过氧化氢酶及过氧化物酶的作用

生物化学实验指导一、内容简介生物化学是一门课堂理论与实验技术相结合的专业基础课。

实验主要以生物大分子制备的一般过程以及电泳和层析等生物化学技术为主，采用经典和现代分析技术相结合的实验方法和手段进行设计，实验内容既包含生物化学研究技术的基本方法，又反映生物化学研究技术的发展水平。

开设实验为30学时，共有13 个实验可供选择，其中验证性实验4个，综合设计实验9个。

由三部分所组成：1．酶的性质及活力测定等；2．蛋白质的分离、纯化、鉴定及含量测定；3．DNA的提取、分离及含量测定二、实验教学目标与基本要求通过本课程学习，使学生掌握常用的生物化学分析与制备技术，理解其基础理论，从而使学生增强对生物化学理论的感性认识，掌握有关生物科学研究的基本技术，并提高学生的动手能力。

四、实验内容实验1 脂肪含量及其碘值的测定(一)、脂肪的定量测定原理脂肪类化合物一般都溶于有机溶剂（如乙醚、石油醚）而不溶于水或微溶于水，利用此特性，可以用索氏脂肪提取器抽提出样品中的脂肪。

索氏脂肪提取器索氏（Ｓｏｘｈｌｅｔ）脂肪提取器为一回馏装置,由浸提管，小烧瓶及冷凝管三者联接而成，浸提管两侧分别有虹吸管及通气管。

盛有样品的滤纸包放在浸提管内，溶剂乙醚（或石油醚）盛于小烧瓶中，加热后，溶剂蒸汽经通气管至冷凝管，冷凝的溶剂滴入浸提管，浸提样品。

浸提管内溶剂愈积愈多，当液面达到一定高度，溶剂及溶于溶剂中脂肪类物质经虹吸管流入小烧瓶。

小烧瓶的溶剂由于受热而汽化，气体至冷凝管而滴入浸提管内，如此反复提取回馏，将样品中脂肪类物质提尽并带到小烧瓶中。

最后将小烧瓶中的溶剂蒸去，烘干，小烧瓶的增重，就是样品中所含脂肪的量。

因本法提取的物质，除中性脂肪外，还会有游离脂肪酸、蜡、磷脂、固醇及色素等脂溶性物质，固提出的物质只能称粗脂肪。

器材与试剂器材：天平，索氏脂肪提取管，恒温水浴锅，滤纸。

试剂：乙醚（不含有过氧化物，乙醇及水分）沸点36℃。

去过氧化物的处理：将乙醚装入分液漏斗，加入乙醚量1/5的10％硫酸亚铁（100克硫酸亚铁溶于600ml 水中，再加30ml浓硫酸酸化，并稀释至1000ml），充分混合后，澄清分层，放出水液。

过氧化物鉴定法：6ml乙醚于试管中，加 2ml10％碘化钾溶液，猛烈混合，放置1分钟，下层碘化钾呈黄色，即表示有过氧化物存在。

去乙醇的处理：加乙醚量1/5的10％氢氧化钾溶液洗涤，洗后放出水溶液，重复2-3次。

去水分的处理：在乙醚瓶中加入适量细粒无水氯化钙，放置一昼夜，时加摇荡，将上层清液移入蒸馏瓶蒸馏。

方法与步骤1.将洗净的索氏提取器小烧瓶用铅笔在磨口处编号，103-105℃烘2小时至恒重，冷却后准确称重，并记录瓶重。

2.用分析天平称取干样（需研碎过40目筛孔）约2克，用滤纸包好，放入浸提管内，纸包长度不能超过虹吸管高度。

3.于已称重的小烧瓶内倒入1/2-1/3体积的无水乙醚（其量应略大于浸提管内体积），联接索氏提取器各部分（不能涂凡士林）。

置约70℃恒温水浴锅内（水必须是蒸馏水或置于电热板上）控制加热温度，使每小时回馏3－5次较宜，一般提取10小时左右。

4.提取完毕，待乙醚完全流入小烧瓶时取滤纸包，再回馏一次以洗涤浸提管。

继续加热，待浸提管内乙醚面接近虹吸管上端而末流小烧瓶前，倒出浸提管中的乙醚，如果小烧瓶中尚留乙醚，则继续加热蒸发，直至小烧瓶中溶剂基本蒸完。

停止加热，取下小烧瓶，用吹风机在通风橱中将瓶中残留乙醚吹尽。

再置103－105℃烘箱中烘半小时，取出冷却后立即称重。

5.计算：粗脂肪含量(%)=提取瓶的增重(g)/样品重量(g)×100 注意事项乙醚为易燃品，切忌明火加热，同时要注意提取器各联接处有否漏气以及冷凝管效果是否良好，以免大量乙醚气外逸，使人麻醉。

(二)、碘值的测定[原理] 脂肪中的不饱和脂肪酸碳链上有不饱和键，可以吸收卤素（Cl2、Ｂr2或Ｉ2）。

不饱和键数目越多，吸收的卤素量也越多。

每１００克脂肪，在一定条件下，所吸收的碘的克数，设为该脂肪的碘值，即碘值愈高，不饱和脂肪酸的含量愈高。

碘值是检定和鉴别油脂的一个重要常数，可以用来推算油、脂的定量组成。

由于碘和脂肪的加成作用很慢，本实验采用汉诺斯（Ｈａｎｕｓ）溶液，它由碘与溴相混合产生ＩＢｒ，溴化碘更易与脂肪起加成作用，该溶液中加入冰醋酸，可使溶液更加稳定，反应过程如下：(1)加成作用: RCH2-CH=CH-(CH2)n-COOH+IBr--→RCH2ICH-CHBr-(CH2)n-COOH（2）剩余溴化碘中碘的释放 IBr+KI--→I2+KBr(3)用硫代硫酸钠滴定释放出来的碘 I2+2Na2S2O3--→2NaI+Na2S4O6器材与试剂器材：碘量瓶(250-300ml)，量筒（１０、５０ｍｌ），滴定管（５０ｍｌ），分析天平或扭力天平。

试剂: （１）汉诺斯（Ｈａｎｕｓ）溶液：取１２.２克碘，放入１５００ｍｌ锥形瓶内，徐徐加入１０００ｍｌ冰醋酸（９９．５％），边加边摇，同时略加温热，使碘溶解。

冷却后，加溴约３ｍｌ。

（２）０.１Ｎ标准硫代硫酸钠溶液：将结晶硫代硫酸钠５０克溶在经煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2存在），添加硼砂７.６克或氢氧化钠１.６克（硫代硫酸钠溶液在ｐＨ９-１０最稳定）。

稀释到２０００ｍｌ。

（３）四氯化碳（４）１％淀粉溶液（溶于饱和氯化钠溶液中）（５）１０％碘化钾溶液（６）花生油和猪油方法与步骤１．称样。

称取０.３－０.４克花生油和０．５克猪油分别放入两只干燥的碘量瓶中，第三只碘量瓶不加样品作为空白。

三只碘量瓶中各加入１０ｍｌ四氯化碳轻轻摇动，使油全部溶解。

２．加汉诺斯溶液。

每只碘量瓶中各准确加入２５ｍｌ，勿使溶液接触瓶颈。

塞好玻璃塞，在玻璃塞与瓶口之间加数滴１０％碘化钾溶液封闭缝隙，以防止碘升华渗出，造成测定误差，在２０-３０℃暗处放置３０分钟，并不时摇动。

3.使过剩的IBr出I2。

放置３０钟后，小心打开瓶塞，使塞旁碘化钾溶液流入瓶内，切勿丢失，加入１０％碘化钾１０ｍｌ，用５０ｍｌ蒸馏水冲洗瓶塞与瓶颈。

４．用Na2S2O3滴定释放的I2。

用０.１ＮNa2S2O3溶液迅速滴定至瓶内溶液呈浅黄色，加入１％淀粉约１ｍｌ，继续滴定，将近终点时，用力振荡，使碘由四氯化碳全部进入水溶液内。

再滴至蓝色消失为止，即达到滴定终点。

５．计算碘值：碘值=(A-B)×100/C D式中:A为滴定空白用去的硫代硫酸钠溶液的ml数。

B为滴定样品用去的硫代硫酸钠溶液ml数。

C为样品重量 T为与1ml 0.1N硫代硫酸钠溶液相当的碘的克数。

在本实验中T=0.1×126.9/1000=0.01269(克/ml)注意事项１．卤素加成反应是可逆反应，只有在卤素绝对过量时，该反应才能进行完全，所以，油吸收的碘量不应超过汉诺斯溶液所含碘量的一半。

若瓶内混合液的颜色很浅，表示油用量过多，应再称取较少量的油，重作。

２．滴定时要用力振荡，如振荡不够，四氯化碳层呈现紫色或红色，此时需继续用力振荡使碘全部进入水层。

实验2 唾液淀粉酶活性的观察（一）原理酶是指化学本质为蛋白质的生物催化剂。

在一定条件下，酶促化学反应进行的能力即称为酶活性（酶活力）。

影响酶活性的因素是多方面的，如温度、PH 及某些化学物质等都会影响酶的催化活性。

在一定条件下，能使酶活性达到最高时的温度即酶的最适温度，而能使酶活性达到最高时的PH 即酶的最适PH 。

例如，唾液淀粉酶的最适温度是37℃，而其最适PH 是6.8。

能增高酶活性的物质称为酶的激活剂，能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑制剂。

凡能使蛋白质变性的因素都可以使酶变性而丧失活性。

酶活性通常是通过测定酶促化学反应的底物或产物量的变化来进行观察的。

本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受理化因素影响的情况。

唾液中含有唾液淀粉酶。

淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解，从而得到各种糊精乃至麦芽糖、少量葡萄糖等水解产物。

而碘液能指示淀粉的水解程度——淀粉遇碘可呈紫色、暗褐色与红色，而麦芽糖与葡萄糖遇碘则不呈颜色反应，如图所示：淀粉 糊精 麦芽糖+少量葡萄糖（二）试剂及器材：（1）0.5%（W/V ）淀粉溶液：称取0.5g 可溶性淀粉，加少量预冷的蒸馏水，在研钵中调成糊状，再徐徐倒入约90ml 沸水，同时不断搅拌，最后加水定容为100ml 即成。

要求新鲜配制。

（2）稀碘溶液：称取1.2g I 2、2g KI ，加少量蒸馏水溶解后，再加蒸馏水至200ml 。

保存于棕色瓶中，用前5倍稀释。

（3）不同PH 溶液：A 液—0.2mol/L Na 2HPO 4溶液：称取35.62g Na 2HPO 4·12H 2O ，将之溶于蒸馏水后定容至1000ml 。

B —0.1mol/L 柠檬酸溶液：称取19.212g 无水柠檬酸，将之溶于蒸馏水后定容至1000ml 。

①PH5.0缓冲液——取A 液10.3ml 、B 液9.7ml 混合而成。

②PH6.8缓冲液——取A 液14.55ml 、B 液5.45ml 混合而成。

③PH8.0缓冲液——取A 液19.45ml 、B 液0.55ml 混合而成。

（4）0.5%（w/v ）蔗糖溶液：称取蔗糖0.5g ，将之溶于蒸馏水后定容至100ml 。

（5）斑氏试剂：A 液—称取无水CuSO 417.4g ，将之溶于100ml 预热的蒸馏水中，冷却后用蒸馏水稀释至150ml 。

B 液—称取柠檬酸钠173g 、Na 2CO 3100g ，再加蒸馏水600ml ，加热溶解后冷却，用蒸馏水稀释至850ml 。

将A 液与B 液混合即得斑氏试剂。

（6）1%（w/v ）NaCl 溶液：称取NaCl 1g ，将之溶解后用蒸馏水稀释至100ml 。

（7）1%（w/v ）CuSO 4溶液：称取无水CuSO 4 1g ，将之溶解后用蒸馏水稀释至100ml 。

（8）白瓷板（或比色板）、恒温水浴锅、电炉 （三）操作1．唾液淀粉酶应用液的制备（1）每人取一个干净的饮水杯，装上蒸馏水。

（2）先用蒸馏水漱口，将口腔内的食物残渣清除干净。

（3）口含约20ml 蒸馏水，做咀嚼动作1~2min ，以分泌较多的唾液。

然后将口腔中的唾液吐入一个干净的小烧杯中[注1]。

（4）取一块干净的白瓷板，按下表操作： 淀粉酶 淀粉酶棕黄色，碘本身颜色（紫红色、暗褐色或红色等）（蓝色）加碘后：蒸馏水（ml ） 2 2 2 2 2 2 弃去唾液[注2]（滴） 2→ 2→ 2→ 2→ 2→ 2→ 0.5%淀粉溶液（ml ）2 2 2 2 2 2 碘液[注3]（滴）1111112．温度对酶活性的影响[注4]（1）取3支试管，按下表进行实验。

试管编号 1 2 3 0.5%淀粉（ml ） 5 5 5 PH6.8缓冲液（ml ）0.5 0.5 0.5 稀释唾液（ml ） 0.5 0.5 0.5 不同温度（℃）置冰水浴中置37℃水浴中置沸水浴中将各管中的试剂加好后混匀，然后及时在上述温度下分别进行处理。