细胞培养技术 (2)

肿瘤细胞的接触抑制及密度抑 制往往减弱或消失，因此细胞 可向三维空间发展，导致细胞 堆积，并可生长至较高的终末 细胞密度。
(2) 悬浮型
少数细胞在培养时不贴附于支持物上， 而以悬浮状态生长，包括一些取自血、 脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细 胞，以及一些肿瘤细胞。
细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小 的细胞团，胞体为圆形。
细胞传一代以后，细胞群体一般要经过 潜伏期、指数增长期与Байду номын сангаас台期三个阶段。
以贴附型细胞为例说明如下：细胞接种 后呈悬浮状态，在0．5-4 h内贴附于支持 物，进入潜伏期，此期细胞无增殖发生， 原代细胞持续约24-96 h，而肿瘤细胞或 无限传代细胞仅需6-24 h。
随着分裂相细胞的出现并逐渐增多，细 胞群体进入指数增长期，此期又称对数 期，细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最 佳，适于进行实验研究；此期时间长短 因细胞本身特性及接种密度、血清浓度 而不完全相同，一般可持续3-5天。
2％～5％ 的血清
（1）培养基
培养细胞所需营养物质与体内细胞相同， 包括糖、氨基酸、维生素、无机离子、微 量元素等。细胞在体外生存于含各种营养 成分的培养基中。
来自于动物体液和分离组织提取的天然培 养基有血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液 等，但制作过程复杂，批间差异大，已逐 渐被合成培养基取代。
培养基的种类
按其物质状态，分半固体培养基（如软 琼脂培养基）和液体培养基两类，其中 液体培养基（即培养液）使用最为广泛。 目前市场上有多种配制好的细胞培养液 出售，但价格较昂贵。实际工作中多用 市售培养基干粉来配制培养液。
配制培养液时，尚需加一定量的动物血清（胎 牛或小牛血清）。配制时根据添加血清量的多 少，构成作用不同的培养液，用于不同细胞和 不同研究目的。一般情况下需添加10 ％ ～20 ％的血清，以维持细胞较快的生长增殖速度， 称为生长培养液；为维持细胞缓慢生长或不死， 加2 ％ ～5％血清含量即可，称为维持培养液。
原代细胞一经传代后便称为细胞系 （cell line），进入传代期，此期在全 生命期中持续时间最长，细胞增殖旺盛， 并能维持二倍体的核型。一般情况下可 传代10-50次，随后细胞增殖缓慢以至 完全停止，细胞进入衰退期，最后死亡。
肿瘤细胞系可无限增殖而无衰 退期，正常细胞系也可在传代期 末期或衰退期发生自发转化，细 胞获得永生性即永久增殖的能力， 称为无限细胞系或连续细胞系。
3、培养细胞一代的增殖过程
培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或 其它容器，生存空间相对孤立，营养是有 限的。当细胞增殖至一定密度后，则需分 离出一部分细胞接种到其他容器，并及时 更新培养液，否则将影响细胞的继续生存， 这一过程叫传代（passage 或subculture）。
从细胞接种到下一次传代再培养的 一段时间叫一代。需要注意的是细胞培 养一代与细胞倍增（doubling）的概念 是不同的，细胞倍增指的是细胞数增加 一倍。一般地，细胞培养一代的过程中， 细胞可倍增2-6次。
随着细胞数量的逐渐增多，细胞相互接 触汇合成片，因接触抑制及密度抑制细 胞停止分裂繁殖，进入平台期，细胞数 目不再增加，但仍维持一定时间的活力， 此时应及时分离传代，否则细胞将因中 毒而发生改变甚至死亡。悬浮型细胞一 般没有潜伏期，接种并添加新鲜培养液 后即可迅速进入指数增长期。
3. 培养细胞的生存条件
此外为防止污染，培养液中尚需加一定量的抗 生素（多用青霉素100单位/ml和链霉素 100μg/ml）。
常见的培养基：
1、MEM(minimum essential media)
正常贴附型细胞的特点
接触抑制：正常贴附型细胞具有接触抑 制的特性，细胞相互接触后可抑制细胞 的运动，因此细胞不会相互重叠于其上 面生长。
密度抑制：细胞生长、汇合成片后，虽 发生接触抑制，但只要营养充分，仍可 增殖分裂，但当细胞数量达到一定密度 后，由于营养的枯竭和代谢物的影响， 细胞分裂停止，称为密度抑制。
培养细胞需要特定的培养基和 培养设备。培养细胞在培养器皿中 生长，浸浴于培养液，并需要特有 的环境，包括一定的温度、湿度和 气体成分。
培养细胞的生存条件
培养皿 或培养瓶
营养物质糖、
氨基酸、维生 素、无机离子、 微量元素等
温度、湿 度和气体
由CO2恒温孵
育箱提供
生长 培养液
10％～20％
的血清
维持 培养液
细胞培养的工作始于20世纪初目前广泛 应用于生物学、医学的各个领域，并且 是各种细胞工程技术的基础。哈里森 （ Harrison，1907），因此被称为 “组织培养之父”
一、基础理论
（一）培养细胞的类型及其特点 体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，
根据它们是否能贴附在支持物上生长的 特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。
（1）贴附型
大多数培养细胞均为贴附型，它 们必须贴附在支持物表面生长，这类 细胞在体内时各自具有其特殊的形态， 但在体外培养时贴附于支持物后形态 上表现单一化而失去体内原有的某些 特征，多呈上皮样或成纤维细胞样。
培养细胞的类型及其特点
贴附细胞型MRC-5成纤维细胞
培养细胞的类型及其特点
• 贴附型细胞正常猴肾单层上皮细胞
细胞培养技术 cell culture
细胞培养技术
从生物体内取出组织或细胞，在体 外(in vitro)模拟体内生理环境，在无 菌、适当温度和一定营养条件下，对这 些组织或细胞进行孵育培养，使之保持 一定的结构和功能，以便于我们观察研 究，这种方法就是细胞培养（cell culture）。有时细胞培养也称为组织培 养（tissue culture），二者可作为同 义语使用。
其优点是在培养液中生长，生存空间大， 允许长时间生长，便于大量繁殖。
（二）培养细胞的增殖过程
培养细胞的生命期 培养细胞的生命期（life span）指的
是细胞在培养中持续增殖和生长的时间， 一般可分为原代培养期、传代期和衰退 期。从体内取出细胞接种培养到第一次 传代叫原代培养，一般持续1-4周。