酶学分析技术课件优秀课件

·L·V标
实际保温时间
四、酶促反应进程
酶促反应进程曲线
酶量的测定：
通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确 测定酶量，应使酶浓度（〔E〕）与酶促反应速度成 正比，即〔E〕∝-d〔S〕/dt或〔E〕∝d〔P〕/dt。 能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速 度，即酶促反应初速度。
酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应 速度才能准确代表酶活性。
(四)Km和Vmax的测定
1．Linweaver-Burk作图法,又称为双倒数作图法
1 Km +〔S〕 Km 1
1
—— = ————— = ——— · —— + ———
v Vmax〔S〕 Vmax 〔S〕 Vmax
2．Cornish-Bowden作图法 又称为直线线性作图法。
第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型
酶促反应初速度
酶活性
酶的含量
五、酶促反应底物动力学
中间产物学说：
酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催
化底物反应生成产物。E + S ES → E + P
米-曼氏方程：
Vmax〔S〕 v = —————
〔S〕+ Km
上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度， 〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。
特点： 优点是简单。 缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。
注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以30～60分 钟为宜。
（二）连续监测法
定义：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。
原理：
该方法每隔一定时间（10s～60s）测定一次底物或产 物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图 ，绘制反应速度曲线。
酶活性的测定方法 工具酶 酶偶联测定法 底物浓度测定
一、酶活性的测定方法
按照对酶 促反应时 间的选择 不同
固定时间法 连续监测法
（一）固定时间法
定义：测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量 或产物的增加量。 分类：
终点法：在反应进行到预定时间后要终止反应。
两点法：该方法反应时间的预定是从t1～t2 。
运用公式进行计算。
计算公式:
产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml） 酶单位/升 = —————————×——————————×————————
每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（ml）
分光光度法测定的公式：
（A测定 – A对照）·V总·106 每单位规定的保温时间———
（一）米氏常数的定义
由米-曼氏方程可以导出：
（Vmax-v）〔S〕 Km = ———————
v
当v = 1/2Vmax时，Km =〔S〕。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重 要的应用价值。
（二）Km值的应用 1.鉴定酶的种类
Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与 酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种 类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的 条件下测定其Km值加以鉴定。
表7-1 某些酶的Km值
酶
乳酸脱氢酶 己糖激酶
-半乳糖苷酶 碳酸酐酶 过氧化氢酶 蔗糖酶 糜蛋白酶
底物
Km(mmol/L)
丙酮酸 D-葡萄糖 D-果糖 D-乳糖
H2CO3
H2O2 蔗糖 甘氨酰酪氨酰甘氨酸
0.017 0.05 1.5 4.0 9.0 25 28 108
2.反映酶与底物的亲合力
Km值越大，酶与底物亲合力越小， Km值越小，酶与底物亲合力越大。
内底物的减少量或产物的生成量。
v =-d〔S〕/dt 或 v =d〔P〕/dt。
底物浓度为〔S〕,产物浓度为〔P〕,时间为t，反应速度为v
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的 生成量为好。
二、酶活性单位
定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度 时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标 准。
(三)Vmax的应用
定义 ： Vmax指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。
应用：
Vmax可用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子 酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数/秒。当反 应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的 转化率：
TN =底物转化量（mol/s）/酶量（mol）
2、熟悉酶促反应进程；酶促反应底物动力学；酶学分析在临床诊断上 的应用。
3、了解Km值、Vmax值的应用及Km和Vmax的测定；同工酶测定和 酶活性测定最适条件的选择。
第一节 酶活性测定的基本知识
酶活性的概念 酶活性单位 酶活性单位的计算 酶促反应进程 酶促反应底物动力学
一、酶活性的概念
酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间
➢惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。
➢国际单位 ：1IU指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下， 每分钟转化1mol底物的酶量。单位为IU/L 。
➢Katal单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的
酶量，1Katal=60×106IU。
三、酶活性单位的计算
步骤：
明确测定方法的酶单位定义，按照酶单位 定义确定物质量、体积和时间的单位，
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本章内容概要：
第一节 酶活性测定的基本知识 第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型 第三节 同工酶测定 第四节 酶学分析在临床诊断上的应用 第五节 酶活性测定最适条件的选择
本章教学要求：
1、掌握酶活性的国际单位定义，酶活性浓度的表示方法及酶活性单位 的计算公式；酶活性测定的连续监测法和定时法的概念、区别和结果 的计算方法；酶偶联反应的在酶活性测定和酶法分析代谢物中的应用； 以NAD（P）H为指示系统和色素原底物在酶活性测定中的应用.
3.选择酶的最适底物
Km值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底 物有不同的Km值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物， 使酶促反应容易进行，并节省底物用量。
4.计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 大反应速度的比率
根据米-曼氏方程可以计算
5.设计适宜的底物浓度
酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶 活性，一般要求初速度达到最大速度的90%～95%、底物 消耗率为1%～5%。这样既可以近似地表示酶活性，又不 致于使底物浓度过高而造成浪费。