细胞培养技术 (2)
第二节细胞培养方法及应用实例
配比
分包
疫苗产品
①原始种子——基因重组病毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细
胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于
亲代的可遗传的子代，称为基因重组。
基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活
病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病
毒株原始种子属于死活病毒间的重组。
世卫组织提供的6支甲 型H1N1流感原始毒株
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
HGPRT 骨髓瘤细胞
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种
融合
(HAT)培养基
亲代细胞的特性，既具有 B淋巴 细胞合成专一抗体的特性，又有
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器
常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反 应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝 状反应器等类型。
2细胞培养及建立泡沫细胞模型
2)实验手段(1)细胞培养及建立泡沫细胞模型将THP-1细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于370C, 5} CO:培养箱静置培养。
该细胞株属人类单核细胞系，在培养液中呈簇集状悬浮生长，倍增时间大约在26 h后。
细胞浓度控制在106/mL，每两天换液一次，每四天传代一次。
细胞复苏后，传至3 }= 5代后方可用于建模。
(2)建立巨噬细胞模型取对数生长期的细胞，分为正常组和模型组，调整细胞浓度为106/mL，接种于6孔培养板，每孔2 mL。
正常组在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中培养。
模型组先置于含160 nmol/L PMA的RPMI 1640基础培养液中培养72 h，贴壁后轻轻吸去上清液，PBS洗3遍，更换10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液，即得巨噬细胞。
巨噬细胞的鉴定己在发表文献中完成。
(3)建立巨噬源性泡沫细胞模型将获得的巨噬细胞更换含3%胎牛血清的RPMI 1640培养液，并加入终浓度为80 mg/L的Ox-LDL，共同孵育48 h，油红。
染色后，镜下观察细胞内充满橘红色脂滴，即得泡沫细胞模型，此过程即为泡沫化。
(4)针对CaSR的si RNA的构建及转染根据公认的si RNA设计原则(Nat Biotech 2004; 22: 326-330)设计针对CaSR的3 条siRNA，选用验证后效果最好的一条。
同时合成阳性对照和阴性对照。
转染试剂选用Invitrogen公司生产的LipofectamineTM RNAiMAX Transfection ReagentosiRNA目标序列的选取原则:工从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找‘`AA'’二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。
注意:GC含量在4_5 070-_5 _5%左右的siRNA 要比那些GC含量偏高的更为有效;在设计siRNA时不要针对_5’和3’端的非编码区Cuntranslated regions UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
(完整版)细胞培养技术练习题.doc
细胞培养技术练习题选择题 1.接种工具灭菌常采用（A） A. 灼烧 B. 高压 C.过滤 D.熏蒸2.具有促进愈伤组织生产的物质是（ B ） A. 维生素 PP B. 维生素 B1 C.维生素 B6 D. 甘氨酸3.微量元素母液的配制浓度（ B ） A.10 倍 B.100 倍 C.1mg/ml D.10mg/ml4.配制 10 倍大量元素母液，所需硝酸铵（ C ） mg A.9000 B.3700 C.16500 D.44005.配制 100 倍有机物母液时，所需维生素B1 ( B )mg A.0.4 B.10 C.100 D.0.16.下列哪种不是组织培养常用的维生素（ A ） A. 维生素 B 2 B. 维生素 B 1 C.维生素 B6 D.维生素 C7.下列哪种激素不属于生长素类（ C ） A.IAA B.IBA C.6-BA D.NAA8.下面哪种是MS 培养基大量元素所用药剂（A） A.硫酸镁 B.硫酸亚铁 C. 硫酸锌 D.硫酸铜填空： 1、组织块的分离方法有机械分散法、剪切分离法、消化分离法。
2、目前，较常用的消化试剂有胰蛋白酶、胶原酶、EDTA 消化液。
3、接种培养瓶的细胞数量一般为5× 105-1× 106/ml。
4、培养细胞的污染一般包括微生物污染、细胞交叉污染、化学物质的污染。
5、细胞冻存时DMSO 常用的浓度为10%的浓度。
1. 体外培养的动物细胞其生长方式主要贴壁生长和悬浮生长两种，分别称为贴壁型细胞和悬浮型细胞。
体外培养的动物细胞其生长方式以贴附生长为主。
2. 贴壁生长的体外培养动物细胞，按形态来分，大体分为成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多形细胞型四种类型，最常见的为前两种。
3. 细胞在体外生长时具有一些特点，其中主要是贴附生长、接触抑制和密度依赖性。
4. 培养细胞生命期可分为原代培养期、传代培养期、衰退期三个阶段。
名词解释1、原代培养：原代培养也叫初代培养，是从供体进行细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段。
细胞培养技术
优点：含有丰富的营养物质及 各种细胞生长因子、激素类物 质，渗透压、pH等也与体内环 境相似。 缺点：成分不明确的混合物、 可能会引入污染 、个体差异导 致结果的不一致。
Eagle：常用的是低限量Eagle培养液（ minimum Eagle medium，MEM）及改良Eagle基本培养基 （ basal medium Eagle ，BME）、Dulbecco改良 的Eagle培养基（ Dulbecco‘s modified Eagle medium，DMEM） RPMI1640（Roosevelt Park Institute medium1640）
与细胞培养相反，病毒工作区域最好处
于负压状态，空气经过滤后排出室外。
理想的病毒实验室应有多个房间并有单
独的通气和排污系统。
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（二）设备 1. 超净工作台或生物安全柜 2. 显微镜：倒置显微镜 3. 水浴箱
4. 离心机
5. 培养箱 ：CO2培养箱、普通培养箱
6. 冰箱、冷柜与液氮罐
5. 蛋白质：必不可少的成分，动物血清是蛋白质的 来源
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三、体外细胞生长的基本条件
(三）酸碱度：最适pH为7.0~7.4，细胞能 承受的范围是6.6~7.8。细胞抗酸能力 比抗碱能力好。
(四）气体条件： O2和CO2
(五) 温度：一般最适温度为33℃~37℃， 对高温的抵抗力弱于对低温的抵抗力。
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一、细胞培养的基本设施与条件
细胞培养必需避免细菌和真菌污染，因此 ，细胞培养区域最好处于滤过空气的正压状 态，且该区域内的设备及家具应尽量少放置 ，以利清扫及减少积尘。
细胞培养实验室设计的原则是保证无微 生物污染和不受其他有毒、有害因素的影响 。
细胞培养技术
细胞培养技术一、细胞培养基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境, 在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下, 使期生长繁殖, 并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。
外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可反复取材等优点, 它在临床染色体分析中使用最广泛。
体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化, 成为永久细胞系, 也可直接建成永久细胞系, 永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。
永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特性。
但细胞克隆的细胞系其这一特性可以不明显。
二、细胞培养的环境细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
1.无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。
当细胞放置于体外培养时, 与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力, 一旦被污染或自身代谢物质积累等, 可导致细胞死亡。
因此在进行培养中, 保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等, 是维持细胞生存的基本条件。
2.恒定的温度维持培养细胞旺盛生长, 必须有恒定适宜的温度。
人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃, 偏离这一温度范围, 细胞的正常代谢会受到影响, 甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力较对高温强, 温度上升不超过39℃时, 细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时, 即能受到一定损伤, 但仍有也许恢复；在40-41℃1小时, 细胞会普遍受到损伤, 仅小半数有也许恢复；41-42℃1小时, 细胞受到严重损伤, 大部分细胞死亡, 个别细胞仍有恢复也许；当温度在43℃以上1小时, 细胞所有死亡。
3.气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一, 所需气体重要有氧气和二氧化碳。
氧气参与三羧酸循环, 产生供应细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
细胞培养技术考试试题
细胞培养技术考试试题一、选择题1. 细胞培养的基本步骤是：A. 细胞获取和处理；B. 细胞传代；C. 培养基配置；D. 细胞实验操作答案：ABCD2. 细胞培养的最佳温度范围是：A. 4-10°C；B. 15-25°C；C. 28-37°C；D. 40-50°C答案：C3. 常用的细胞培养基包括：A. DMEM；B. RPMI 1640；C. MEM；D. FBS答案：ABCD4. 细胞分离的方法有：A. 酶消化；B. 机械分离；C. 磁珠分离；D. 筛选分离答案：ABCD5. 细胞培养器具清洗消毒的方法包括：A. 高温蒸汽消毒；B. 紫外线照射消毒；C. 化学消毒；D. 过滤器过滤消毒答案：ABCD二、简答题1. 请简述细胞培养的原理及意义。
细胞培养是将细胞从生物体中分离出来，在无菌条件下通过培养基提供养分和适宜环境，使细胞在体外持续增殖和生长的过程。
细胞培养技术的意义在于：①探究细胞的生理生化特性和功能；②研究生物发育和分化机制；③药物筛选；④生物工程和生物制造的基础；⑤治疗和诊断疾病。
2. 请简述细胞培养的几种常用技术方法。
（1）传代：将细胞从一代细胞培养物中分离出来，移植到新的培养基中，继续培养和传代。
传代通常采用酶消化和机械分离的方法进行。
（2）冻存：将细胞冻存保存，以备后续使用。
常用的冻存方法是将细胞与冻存液混合，缓慢冷却至低温下保存。
（3）细胞分化：通过调控培养条件，使细胞表现出特定的细胞型态和功能。
（4）细胞感染：将病毒或质粒导入细胞，使细胞表达外源蛋白或产生特定生理反应。
3. 请简述细胞培养中常见的细胞污染及预防方法。
常见的细胞污染包括细菌污染、真菌污染和其他细胞污染。
预防细胞污染的方法有：①无菌操作，使用无菌工具和无菌培养基；②定期检测细胞污染，如细菌和真菌检测；③定期更换培养器具和培养基；④定期消毒培养环境。
三、论述题细胞培养在生物科技领域的应用细胞培养技术在生物科技领域起着重要的作用。
细胞培养技术
1 细胞培养技术一、细胞培养的条件和要求1.所有与细胞接触的设备、器材和溶液等，都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染。
目前最可靠和最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。
如：玻璃制品、布类、金属制品：6.8kg20min。
橡胶制品：3.6～4.5kg10min。
培养用液，如Hanks液，水解乳蛋白：3.6～4.5kg10min。
实验中染菌物品和动物尸体等：6.8 kg20min。
试管、吸管等，则可采用干热灭菌；一切不适于加热灭菌的液体，如人工合成培养液、小牛血清、胰蛋白酶等溶液，可采用过滤法除菌。
细胞培养中常用的消毒剂浓度及其使用场合2.必须有足够的营养供应，而绝对不可有有害的物质，包括极微量的有害离子的掺入，为此必须注意器材的清洗和配液用水的质量。
细胞培养中对水的质量要求很高（见水处理）。
3.保证有适量的氧气供应。
细胞代谢需要有空气，否则细胞死亡。
在用培养瓶进行静止培养，或用转瓶进行旋转培养时，只要培养的液体量不超过总容量的30％，通过与液面的空气交换，可以保证细胞有足够的氧气。
当用罐子深层培养时，则必须通气，一般采用含5％CO2的空气，或根据需要将CO2、N2、O2和空气以不同比例混合，过量氧对细胞的生长也不利。
4.需随时清除细胞代谢中产生的有害产物。
细胞在代谢过程中会产生大量代谢废物，如CO2、乳酸、氨、尿素、吲哚等，这些产物对细胞的生存有害，必须及时清除。
在小量培养时，当培养基中酚红指示剂显示黄色，表示已有相当量乳酸产生，要及时更换新鲜的培养基。
在大量培养时，则需随时测定葡萄糖和乳酸等含量，并调节灌流速度，使代谢产物保持在无害水平下。
5.有良好的适于其生存的外界环境，包括温度、pH、渗透压和离子浓度等。
不同的细胞对pH的要求不同，一般来说适于细胞生长的pH在6.8～7.4，过高或过低均不利于细胞生长。
如上所述，细胞在代谢过程中会产生大量乳酸，使培养的pH下降。
为了保持培养液的pH，常在培养液内加入各种缓冲系统，如Na2HPO4/Na2HPO4、NaHCO3/H2CO3（CO2）、Tricineglycine，以及加缓冲剂Hepes液（常用浓度为10～50mol/L）.6.及时分种，保持合适的细胞密度（见细胞传代）二、细胞分离1.人白细胞的分离。
细胞培养技术
三、培养细胞技术
（二）细胞来源 （2） 消化培养法 与组织块培养法区别： A. 用酶制剂处理组织块，除去细胞间
质，使细胞分离，形成细胞悬液； B. 细胞生长方式多为单层。
优点：更易摄取营养、排除代谢产物生长 较快。
缺点：操作繁杂，易污染；消化可能对细 胞有损伤。
精品课件
三、培养细胞技术
（二）细胞来源 2. 细胞系（cell line） 原代培养物开始第一次传代培养后的细
底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白
和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些
带正电荷的糖蛋白的Байду номын сангаас贴壁因子先吸附于底物
上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。
进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功 能基团）
精品课件
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潜伏期
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。
单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体,治疗用单
克隆抗体。
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细胞培养目的和作用
基础研究 (1) 药物作用机理； (2) 基因功能； (3) 疾病发生 机理。
2、生物制药 疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗
等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的
过滤）
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二、培养细胞相关条件
（二）培养用品
（1）培养瓶（25 、75 cm3）
6孔）
培养板（96、48、24、12、
培养皿（各种直径规格）
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二、培养细胞相关条件
（二）培养用品 （2）离心管（15、50 ml） （3）移液管、吸管 （4）冻存管、EP管 （5）试剂瓶等。
细胞培养技术
细胞培养技术细胞培养技术是一种重要的生物技术手段，可用于研究细胞的生理、代谢和分子机制，了解疾病的发病过程，开发新药物和生物制品等。
本文将从细胞培养的基本原理、培养条件、培养方法及其应用等方面来介绍细胞培养技术。
1. 细胞培养的基本原理细胞培养基本上是将有机体的一部分组织或细胞分离出来，放在独立的培养容器（如培养皿、培养瓶）中，以固体、液体或半固体培养基为基础，模拟生物体内的环境，通过提供适当的营养、温度、湿度和气氛等条件，使细胞在体外生长、分化和繁殖，维持其生命活动。
细胞培养的基本原理包括以下几个方面：(1) 提供适当的培养基细胞培养基是细胞培养的重要条件之一，它要求有营养成分的成份、酸碱度、适当的温度和湿度等。
细胞培养基主要分为无血清培养基和含血清培养基两种。
无血清培养基可以避免血清的批次差异，降低了培养过程中的变异性，但无血清培养基更贵，对细胞生长的影响程度更大且对培养稳定性的要求更高。
在实际应用中，血清培养基仍然是最常用的培养基。
(2) 控制氧气供应细胞在生长过程中需要充足的氧气和营养物质供应。
氧气，作为呼吸作用中的最终受体，在细胞生长、异化和化学诱导中，也扮演了重要的角色。
Highmoreet al.（1978）根据细胞所需氧的需求程度将细胞分为三种类型，即耗氧型、耐氧型和厌氧型。
在细胞培养的过程中，要根据不同的需求，合理控制氧气供应，以满足细胞的生长需求。
(3) 提供适当的温度和湿度细胞定植能力、增殖速度和产生生化反应等都受到温度和湿度的影响。
在常温下，细胞生长速度相对较慢，而在适当的温度下，细胞生长速度会加快，并且会增加细胞代谢产生的热量。
湿度是影响细胞生长的另一个重要因素，不适当的湿度会影响培养液中溶液中的渗透压和细胞内液体平衡，导致细胞死亡。
(4) 增加营养和生长分子的供应细胞生长、分化和繁殖与大量的物质变换和反应有关。
给予细胞必需的营养物质和生长分子，能够促进细胞的生长和增殖，并在一定程度上控制细胞的分化和功能表达。
细胞培养技术
细胞培养技术
细胞传代
实验步骤：
1.取出要传代的细胞，在倒置显微镜下观察，细胞生长呈致密单层，则需传代。
2.用移液枪(直接倒掉)移去培养瓶中培养基，用3ml PBS洗涤一次(培养瓶垂直
放置，不要将枪对着细胞附着面次入)。
3.轻摇培养瓶，使PBS流过细胞附着面，用移液枪(直接倒掉)移去PBS。
4.加入1ml胰酶进行消化，1min，镜下观察(可将瓶口45o进行轻拍，镜下观察
细胞呈圆形，有立体感，轻晃瓶体，课件细胞流动)。
5.加入1ml培养基停止消化，吹打壁面(将细胞粘附面进行冲洗)。
6.将细胞悬液移入离心管，1000rpm离心5min(离心时注意配平)，移除上清，
加入3ml培养基吹打均匀(吹打30~40次)。
7.3瓶各加2ml培养液，再各吸1ml细胞悬浮液。
8.倒置显微镜下观察细胞状况(黑色物为气泡)
9.放入温室孵育
细胞冻存
1．取出要冻存的细胞，除去培养基，用3ml的PBS洗一次，加胰酶消化1min，镜下观察(敲打离壁，口斜向上)，加1ml培养基终止消化，离心，去上清。
2．加入1.5ml冻存液(分为纯血清冻存液和无血清冻存液)，将细胞打匀，移入冻存管中。
3．将冻存管放入程序降温盒中，-80o保存。
蛋白质样品制备。
细胞培养技术
（3）微载体：由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球 微载体： 体，附着面大，利于大量繁殖细胞 附着面大， （4）饲细胞（Feeder Cells）：也称滋养细胞，如 饲细胞（ Cells）：也称滋养细胞， ）：也称滋养细胞 用成纤维细胞长成单层后，大剂量射 用成纤维细胞长成单层后， 线照射，细胞失去增殖能力但尚存活 线照射， 并有代谢活动； 并有代谢活动；再将其它细胞接种于 其上。饲细胞的代谢产物利于其它细 其上。 胞生长
五、培养细胞的生存环境
（一）无污染环境
细胞培养环境无毒、无菌是首要条件 细胞培养环境无毒、 人体：皮肤、黏膜；免疫系统；解毒器官 人体：皮肤、黏膜；免疫系统； 肝脏） （肝脏） 体外：保持细胞培养环境无任何污染， 体外：保持细胞培养环境无任何污染，及 时清除代谢物
（二）温度
人和哺乳动物培养细胞标准温度： 人和哺乳动物培养细胞标准温度： 36.5° 36.5°C ± 0.5°C 0.5° 培养细胞对低温的耐受力比其对高温强 ≤39 °C
3. 促生长因子
EGF, FGF, NGF, PDGF, EDGF等 EDGF等 激素：胰岛素——促进细胞利用葡萄 激素：胰岛素——促进细胞利用葡萄 糖和氨基酸 氢考——促进上皮细胞生长 氢考——促进上皮细胞生长
4. 其它物质
基本元素： 基本元素：钾、钠、钙、镁、氮和磷 微量元素：铁、锌、硒等 微量元素：
（四）体外培养细胞生存所需基本物质
1. 糖
六碳糖是主要的能源（葡萄糖、半 六碳糖是主要的能源（葡萄糖、 乳糖） 乳糖）
2. 氨基酸
所有的细胞都需要谷氨酰胺， 所有的细胞都需要谷氨酰胺，其所含的氨 是核酸中嘌呤和嘧啶的来源； 是核酸中嘌呤和嘧啶的来源；其它还有精 氨酸、胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 氨酸、胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨 蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、 酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、 组氨酸、 组氨酸、酪氨酸等 培养细胞也需要维生素，如生物素、叶酸、 培养细胞也需要维生素，如生物素、叶酸、 泛酸、核黄素、硫胺素、 泛酸、核黄素、硫胺素、胭酰胺等
细胞培养技术基本操作步骤
细胞培养
（1）超净台准备：穿好隔离衣，拖鞋后，进入细胞培养室。
带好手套，紫外线消毒30分钟，点
燃酒精灯，烘烤仪器架，将要使用的滴管烘烤大
约四分之三的长度，并配好胶头，放在仪器架上
备用。
（2）细胞复苏：将准备复苏的细胞，快速送入细胞室后，放入37℃的温箱，大约1分钟左右，
至冻存管解冻大约五分之四时取出，进入超净台，开始复苏。
将冻存管中的液体用一号吸管取出放
入准备好的离心管中，放入离心机中离心5分钟
／1000R，弃去上清，用2号吸管放入适量的培
养液用一号吸管充分吹打后分装在培养瓶中，并
用2号吸管注入适量培养基，于细胞培养箱中培
养（松开瓶口）。
（3）细胞换液：用1号吸管吸取液体，紧贴细胞生长的壁吸液，用2号吸管吸取新的培养液。
（4）细胞传代：用1号吸管弃去废液，并用PBS 液冲洗两遍，用枪头取胰酶约800ul入培养瓶,
震荡一分钟左右,当有片状脱离时,用培养液终止
反应,取出离心,后弃去上液,加入新的培养液吹
打充分后,分装.
（5）细胞冻存:如细胞传代,将细胞分离后,加入冻存液,分装到冻存管中(1.5ml),放入冻存室.。
细胞培养技术
原代培养细胞的生命归宿
原代培养期 传代期 衰退期
有限细胞系，无限细胞系 细胞系 cell line 细胞株 cell strain
培养细胞的特性
培养细胞的生长方式 贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实
体瘤细胞 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物
4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长为570 nm）。记录结果，绘制细胞生长曲线
细胞冻存和复苏
细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细 胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、 经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。
冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞 器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞 内形成冰晶。
操作步骤
1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104 细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96 孔培养板每孔容积370微升），37℃、5 ％CO2培养箱中培养一段时间（根据实 验目的决定培养时间）
2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／ 孔）；继续培养3小时。
3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150 微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡 器上振荡10分钟，使结晶物溶解。
细胞冻存器
简易程序：
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系
以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟
温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停
30分钟后，直接投人液氮中。
低温保护剂的应用
在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存 效果。
常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性 保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通 透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内 水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶， 减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
细胞培养技术_第二讲
密度抑制（density inhibition）：培养液 中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养 的枯竭和代谢物的影响，发生密度抑制，导致细 胞分裂停止。
传代细胞可连续传7~10代，细胞形状基本相同， 但随着传代次数增多，细胞逐渐呈老化现象，表现 为:细胞增殖速度明显减慢，胞浆中出现空泡及颗粒 样物质，细胞碎片增多，细胞形态变为扁平，失去 贴壁能力，从培养瓶底脱落。
组织培养细胞生命期
原代培养期 传代期 衰退期
原代培养期
又称初代培养期 （primary culture），从体内取出组织接种培养 到第一次传代阶段，一般持续1～4周。
此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛；细胞形态相似。
细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存 性强。
传代培养期
一般经数小时-几天
过程:
游离:悬浮,胞质回缩, 全部细胞变为圆球形 吸附:贴附底物,一般24小时内贴壁 潜伏期:可有运动活动,基本无增殖, 少见分裂相
初代培养细胞贴附慢，可长达10～24小时或更多；连续细胞系和恶性 细胞系快，10～30分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种 因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底 物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤 维连接素（Fibronectin），又称LETS（Larger External Transformation Substance），细胞表面蛋白（Cell Surface Protein： CSP）等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细 胞膜的表面（如 CSP），有的则来自培养基中的血清（LETS）。近年又从 各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞 生长增殖条件之一。
动物细胞培养的基本技术
使用前半小时先开紫外线灯灭菌，再关灭菌灯启动风机 ，然后进行操作。使用后用75％的酒精擦洗台面。 切记：不要用有机溶剂擦拭挡风玻璃。
恒温培养箱
变通电热恒温培养箱 CO2培养箱
细胞培养总原则
1
2 3 4
无菌无毒害的环境 支持生长增殖的营养 其它类似体内的环境
维持细胞性状
(一) 细胞培养无菌无毒环境
实验室设计合理 常用设施及设备 培养器皿： 透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的 材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中 性硬度玻璃制品。
细胞培养无菌操作基本技术
工作环境及表面的处理 细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理 培养液与培养细胞的处理
单蒸水冲洗3次
121℃高压蒸汽灭菌20min
塑料器材
常用的塑料器材有多孔培养板（4孔、6孔、 12孔、24孔、96孔）、培养皿、培养瓶及吸 头。 重复使用的处理步骤： 自来水刷洗 3％HCl或2％NaOH溶液浸泡过夜 双蒸水冲洗3次
自来水充分冲洗
紫外线直接照射或辐照灭菌
橡皮器材
首次使用： 自来水刷洗 5％ NaOH溶液煮沸15min 4％HCl盐酸煮沸15min 单蒸水冲洗3次 自来水冲洗8次
37℃，饱和湿度，5％CO2
其他设备
酶标仪
二、细胞培养常用器材及处理方法
玻璃器材 塑料器材 橡皮器材 金属器材 其他用品
玻璃器材
常用的玻璃器材有各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养 皿、吸管、离心管。 首次使用：
自来水刷洗 0.1％稀盐酸浸泡过夜 自来水冲洗
重复使用的处理步骤：
自来水刷洗 硫酸－重铬酸钾浸泡过夜 双蒸水冲洗2次 自来水冲洗10次 晾干、包装
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（二）培养细胞的增殖过程
培养细胞的生命期 培养细胞的生命期（life span）指的
是细胞在培养中持续增殖和生长的时间， 一般可分为原代培养期、传代期和衰退 期。从体内取出细胞接种培养到第一次 传代叫原代培养，一般持续1-4周。
2％～5％ 的血清
（1）培养基
培养细胞所需营养物质与体内细胞相同， 包括糖、氨基酸、维生素、无机离子、微 量元素等。细胞在体外生存于含各种营养 成分的培养基中。
来自于动物体液和分离组织提取的天然培 养基有血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液 等，但制作过程复杂，批间差异大，已逐 渐被合成培养基取代。
培养细胞需要特定的培养基和 培养设备。培养细胞在培养器皿中 生长，浸浴于培养液，并需要特有 的环境，包括一定的温度、湿度和 气体成分。
培养细胞的生存条件
培养皿 或培养瓶
营养物质糖、
氨基酸、维生 素、无机离子、 微量元素等
温度、湿 度和气体
由CO2恒温孵
育箱提供
生长 培养液
10％～20％
的血清
维持 培养液
正常贴附型细胞的特点
接触抑制：正常贴附型细胞具有接触抑 制的特性，细胞相互接触后可抑制细胞 的运动，因此细胞不会相互重叠于其上 面生长。
密度抑制：细胞生长、汇合成片后，虽 发生接触抑制，但只要营养充分，仍可 增殖分裂，但当细胞数量达到一定密度 后，由于营养的枯竭和代谢物的影响， 细胞分裂停止，称为密度抑制。
原代细胞一经传代后便称为细胞系 （cell line），进入传代期，此期在全 生命期中持续时间最长，细胞增殖旺盛， 并能维持二倍体的核型。一般情况下可 传代10-50次，随后细胞增殖缓慢以至 完全停止，细胞进入衰退期，最后死亡。
肿瘤细胞系可无限增殖而无衰 退期，正常细胞系也可在传代期 末期或衰退期发生自发转化，细 胞获得永生性即永久增殖的能力， 称为无限细胞系或连续细胞系。
肿瘤细胞的接触抑制及密度抑 制往往减弱或消失，因此细胞 可向三维空间发展，导致细胞 堆积，并可生长至较高的终末 细胞密度。
(2) 悬浮型
少数细胞在培养时不贴附于支持物上， 而以悬浮状态生长，包括一些取自血、 脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细 胞，以及一些肿瘤细胞。
细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小 的细胞团，胞体为圆形。
细胞传一代以后，细胞群体一般要经过 潜伏期、指数增长期与平台期三个阶段。
以贴附型细胞为例说明如下：细胞接种 后呈悬浮状态，在0．5-4 h内贴附于支持 物，进入潜伏期，此期细胞无增殖发生， 原代细胞持续约24-96 h，而肿瘤细胞或 无限传代细胞仅需6-24 h。
随着分裂相细胞的出现并逐渐增多，细 胞群体进入指数增长期，此期又称对数 期，细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最 佳，适于进行实验研究；此期时间长短 因细胞本身特性及接种密度、血清浓度 而不完全相同，一般可持续3-5天。
3、培养细胞一代的增殖过程
培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或 其它容器，生存空间相对孤立，营养是有 限的。当细胞增殖至一定密度后，则需分 离出一部分细胞接种到其他容器，并及时 更新培养液，否则将影响细胞的继续生存， 这一过程叫传代（passage 或subculture）。
从细胞接种到下一次传代再培养的 一段时间叫一代。需要注意的是细胞培 养一代与细胞倍增（doubling）的概念 是不同的，细胞倍增指的是细胞数增加 一倍。一般地，细胞培养一代的过程中， 细胞可倍增2-6次。
此外为防止污染，培养液中尚需加一定量的抗 生素（多用青霉素100单位/ml和链霉素 100μg/ml）。
常见的培养基：
1、MEM(minimum essential media)
细胞培养的工作始于20世纪初目前广泛 应用于生物学、医学的各个领域，并且 是各种细胞工程技术的基础。哈里森 （ Harrison，1907），因此被称为 “组织培养之父”
一、基础理论
（一）培养细胞的类型及其特点 体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，
根据它们是否能贴附在支持物上生长的 特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。
随着细胞数量的逐渐增多，细胞相互接 触汇合成片，因接触抑制及密度抑制细 胞停止分裂繁殖，进入平台期，细胞数 目不再增加，但仍维持一定时间的活力， 此时应及时分离传代，否则细胞将因中 毒而发生改变甚至死亡。悬浮型细胞一 般没有潜伏期，接种并添加新鲜培养液 后即可迅速进入指数增长期。
3. 培养细胞的生存条件
细胞培养技术 cell culture
细胞培养技术
从生物体内取出组织或细胞，在体 外(in vitro)模拟体内生理环境，在无 菌、适当温度和一定营养条件下，对这 些组织或细胞进行孵育培养，使之保持 一定的结构和功能，以便于我们观察研 究，这种方法就是细胞培养（cell culture）。有时细胞培养也称为组织培 养（tissue culture），二者可作为同 义语使用。
（1）贴附型
大多数培养细胞均为贴附型，它 们必须贴附在支持物表面生长，这类 细胞在体内时各自具有其特殊的形态， 但在体外培养时贴附于支持物后形态 上表现单一化而失去体内原有的某些 特征，多呈上皮样或成纤维细胞样。
培养细胞的类型及其特点
贴附细胞型MRC-5成纤维细胞
培养细胞的类型及其特点
• 贴附型细胞正常猴肾单层上皮细胞
培养基的种类
按其物质状态，分半固体培养基（如软 琼脂培养基）和液体培养基两类，其中 液体培养基（即培养液）使用最为广泛。 目前市场上有多种配制好的细胞培养液 出售，但价格较昂贵。实际工作中多用 市售培养基干粉来配制培养液。
配制培养液时，尚需加一定量的动物血清（胎 牛或小牛血清）。配制时根据添加血清量的多 少，构成作用不同的培养液，用于不同细胞和 不同研究目的。一般情况下需添加10 ％ ～20 ％的血清，以维持细胞较快的生长增殖速度， 称为生长培养液；为维持细胞缓慢生长或不死， 加2 ％ ～5％血清含量即可，称为维持培养液。