甘草黄酮

• 剪去左心耳及剪开肺动脉根部，将充满水的乳胶球 囊从左心房经二尖瓣插入左心室，乳胶球囊与压力 传感器相连。以K-H液行主动脉逆流灌注70-80mmHg ，调节乳胶球囊控制左室舒张末压在4-8mmHg，通 过powerlab生物信号采集处理系统记录分析左心室 内压曲线，并记录平衡20min时左心室发展压（ LVDP）和心率（HR）作为基础值，LVDP≥80mmHg， HR＞250次/min，室性早搏≤2个/min，模型制备成 功。
背景：
• 3、肌酸激酶的变化：↑
• 肌酸激酶存在于肌肉组织中，主要分布于骨胳肌及 心肌中，它能催化ATP分子中的高级磷酸键转变成 肌酸和ADP。心肌缺血时，血流量突然停止，在缺 血后10～15 s，缺血区心肌停止收缩，心肌细胞的 能量来源ATP和磷酸肌酸很快降低。肌酸激酶是心 肌缺血时血清酶最早升高的一种，可作为急性冠心 病监护单位最有用酶之一，心肌酶的释放量是缺血 心肌损害程度的重要标志。
甘草黄酮对大鼠离体心脏缺 血再灌注的保护作用
山东大学医学院
内容：
• 背景 • 目的 • 材料 • 方法 • 预期结果 • 讨论
背景：
• 心肌缺血再灌注损伤是指心肌短时间血供中断后， 一定时间内再次恢复心肌血液供应，缺血心肌发生 较血液供应恢复前更严重的损伤。临床上在动脉搭 桥术、溶栓疗法、心脏外科体外循环等治疗中常有 发生。心肌缺血再灌注损伤会导致严重的心律失常， 心肌坏死面积扩大，心脏破裂，甚至死亡。因此， 对临床急性心肌梗死的救治有十分重要的意义。
• ROS损伤是缺血再灌注损伤的重要发病环节
ROS主要产生于再灌注的早期，因而临床上一般在 再灌注前或即刻给予抗自由基制剂以有效减轻缺血 再灌注损伤。
背景：
• 心肌缺血再灌注时有以下变化：
• 1、丙二醛的变化：↑
• 心肌缺血和再灌注改变自由基生成和自由基清除剂之间的平衡，自 由基可从心肌细胞内外两个空间中产生，心肌中的黄嘌呤氧化酶在 氧化次黄嘌呤过程中产生了氧自由基。在心肌组织缺血缺氧和再灌 注后，自由基大量产生及自由基引发的脂质过氧化作用是再灌注损 伤的主要原因。同时缺血和再灌注也削弱了心肌组织内抗自由基系 统的活力。心肌缺血时，自由基产生增多，自由基清除剂SOD减少 ，而活性很强的氧自由基与细胞膜上的多不饱和脂肪酶反应，发生 脂质过氧化，其过氧化产物丙二醛对膜有很强的破坏作用，某些细 胞功能受损伤而导致细胞死亡，同时血管内皮产生的自由基通过血 管壁转运，直接导致心肌损伤。
讨论：
• 甘草黄酮低、中、高剂量再灌注组的SOD活性比I/R 组高，LDH、CK、MDA含量均比I/R组低，说明甘草 黄酮抗氧化作用可抑制脂质氧化产生的丙二醛，明 显提高SOD的活性，清除自由基，减少心肌损伤及 CK、LDH的释放，从而达到了I/R对于心肌的保护。 甘草黄酮低、中、高剂量组的超微结构观察中其线 粒体损伤较I/R组有明显改善且其线粒体评分低于 I/R组，说明甘草黄酮清除自由基的抗氧化作用保 护了心肌线粒体，减轻心肌损伤，也可能抑制了线 粒体介导的细胞凋亡，降低心肌细胞凋亡率。
背景： • 2、超氧化物歧化酶活性的变化：↓
• 自由基的产生既然是有机体在正常或病理条件下的常见现象 ，因此在进化过程也就形成了一系列对抗自由基，防止其 损伤的系统。这种生化学防护系统主要有两大类：低分子自 由基清除剂及复合酶系统。其中超氧化物歧化酶（SOD）在细 胞内作为清除剂起重要作用，它是一种金属蛋白，可以歧化 O2 生成H2O2。哺乳类细胞含有两种SOD。其一是位于胞浆中的 CuZn 超氧化物歧化酶，另一是位于线粒体中的Mn超氧化物歧 化酶。SOD作用的重要意义，在于清除H2O2及OH·的前身O2 ， 从而保护细胞不受强毒性氧自由基的损伤。
• 4、冠脉流出液生化指标：收集I/R组，甘草黄酮
60、120、240umol/L再灌注组冠脉流出液，测定乳酸脱氢酶 ，肌酸激酶的活性。
• 5、电镜标本的取材与制备
各组标本在试验完成后，快速从左心室不同部位取 1mm×1mm×1mm大小的组织5-8块，于盛有预冷的电镜专用2.5% 戊二醛固定液的EP管中，置于4℃冰箱固定2h，实验结束至取 材固定必须控制在2min内。后进行常规电镜样品固定、脱水、 包埋，超薄切片后在透射电子显微镜下观察10个视野并拍照。
目的：
• 本实验旨在探讨甘草黄酮的抗氧化作 用对于缺血再灌注大鼠离体心脏的保 护作用及其可能的作用机制。
材料：
• 1、实验动物：健康雄性SD大鼠60只，体重 250-300g、8-9周龄，清洁级（山东大学动 物实验中心提供）
• 2、主要试剂：甘草黄酮、超氧化物歧化酶 、丙二醛、乳酸脱氢酶、肌酸激酶试剂盒
方法：• 2、实验分组：60只大鼠随机分为5组，每组12只。(分
别为对照组、缺血再灌注组、甘草黄酮低剂量（60μ mol/L） 组、甘草黄酮中剂量（120μ mol/L）组、甘草黄酮高剂量（ 240μ mol/L）组)
• 3、心肌生化指标测定:灌流结束后剪去左心室壁心
肌，测定时制成心肌组织匀浆。按照试剂盒说明，应用TAB比 色原理测定心肌组织中脂质过氧化产物丙二醛含量；应用黄 嘌呤测定法测定超氧化物歧化酶活性。
背景：•
甘草，传统医学认为其有益气补中、清热解毒、缓急止痛等 功效，有“十方九草”之说。近年来人们发现甘草中的黄酮 类有较强的生物活性，目前国内外研究认为其有以下作用：
• ①抗氧化剂、抗自由基作用 • ②抗炎、抗肿瘤作用 • ③抗菌、抗HIV作用
• ④保肝作用
• ⑤抗溃疡作用 • ⑥抗心律失常作用 • 其中，其抗氧化作用是因为甘草黄酮属查耳酮和二氢黄酮， 均含有酚羟基，其对脂质过氧化终产物丙二醛MDA的生成有明 显抑制作用，对超氧阴离子自由基和羟自由基有明显的清除 作用。
• 6、统计处理
•
•
用SPSS11.0统计软件进行分析，计量资料已均数+ 标准差表示，两组间比较采用独立样本T检验，多 组间比较使用单因素方差分析，P小于0.05为差异 有统计学意义
预期结果：
• 1、心肌超氧化物歧化酶活性：I/R组较对照组
明显下降，甘草黄酮低、中、高剂量再灌注组较 I/R组增加且随着浓度增加作用增加。
• 4、乳酸脱氢酶的变化：↑
• 心肌缺血再灌注损伤的主要机制是钙超载和 氧自由基及其引起的过氧化反应。它们使细 胞膜遭受严重的破坏，细胞内的蛋白质和一 系列酶漏出，进入全身血液循环，由于心肌 组织中LDH含量远高于血清中（约达1000倍 以上），即使少量心肌组织损伤或坏死所释 放的酶也足以引起血清中该酶活性的提高。
胞核膜破裂，核染色体固缩边聚；肌丝排列紊乱并 大面积溶解，Z线严重溶解断裂甚至消失；线粒体 严重肿胀，脊排列紊乱如絮状，溶解、断裂空泡样 变，线粒体膜破裂；肌质网严重扩张，膜有破裂。 甘草黄酮低、中、高剂量再灌注组超微结构明显改 善。
• 5、各组线粒体评分：甘草黄酮低、中、高剂量
再灌注组的线粒体评分较I/R组低，高剂量组较I/R 组明显低。
• 2、心肌丙二醛含量：I/R组较对照组增加，甘
草黄酮低、中、高剂量再灌注组较I/R组降低且有 剂量依赖性。
• 3、冠脉流出液中肌酸激酶、乳酸脱氢酶含 量：I/R组较对照组增加，甘草黄酮低、中、高剂
量再灌注组较I/R组降低且有剂量依赖性。
预期结果：
• 4、超微结构：I/R组心肌细胞内外水肿明显，细
•
6、透射电镜下线粒体Flameng评分
每个电镜标本中随机选择5选择个视野，每个视野随机选择 20个线粒体，使线粒体观察总数达100个，将观察的每个线粒 体所得总分除以100，即为该标本得分数，分值越高，线粒体 损害越严重。
线粒体Plameng评分标准
分级 0 1 2 3 4 线粒体损伤程度 线粒体结构正常，充满颗粒 线粒体结构正常，但颗粒缺 乏 线粒体肿胀，基质透明 线粒体嵴分裂，伴基质透明 和浓聚 线粒体基质丢失，嵴分裂， 线粒体内膜和外膜完整性缺 乏，呈空泡状
• 3、主要仪器：Langendorff灌流装置、加 热循环水泵、透射电子显微镜
材料：
Langendorff灌流 装置
透射电子显微 镜
方法： • 1、动物模型制备：离体心脏缺血再灌注模
型
• 动物巴比妥钠麻醉（30mg/kg ip），0.2%肝素2mg，固定于手 术台，打开胸腔分离心脏；在距离主动脉起始部4-5 mm处用 组织剪迅速将主动脉和其他血管一并剪断，立即置心脏于装 有4℃冷灌流液的培养皿中，洗净残血，在液面下找出主动脉 断端，套入Langendorff灌流针固定，从剪取心脏到固定在套 管上应2min内完成，否则弃之。立即灌注95%O2 和5%CO2 混 合气体饱和的Krebs-Henseleit（K-H）灌注液（温度3737.5℃，pH值7.35-7.45,单位mmol/L：NaCl 118.0，KCl 4.7, KH2PO4 1.2, MgSO4 1.2, NaHCO3 CaCl2 1.25,Glucose 10.0),灌流液及心脏用恒温水浴循环器维持在 37℃左右。