵育1小时，PBS清洗，5、3%BSA室温作用20min,PBS清洗6、POD转换液50ul,盖上蜡膜，湿盒内37℃孵育30min，PBS清洗7、DAB显色5~10min，自来水冲洗，8、苏木素复染，盐酸酒精分化20s，自来水冲洗20min，9、梯度脱水50%，70%，80%，90%，100%（1），100%（2），2min/次二甲苯透明两次，10min/次，中性树胶封固，镜下观察。