肿瘤分子诊断

CYP19A1是芳香化酶的编码基因，临床研究已证实有着很大的影响 作用。在接受芳香化酶抑制剂治疗的乳腺癌患者中，携带CYP19A1 基因rs4646（G>T）突变患者的治疗效果较无此突变的患者显著2-4 （下图）。 CYP19A1 rs4646（G>T）SNP是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂治 疗疗效的有效预测指标。
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突变检测技术之一 DNA测序
国际公认的分子检测金标准 有明确的物价收费 实验流程较复杂，需要大型仪器
突变检测项目列举
肿瘤类型 非小细胞肺癌 靶向药物 易瑞沙（Iressa） 特罗凯（Tarceva） 基因 EGFR KRAS 疗效佳的情况 EGFR突变/KRAS野生
胃肠间质瘤
格列卫（Gleevec）
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药物名称 奥沙利铂/卡铂/顺铂
检测靶标 ERCC1/BRCA1
检测内容 mRNA表达水平
检测结果 高 低 高 低 高 低
预测内容 疗效差 疗效好 疗效差 疗效好 疗效差 疗效好 疗效差 疗效好 疗效好
5-FU/培美曲赛
紫杉醇/多西紫杉醇 /长春瑞滨 替莫唑胺
TS
mRNA表达水平
STUBB3,STMN1
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基因表达检测（mRNA表达） (ERCC1\BRCA1\TUBB3\TS)
相关肿瘤
药物名称
检测靶标
检测内容
检测结果
预测内容
高 结直肠癌 贝伐单抗 VEGFR mRNA表达水平 低 高 低 低 肝癌 pDGFR mRNA表达水平 索拉非尼 基因表达检测指标（靶向药物） 高
疗效好 疗效差 疗效好 疗效差 疗效好 疗效差
mRNA表达水平
MGMT
mRNA表达水平
高 低 高
化疗药物与检测靶标
吉西他滨 RRM1
阿霉素/表柔比星
TOPOⅡa
mRNA表达水平
低
高 低
疗效差
疗效差 疗效好
mRNA表达水平
分子靶标分类
靶向药物靶标
基因突变 基因表达
化疗药物靶标
基因表达 基因多态性
CYP19A1
UGT1A1
pDGFR
VEGFR
K-RAS
BRCA1过度表达 铂类耐药的预测因子 抗微管类药物的敏感因子
TS高表达影响氟类和培美曲塞药效
• 低TS mRNA水平的肿瘤 患者接受氟类化疗的效 果较好，中位生存期较 长。
• TS低表达的患者对培 美曲赛的疗效好。
Shirota Y et al. J Clin Oncol. 2001;19:4298-304
= SNP variations in DNA
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百度文库
个体的SNP 谱
SNP 谱A
SNP 谱F
SNP 谱B
SNP 谱E
SNP 谱C
SNP 谱D
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SNP 谱有助于确定药物的疗效和副作用
乳腺癌病人
个体的SNP 谱可以分成不同的类型
对药物有期望的反应
SNP 谱 A SNP 谱 A 的人对药物 有期望的反应
B-RAF
HER-2
ERCC1
突 变
EGFR
RRM1
DPD
小 结
突 变
突 变
表 达
表 达
表 达
表 达
表 达
TS
表 达
多 态 性
多 态 性
多 态 性
NSCLC个体化用药系统方案
药物名称
ERCC1，BRCA1 铂类 XRCC1， GSTP1， MRP2 BRCA1(女) 异环磷酰胺 丝裂霉素 CYP2C9*3 NQO1 TopoⅡα 化疗药物
如图一项对乳腺癌患者的临床研究显示： CYP19A1基因rs4646突变的患者使用芳香化 酶抑制剂药物疗效明显优于野生型患者 （p<0.0001）1。 CYP19A1 多态性影响芳香化酶抑制剂疗效
参考文献 1. Ian ES et al. N Engl J Med. 2003;384:2431-42. 2. Ramon C et al. Clin Cancer Res. 2008;14:811-6. 3. Lunardi G et al. J Clin Oncol. 2009; 27: 555. 4. Fasching PA et al. Breast Cancer Res Tr. 2008;112:8998.
依托泊苷
CYP3A4*4 ,MDR1 TUBB3,STMN1 紫杉醇/多西紫杉醇/长春瑞滨 CYP8*3 伊立替康 吉西他滨 培美曲赛 吉非替尼/厄洛替尼 UGT1A1*6, UGT1A1*28 RRM1 CDA TS EGFR (Exon19/20/21) K-ras , B-raf EGFR VEGFR
循环肿瘤细胞（CTC） 保险公司
基因多态性检测 mRNA表达检测
循环肿瘤细胞（CTC)检测 体细胞基因突变检测
体细胞基因突变检测
EGFR, K-RAS, B-RAF，C-KIT
—— qPCR-HRM（可用于血浆标本检测） —— Taqman-ARMS（与国际获批的技术相当） —— DNA测序（基因突变检测的金标准技术）
临床意义
HNPCC风险评估 明确是否检测MMR突变
HNPCC鉴别诊断 确定突变位点，评估家族中高危个体 风险
DNA测序
热点突变检测
DNA测序
确定家族中是否存在已知的突变
HNPCC检测项目
检测名称
MSI检测 MLH1,MSH2,MSH6 基因突变检测
标本要求
病理蜡块一份（或白片10片），外加5ml抗 凝外周血，4度运达 病理蜡块一份（或白片10片），常温运达
胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因（UGT1A1）

UGT1A1*27(C686A)或UGT1A1*28[(TA)7TAA]: 野生型：6个TA
使UGT1A1的转录活性下降了三分之二。 导致对伊立替康的毒性增加。

UGT1A1*6(G211A)：
此型的酶活性是野生型的49％ 。
FDA提示：UGT1A1的多态性-伊立替康 的毒性增加(6TA)
药物名称
检测靶标
检测内容
检测结果
预测内容
吉非替尼/ 厄洛替尼
EGFR
基因突变
野生型
突变型
耐药
敏感 敏感 耐药 耐药 敏感
西妥昔单抗
K-ras，Braf
野生型 基因突变 突变型 基因突变 野生型 突变型
伊马替尼
C-Kit
指导肿瘤靶向治疗的靶标
基因多态性检测与药物代谢毒性 (UGT1A1,CYP,DPD)
标本要求
热点突变检测
5ml抗凝外周血，4度运达
"We can look at tumors for changes at the DNA, RNA and protein levels. It certainly gives us a way of looking at what is happening inside a tumor, and that's very exciting."
肿瘤分子诊断服务介绍
标准化用药
标准化用药
个体化用药
个体化用药
标准疗法1
标准疗法2
标准疗法3
2
肿瘤药物与相关靶标
如何实现个体化用药？
分子分型
药物疗效
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目前的服务 肿瘤 感染性疾病 新生儿筛查
目前的平台
目前的客户 医院 健康管理公司 研究所 药厂
TaqMan-ARMs 测序 实时定量PCR qPCR-HRM
qPCR-HRM的突变检测已获国际多中心双盲实验验证（Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 11, No. 6, November 2009）。
EGFR
KRAS
突变检测技术之一 QPCR-HRM 实例图：利用HRM技术对7个样本分别进行EGFR（左图）、KRAS（右图）突变检测，
–1997年美国NCI
D5S346和D17S250
1 背景介绍之HNPCC与MMR MSI
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实验室检测流程
MSI检测 MLH1，MSH2，MSH6
突变筛查 MLH1，MSH2，MSH6 热点突变检测
检测名称
MSI（5个位点）
MLH1,MSH2,MSH6 基因突变检测（35个外显子）
检测技术
PCR+片段分析法
C-Kit
C-kit第11外显子突变/PDGFR突变
结直肠癌
爱必妥
KRAS BRAF
野生型
EGFR突变检测
耐药位点检测T790M
EGFR E19 / E21敏感突变
适合使用TKI药物治疗
K-RAS突变检测
BRAF
NCCN
肿瘤学临床实践指南（中国版） 2010第一版
2010年NCCN《结直肠癌临床实践指南》指出： K-ras基因为野生型而同时具有BRAF V600E突变的患者，靶向EGFR抗体治疗无效。
对药物没有期望的反应
SNP 谱 B
SNP 谱E
SNP 谱 C
SNP 谱D
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药物代谢与SNP检测
化疗药物在体内经过吸收、代谢、分布和清除，通过其活性物质对治疗靶点的直接 攻击而发挥作用，整个过程需要多种蛋白质/酶的共同参与和协同作用。
SNP 主要是指在基因组水平上变异频率大于1%的单核苷酸变异所引起的DNA序列多 态性，多态性会导致不同个体体内各种蛋白，酶活性的差异，因此导致药物使用情 况的不同。
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索拉菲尼检测基因-PDGFR
PDGFRα 低表达患者的无进展生存期和总生存期 明显长于高表达患者
贝伐单抗检测基因VEGFR
药物名称 奥沙利铂/卡铂/顺铂 5-FU/培美曲赛 紫杉醇/多西紫杉醇 /长春瑞滨 替莫唑胺 阿霉素/表柔比星
检测靶标 ERCC1/BRCA1 TS
检测内容 mRNA表达水平
mRNA表达水平
STUBB3,STMN1
MGMT TOPOⅡa
mRNA表达水平
mRNA表达水平 mRNA表达水平 mRNA表达水平
化疗药物与检测靶标 RRM1 吉西他滨
ERCC1表达与铂类药物疗效相关 的临床数据
ERCC1阴性患者，能从铂类辅助化疗中获益.
BRCA1/2表达与铂类药物疗效相 关的临床数据
最常见的基因多态性 SNP
绝大多数人群 G to C
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单核苷酸多态性（SNP）是最常见的基因变异
至少1%的人群
共有序列
变异的序列
SNP 位点
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为什么 SNPs 重要?
个体 1 个体 2
基因 A
基因 B
SNP标志基因 A
SNP 可能使基因 B 产生变 异的蛋白质分子
其中MSH2和MLH1基因的功能最重要，其突变占已发现突变的90%左右。
1 背景介绍之HNPCC与MMR MSI
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–研究显示，
约有86%-95%的HNPCC具有MSI特征， 而散发型大肠癌中只有16%。 MSI所产生的遗传不稳定性将加速恶性肿瘤的发生。 (national cancer institution)将MSI确定为检测和筛选HNPCC的重要方法之一，并推荐将BAT26、BAT25、D2S123、 5个位点作为检测HNPCC的位点。
1、基因突变检测技术
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• 所有定量PCR仪均可使用。
• 主要用于各类组织，包括手术、穿刺或镜检组织类。
• 2小时即可完成检测
• 试剂盒商业化程度高，临床认可程度高
• 国内已有试剂盒获批SFDA
突变检测技术之一 TAQMAN-ARMS
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qPCR-HRM技术是基于高效稳健的PCR上的高分辨熔解曲线分析（HighResolution Melting）技术，灵敏度可以达到1%-0.1%，既能检测已知突变， 也能检测未知突变。
乳腺癌
曲妥珠单抗
HER-2
FISH/ mRNA表达水平
HER2基因表达检测
靶向药物 项目名称 样本 结果 疗效 关系
曲妥珠 单抗
HER2
乳腺癌（手术 /穿刺）
+ -
阳性疗效好
↑ ↓
采用RT-PCR方法替代FISH或免疫组化方法，临床准确率 达97%以上。
主要特点： • 客观，不用人为观察。 • 时间短，整个检测60分钟左右完成。 • 高通量，一次可以检测6人份。
红色表示该样本发生突变，蓝色表示未突变，蓝色横直线为阴性对照。左图显示2个样 本发生了EGFR突变；右图显示4个样本发生了KRAS突变。
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血浆EGFR突变检测： 18号外显子：无突变 19号外显子：突变 20号外显子：无突变 21号外显子：无突变 附图
主要特点：
• 实现血浆中来自肿瘤的微量DNA的 突变检测。 • 目前所做的临床实验中，血浆EGFR 检测结果与其手术标本之间的整体符 合率符合率达到91.25%。 • 是临床上不能手术、也同时不愿穿 刺患者的替代检测方案；也可 获得 性耐药进行预先检测。
靶向药物
西妥昔单抗 贝伐单抗
HNPCC实验室检测流程
遗传性非息肉性结直肠癌（HNPCC)是由DNA错配修复基 因（MMR)发生基因突变导致的一种单基因的显性遗传疾病 ，又称lynch综合症，发生基因异常的个体其患发结直肠癌的 风险约为60%。
–目前已发现的导致人类HNPCC发生的MMR有MSH2、MLH1、MSH6、PMS1、PMS2，
靶标
检测内容
mRNA水平，2项 基因多态性，4项（女，6项） 基因多态性，1项 基因多态性，1项 mRNA水平，1项 基因多态性，2项 mRNA水平，2项 基因多态性，1项 基因多态性，2项 mRNA水平，1项 基因多态性，1项 mRNA水平，1项 基因突变，3项 基因突变，3项 mRNA水平，1项 mRNA水平，1项