《动物分子生物学》教学课件：第3章(1) DNA复制

2）尿嘧啶N-糖苷酶，它可以切断混合尿苷的糖苷键，形 成AP位点，再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进 行切除修复。
➢ 大肠杆菌内尿嘧啶N-糖苷酶作用较快，而AP酶作用较慢， 在新链合成之初约1200bp就有可能掺进一个U，但很快就 被尿嘧啶N-糖苷酶切断糖苷键，在AP酶未作用前在脉冲标 记实验中就提取了，用碱沉淀时，AP位点十分易断裂，所 以前导链也成了小片段。
真核生物: 多个复制起点，即基因组中有多个复制子
电镜下：真核生物的多复制子
(2)复制方向
单起点、单方向 （原核）
单起点、双方向 （原核）
多起点、单方向 （真核）
多起点、双方向 （真核）
(3) 复制方向和速度
对称双向等速复制：E.coli （105bp/min） 不对称不等速双向复制：枯草芽孢杆菌 单向复制: 质粒ColE1 早期单向，而后双向复制：质粒R6K
1958年，Meselson 和Stahl 用同位素15N标记DNA， 采用Cscl超离心实验证实了DNA复制的这一特性
实验的具体方法
(14N)
DNA半保留复制的意义：可保证亲代的遗传特征 完整无误的传递给子代，体现了遗传的保守性。
2.DNA复制的起点、方向和速度
(1)复制起点
原核生物: 单复制起点，即整个染色体只有一个复 制子。
第 三 章 DNA的复制、 转录与翻译
central dogma
第一节 DNA的复制
主要内容
一、基本概念 二、复制概况 三、DNA复制的酶学 四、DNA复制的基本过程 五、病毒基因组的复制过程
DNA复制的时期？
一、基本概念
1. DNA的复制(Replication)
概念：亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分
始一个复制循环，并可控制起始反应频率的特定位点。 一般富含AT，含有DNA聚合酶结合位点。
复制终点（terminus, ter）:染色体上使一
个复制循环终止的位点。
3. 复制叉（Replication fork）
复制开始，在复制起点形成的一个特殊的叉 形结构，是复制有关的酶和蛋白质组装成复合 物和新链合成的部位。
4. 复制体（Replisome）
复制叉处由多种酶和蛋白质组成的复合体，协 同完成DNA的复制，主要包括解旋酶、拓扑异构 酶、引物酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶等。
二、复制概况
DNA 复制的可能模式
1. DNA的半保留复制方式
（semi-conservation replication）
概念：DNA复制过程中，分别以DNA双链中的一 条链为模板合成其互补链，生成的子代DNA分子是 新生链与模板链的杂合链。
单起点、单方向复制
（3）置换式
又叫D环式复制（D-loop）
单向复制的特殊方式： 线粒体DNA，叶绿体DNA
特点：复制起点不同， 两条链的合成速度高度不 对称，一条链迅速合成出 互补链，另一条则形成游 离的单链环，电镜下呈D环 性状。
双起点、双方向不等速复制
4. DNA复制的半不连续性
(semi-discontinuous replication)
（1）DNA复制的半不连续性
定义：DNA复制过程中，一条链（前导链）的合成是 连续的，而另一条链（后随链或滞后链）的合成是不连 续的（形成冈崎片段）。
先导链
后随链
先导链指DNA复制时，若以走向为3ˊ-5ˊ的亲代链为模板，能连 续合成的子代链。 后随链指与复制叉移动的方向相反，通过不连续的5ˊ-3ˊ聚合合成 的新的子代链。
（2）DNA合成的方向
两条链均为5’－－3’
三、DNA复制的酶学
（一）DNA聚合酶
1957年 Arthur Kornberg首次发现了DNA聚合酶I、 II和III。
DNA聚合酶：以DNA为复制模板，将DNA由5’端点 开始复制到3’端的酶。DNA聚合酶的主要活性是 催化DNA的合成。
共同特点是：
前导链也是小片段的原因：
➢ 大肠杆菌内都存在有dTTP和dUTP，而DNApolⅢ却并不能区 分它们，因此也会将dUTP加入到DNA中，形成A·U对。
➢ 大肠杆菌需要防止U的“混入”。 1）dUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA
合成的底物，这样它就不再能加入DNA中；
⑴需要提供合成模板；⑵不能起始新的DNA链，必 须 要 有 引 物 提 供 3 ’ － OH ； ⑶ 合 成 的 方 向 都 是 5’→3’；⑷除聚合DNA外还有其它功能。
DNA聚合酶的功能
DNA聚合酶I： 主要用于DNA的修复和RNA引物 的替换 DNA聚合酶II： 不是复制的主要聚合酶，可能 参与DNA的损伤修复 DNA聚合酶III： DNA链的延长
冈崎片段的发现
冈崎片段指相对比较短的DNA链（约1000bp）， 是在DNA的后随链的不连续合成期间生成的片段。 脉冲标记实验（pulse-labeling experiment） 脉冲追踪实验（pulse-chase experiment）
1968
Reiji Okazaki
碱
30秒以内合成的都是长度约1kb的小片段； 30秒以后合成的主要是长片段
原核生物的DNA聚合酶III的组成：
由多种亚基组成 核心酶：含有α，ε和θ三个亚基 β二聚体：滑动钳 γ复合物：由γ（δδ’χψ）2组成，是装载滑动钳 的载体 τ二聚体：有助于核心酶的二聚化
全酶的 非对称二聚体
原核生物的DNA聚合酶III的活性：
3. 闭环双链DNA复制的方式
（1）θ复制 DNA在复制起点解开成单链状态,分别作为模板, 各自合成其互补链,并出现两个复制叉。复制过 程中，由于形状像希腊字母θ,因而叫θ复制。
θ结构(复制眼)，单起点、双方向等速复制
（2） 共价延伸方式或滚环式复制 （又叫σ复制）
单向复制的特殊方式： 病毒（λ噬菌体）和细菌
别以每条单链DNA分子为模板(template)，聚合以自
身碱基可以互补配对的游离的dNTP, 合成出eplicon）
基因组上从复制起点到复制终点的区域，是能独 立进行复制的单位。
复制起点（origin，ori）: 染色体上可以起