经典单克隆抗体技术
单克隆抗体的发展历程原理及应用
单克隆抗体的发展历程原理及应用1. 单克隆抗体的定义单克隆抗体（Monoclonal antibodies，简称mAb）是由单个重构的白细胞克隆产生的抗体。
它们具有高度特异性和亲和性，并且只与抗原的特定表位结合。
由于这种特性，单克隆抗体在医学、科研和工业领域中得到了广泛的应用。
2. 单克隆抗体的发展历程•1975年：Cesar Milstein 和 Georges Köhler 首次提出单克隆抗体的构想。
他们成功融合了癌细胞和B淋巴细胞，从而得到了第一个单克隆抗体。
•1984年：Cesar Milstein、Georges Köhler 和 Niels Kaj Jerne 因为他们在单克隆抗体研究领域做出的贡献，共同获得诺贝尔生理学或医学奖。
•1986年：通过使用转基因技术，研究人员成功地将人的免疫系统导入小鼠体内，从而生产出人类单克隆抗体。
•1990年代：人类单克隆抗体得到了进一步的发展，研究人员开发出了一种名为“人源化抗体”的技术，使得单克隆抗体可以更好地适应人体。
3. 单克隆抗体的制备原理•免疫原选择和制备：在制备单克隆抗体之前，需要选择合适的免疫原来激发免疫反应。
一般来说，免疫原应该具有高度特异性，易于制备，并且不会引起太强的免疫反应。
常用的免疫原包括蛋白质、多肽、多糖等。
•动物免疫和细胞融合：免疫原注射到动物体内，激发免疫反应，产生抗体。
然后，从动物体内获取淋巴细胞，与癌细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
•筛选和克隆：筛选出具有特异性和亲和性的杂交瘤细胞，以得到单克隆抗体。
常用的筛选方法包括ELISA、流式细胞术等。
•扩繁和生产：经过筛选和克隆后，选取合适的杂交瘤细胞，进行扩繁培养并生产单克隆抗体。
4. 单克隆抗体的应用单克隆抗体在医学、科研和工业领域中有广泛的应用，包括但不限于以下几个方面：•临床应用：单克隆抗体被广泛应用于临床诊断和治疗。
例如，用于癌症的诊断和治疗的单克隆抗体已经获得了FDA的批准。
单克隆抗体制备的主要技术
单克隆抗体制备的主要技术单克隆抗体制备的主要技术_______________________________单克隆抗体（Monoclonal Antibody，简称mAb）是一种特殊的抗体，它们可以特异性地识别抗原，并且具有极高的特异性和稳定性。
它们已经在临床治疗和诊断方面发挥了重要作用，因此单克隆抗体制备技术已成为生物医学研究的重要手段。
一、单克隆抗体制备的基本原理单克隆抗体制备的基本原理是将一种特定的抗原分子和一种抗原特异性的抗体分子连接起来，从而产生一种特定的单克隆抗体。
这种联合物可以由一种具有抗原特异性的单克隆抗体分子或多克隆抗体分子所表示。
单克隆抗体制备的基本过程可分为四个步骤：选择抗原；制备抗原；选择和培养单克隆抗体产生细胞；制备和纯化单克隆抗体。
1、选择抗原在进行单克隆抗体制备时，首先必须选择一种特定的抗原，以便于产生特异性的单克隆抗体。
常用的抗原来源有蛋白质、多肽、核酸、糖蛋白和合成化学物质。
2、制备抗原根据所选用的抗原，可采用不同的方法对其进行制备。
例如，蛋白质通常可以采用蛋白质表达或免疫原制备方法；多肽可以采用合成方法或者从天然蛋白质中分离出来；核酸可以采用合成方法或者从样品中分离出来；糖蛋白可以采用表达方法或者从天然蛋白质中分离出来；而合成化学物质可以直接合成。
3、选择和培养单克隆抗体产生细胞在单克隆抗体制备中，必须使用能够产生特异性单克隆抗体的产生细胞。
目前常用的单克隆抗体产生细胞包括B细胞、T细胞和流感株融合细胞。
在这些产生细胞中，B细胞是最常用的，因为它能够快速、有效地产生大量的特异性单克隆抗体。
4、制备和纯化单克隆抗体当B细胞产生了足够数量的单克隆抗体之后，就可以采用不同的方法将它们制备和纯化出来。
常用的方法包括浸出法、寡核苷酸酶切法、蛋白酶浸出法、杂交法和Ion-exchange chromatography。
这些方法可以帮助我们得到高度纯化的单克隆抗体。
二、单克隆抗体制备的优势单克隆抗体制备是一种高效、可靠的方法，它可以用来高通量地产生大量特异性的单克隆抗体。
《单克隆抗体技术》课件
单克隆抗体的制备与纯化
单克隆抗体是通过杂交瘤细胞在体外培养或注射到动物体内进行体内培养产生的，经过一系列的分离 和纯化过程，最终获得高纯度、高特异性的单克隆抗体。
制备过程中通常采用各种层析技术、沉淀技术等对抗体进行分离和纯化，以确保获得高质量的单克隆 抗体。
单克隆抗体的鉴定与质量控制
鉴定是通过对单克隆抗体的免疫学特 性、生物学活性和分子结构等方面进 行检测和评估，以确定其特异性和质 量。
总结实验过程和结果，分析存在的问题和改 进方向，为后续实验提供参考和依据。
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THANKS
生物标记物
用于研究细胞生物学、分子生物学 等领域。
03
02
生物药物
用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病等 。
免疫分析
用于检测生物样品中的抗原、抗体 等。
04
02 单克隆抗体技术的原理
杂交瘤细胞系的建立
杂交瘤细胞系的建立是单克隆抗体技 术的核心步骤之一，通过将免疫脾细 胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细 胞。
通过抗原-抗体反应检测杂交瘤细胞产生的 抗体特异性。
克隆筛选
通过选择性培养基筛选出能够产生所需抗体 的杂交瘤细胞克隆。
细胞培养与抗体纯化
将筛选出的杂交瘤细胞进行培养，并采用蛋 白质纯化技术获得单克隆抗体。
实验结果分析与总结
结果分析
对实验结果进行统计分析，评估杂交瘤细胞 的抗体产生能力和特异性。
总结
这些杂交瘤细胞既具有脾细胞无限增 殖的能力，又具有产生特异性抗体的 能力，从而为单克隆抗体的制备提供 了稳定的细胞源。
杂交瘤细胞的筛选与克隆化
在筛选过程中，通过抗原-抗体反应检 测杂交瘤细胞产生的抗体，筛选出能 够产生所需特异性抗体的杂交瘤细胞 。
单克隆抗体技术历史与发展简述
单克隆抗体技术历史与发展简述陈 光(首都师范大学生物系北京100037)1 单克隆抗体技术的研究背景单克隆抗体(monocl onal an tibody,sho rt fo r M c A b)技术(简称单抗),又被称为肿瘤"生物导弹",是能直接导向肿瘤的药物。
1975年英国科学家Koh ler和M ilstein将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合,成功的建立了单克隆抗体技术,因此在1984年获得诺贝尔医学和生理学奖。
单克隆抗体,顾名思义,是与“多克隆抗体”相对而言的,那么认识、理解什么是多克隆抗体对进一步明确单克隆抗体的概念就显得尤为重要。
以抗淋巴细胞多克隆抗体(po lycl onal an tilymphocyte an tibody)为例,来初步阐述多克隆抗体的定义。
这是一类特异性免疫抑制剂,直接作用于人体免疫系统中的淋巴细胞,破坏和抑制淋巴细胞及其功能,特别是T淋巴细胞的功能,可用于同种异体器官移植排斥反应的防治以及其他免疫紊乱性的自身免疫病,如重型再障等的治疗。
抗淋巴细胞多克隆抗体是通过注射人类淋巴细胞、胸腺细胞或B 淋巴细胞至马、兔、山羊或猪等动物体内所产生的抗淋巴细胞抗体。
由于淋巴细胞膜表面抗原成分复杂,免疫血清中的抗体是针对淋巴细胞多种抗原成分的抗体,即多克隆抗体。
根据所用免疫原的不同,有不同的名称,用淋巴细胞作抗原免疫称抗淋巴细胞血清(an tilympho2 cyte serum,AL S);用胸腺细胞作抗原免疫则称抗胸腺细胞血清(an titymphocyte serum,A T S)。
如果将AL S 和A T S进行吸收并提纯其免疫球蛋白则分别称抗淋巴细胞球蛋白(an ti lymphocyte gl obulin,AL G)和抗胸腺细胞球蛋白(an tithymocyte gl obulin,A T G)。
与此对应的,单克隆抗体的制备原理就是,动物受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应,产生相应抗体。
单克隆抗体技术操作流程
单克隆抗体技术操作流程一、免疫原制备免疫原是制备单克隆抗体的关键，它可以是蛋白质、多肽、病毒、细胞表面分子等。
首先需要获得纯度高的免疫原，并进行适当的处理，如去除杂质、进行修饰等。
接下来，将免疫原与适当的佐剂混合，以增强免疫原的免疫原性，如将免疫原与完全佐剂混合，然后注射到小鼠等实验动物体内。
二、免疫动物免疫将制备好的免疫原注射到实验动物体内，激发其免疫系统产生抗体。
通常情况下，需要多次免疫以增强免疫效果。
在每次免疫后，需要采集动物的血清样本，检测抗体的产生情况。
可以使用酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法对血清中的抗体进行检测。
三、细胞融合与筛选当动物产生了满意的抗体效价后，需要从其脾脏等淋巴组织中获得抗体产生的细胞。
将脾脏细胞与骨髓瘤细胞（如NS-1细胞）进行融合，形成杂交瘤细胞。
融合后的细胞具有双亲细胞的优点，既能产生抗体，又具有无限增殖的能力。
为了筛选出产生特异性抗体的杂交瘤细胞，通常需要进行限稀稀释、酶标记法、细胞毒性试验等步骤。
其中，限稀稀释法是最常用的筛选方法，通过将杂交瘤细胞逐级稀释，最终得到单个细胞的克隆。
然后，将这些单克隆细胞扩大培养，并对其产生的抗体进行筛选和鉴定。
四、抗体纯化与鉴定通过培养和扩增单克隆细胞，可以得到大量的单克隆抗体。
接下来，需要对抗体进行纯化和鉴定。
纯化可以使用各种离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等技术，去除杂质，得到纯度较高的抗体。
鉴定抗体的特异性和亲和力是非常重要的步骤。
特异性可以通过免疫印迹、免疫组化等方法进行检测，判断抗体是否能够特异性地结合目标抗原。
亲和力可以通过表面等离子共振（SPR）等技术进行测定，评估抗体与抗原的结合强度。
五、应用和保存经过纯化和鉴定后，单克隆抗体可以应用于多个领域，如医学诊断、生物学研究、药物开发等。
在应用过程中，需要根据具体需求对抗体进行合适的标记和修饰，以提高其应用效果。
为了保存单克隆抗体，可以将其冻存于低温下，如-20°C或-80°C。
单克隆抗体技术讲解
克隆化过程
单克隆抗体的制取
致敏淋巴细胞的准备
骨髓瘤细胞的准备
细胞融合
选择性培养
抗体分泌细胞的筛选
四、单克隆抗体制备过程
1.致敏淋巴细胞的准备 动物选择：品系、年龄、性别、健康状态 抗原接种：方式—体内、体外 剂量—0.5-100g 次数—视抗原而定 间隔—视抗原而定 佐剂—视抗原而定 收集时间：末次接种后72 h 2.骨髓瘤细胞的准备 细胞株处于良好的生长状态 细胞株保持HGPRT缺陷状态 HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
没有单克隆抗体前人类所遇见的问题
银屑病 手口足病 癌症 亚急性湿疹
用于诊断鉴定人的血型类别 用于寻常型银屑病亚急性湿疹 用于复发或耐药的滤泡性中央型淋巴瘤 犬瘟热病毒单克隆抗体 单克隆抗体药物
一、单克隆抗体技术发展
Georges J.F. Kohler Cesar Milstein 1975年将产生抗体的淋巴细胞与肿瘤细胞融合, 成功建立了单克隆抗体技术。 1984年获得诺贝尔医学和生理学奖。
第四章 抗体工程制药 第三节 单克隆抗体的制备
Annual Work Summary Report
汇报人 | 小智
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2.单克隆抗体的概念和特点
3.单克隆抗体技术的应用
4.单克隆抗体的制备过程
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主要内容
固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围 反应强度不如多克隆抗体 制备技术复杂、费时费工、价格较高
1.检验医学诊断 （1）病原微生物抗原抗体的检测：乙肝表面抗原试纸 （2）肿瘤抗原的检测 （3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定：早孕检测试纸、女性排卵检测试纸 （5）细胞因子的测定 （6）其他：吗啡类毒品检测试纸等 2.蛋白质的提纯 3.肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术
单克隆抗体
单克隆抗体技术【原理及意义】单克隆抗体技术(The technique of monoclonal antibody)是由Kǒhler与Milstein于1975年创立的。
他们发现将小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
单克隆抗体(monoclonal antibody,M cAb)具有结构均一、纯度高、特异性强、效价高、交叉反应少或无等优点,缺点是其鼠源性对人具有较强的免疫原性,反复人体使用后可诱导产生人抗鼠的免疫应答,从而削弱其作用,甚至导致免疫病理损伤。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产等一系列实验步骤。
下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前的准备(一)免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合的成功,获得高质量的M cAb 至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例:免疫细胞数为每只小鼠1×107/0.5 m L生理盐水,腹腔注射。
1)初次免疫,间隔2～3周。
2)第二次免疫,间隔3周。
3)第三次免疫10天后,取血测效价。
4)加强免疫3天后,取脾融合。
2.可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂。
将抗原与佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状(放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态)。
1)初次免疫,Ag5～50微克/只,加弗氏完全佐剂皮下多点注射,一般0.2毫升/点,间隔3周。
2)第二次免疫,剂量途径同上,加弗氏不完全佐剂,间隔3周。
3)第三次免疫,剂量同上,不加佐剂,于生理盐水中腹腔注射,7～10天后采血测其效价,检测免疫效果,间隔2～3周。
4)加强免疫,剂量50μg为宜,腹腔或静脉注射。
单克隆抗体技术路线
单克隆抗体技术路线引言：单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法，也是生物制药领域的重要工具。
本文将介绍单克隆抗体技术的基本原理、制备步骤以及应用领域，以帮助读者更好地了解和应用这一技术。
一、单克隆抗体技术的基本原理单克隆抗体技术是一种通过克隆单个抗体细胞，制备具有相同抗原结合特异性的抗体的方法。
其主要原理是将抗原注射到实验动物体内，激发机体产生免疫应答，然后采集动物体内的B细胞，融合B 细胞与骨髓瘤细胞，形成杂交瘤细胞，最后通过筛选获得特异性抗原结合能力的单克隆抗体。
二、单克隆抗体制备步骤1. 免疫原选择：选择合适的免疫原，通常为纯化的蛋白质或多肽。
2. 免疫程序：将免疫原注射到实验动物体内，激发免疫应答。
3. B细胞采集：从免疫动物体内采集脾细胞或淋巴结细胞，富集含有目标抗体的B细胞。
4. 杂交瘤细胞制备：将采集到的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：通过限制性稀释法或酶标记法等方法，筛选出分泌特异性抗原结合能力的杂交瘤细胞。
6. 单克隆抗体生产：将筛选出的杂交瘤细胞进行扩增培养，收集培养上清液，纯化得到单克隆抗体。
三、单克隆抗体技术的应用领域1. 生物学研究：单克隆抗体可用于特定分子或细胞的定位和鉴定，帮助研究者了解生物体内的生物过程和机制。
2. 临床诊断：单克隆抗体可用于检测和诊断疾病，如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病等。
3. 治疗应用：单克隆抗体可用于治疗某些疾病，如肿瘤、免疫性疾病和传染病等，具有较高的治疗效果和较低的副作用。
4. 生物制药：单克隆抗体作为生物制药领域的重要工具，可用于药物研发、质量控制和生产等方面。
结论：单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法和生物制药工具，其制备步骤简单明了，应用领域广泛。
随着技术的不断发展和完善，单克隆抗体技术在生物医学领域将发挥越来越重要的作用，为疾病的诊断和治疗提供更多的选择和可能。
相信随着对单克隆抗体技术的深入研究和应用，必将为人类健康事业作出更大贡献。
单克隆抗体技术
单克隆抗体技术用细胞融合技术将免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞﹐通过筛选﹐经单个细胞无性繁殖(克隆化)后使每个克隆能持续地产生只作用于某一个抗原决定簇的抗体的技术。
单克隆抗体简称单抗(McAb)﹐由于具有特异性﹑均一性﹑高效性和无限供应性﹐以及能利用不纯的抗原制备纯的单一的抗体等特点﹐在免疫学﹑医学﹑生物学等领域的基础研究和临床医学上﹐对疾病(包括癌症)的诊断﹑预防和治疗等方面﹐均显示出巨大的生命力。
脊椎动物身体受到外来抗原的刺激后﹐通过液体免疫系统产生出抗体──免疫球蛋白﹐分布于血清中﹐但由于抗原分子表面有许多不同的抗原决定簇﹐每一个抗原决定簇只能刺激机体中相应的B 淋巴细胞产生相应种类的抗体。
而一种抗体只能和它相对应的抗原决定簇结合﹐所以﹐带有多种抗原决定簇的抗原免疫动物﹐其血清中会出现多种抗体的混合物﹐因而抗体的特异性﹑均一性﹑有效性都很低﹐并且产量也有限。
这样的抗体产物即使用物理化学和生物化学手段也难以分离和纯化﹐因而不能适应医学和生物学对单一纯抗体的需求。
发展简史20世纪60年代初有人观察到小鼠和大鼠体细胞融合后可得到杂交细胞﹔70年代初又有人建立了小鼠骨髓瘤细胞系﹔1973年C.米尔斯坦等人在研究抗体合成的遗传机制时发现融合细胞的“共显性”﹐即来自两个亲本的信息在子代身上均能显现﹔这个发现使G.克勒和 C.米尔斯坦在1975年成功地建立了淋巴细胞杂交瘤技术。
此后﹐世界各国科学家用这个技术研制出数以千计的单抗。
目前已实现商品化生产。
基本步骤细胞融合将鼠或人(目前多用小鼠)的处于对数生长期的骨髓瘤细胞(浆细胞的肿瘤细胞)与经过免疫的同系动物的脾细胞(脾是大量B淋巴细胞的来源)在有促融合剂聚乙二醇的情况下混合﹐使之彼此融合。
杂交瘤的选择将融合后的细胞分放到含HA T(次黄嘌呤﹑氨基喋呤和胸腺嘧啶核)选择性培养液中﹐在96孔或24孔组织培养板中培养。
由于氨基喋呤(aminopterin)能阻断核酸生物合成的主要途径﹐而骨髓瘤细胞又缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移(HGPRT)或胸腺嘧啶核激(TK)﹐因而不能利用外源的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核通过补救旁路进行核酸合成。
常用的单克隆抗体检测方法
通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。
由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。
①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取LNa2CO38ml，LNaHCO317ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至。
Tris-HCl缓冲液（，L）：取LTris100ml，LHCl混合，加蒸馏水至1000ml。
b、洗涤缓冲液（的PBS）：KH2PO4,KCl,Na2HPO4•12H2O,NaCl,Tween-20，加蒸馏水至1000ml。
c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）,加洗涤液至100ml;或用洗涤液将小牛血清配成5—10%使用。
d、酶反应终止液（2mol/LH2SO4）：取蒸馏水，滴加浓硫酸（98%）。
e、底物缓冲液（，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取LNa2HPO4,L柠檬酸，再加50ml蒸馏水。
柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。
f、底物使用液:OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD5mg,底物缓冲液10ml,3%H2O2。
TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）,底物缓冲液10ml,1%H2O225ul。
ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS,底物缓冲液1ml,3%H2O22ul。
8、抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。
h、抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。
病毒感染的传代细胞或全菌抗原。
淋巴细胞等悬液。
i、酶标抗鼠抗体或酶标SPA 或其他类似试剂。
j、细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4100mg，KH2PO4500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1；1）；或-20℃甲醇。
单克隆抗体技术原理
单克隆抗体技术原理单克隆抗体技术什么是单克隆抗体技术？•单克隆抗体技术是一种基于细胞培养和免疫学原理的技术，用于生产单种特定的抗体。
•单克隆抗体由同源的单一免疫细胞分泌，具有高度特异性和亲和力。
单克隆抗体技术的原理1.抗原注射:–抗原是引起免疫反应的物质，将特定抗原注射到动物体内，刺激免疫系统产生抗体。
2.巨细胞瘤细胞融合:–从免疫动物中收集免疫细胞（B细胞），以及标记有癌细胞特异性抗原的肿瘤细胞（如骨髓瘤细胞），两者进行细胞融合。
3.杂交瘤细胞的筛选:–将细胞混合物培养在含有抗生素的培养基中，只有细胞融合体（既含有B细胞的DNA，又含有骨髓瘤细胞的特异性特征）可以存活下来。
4.克隆化:–将培养基中的细胞单独分离，形成单个细胞的克隆，以确保每个克隆细胞来自同一株杂交瘤细胞。
5.抗体筛选:–利用特定抗原对克隆细胞进行筛选，筛选出产生特定抗体的克隆细胞。
6.抗体生产:–将筛选出的克隆细胞进行大规模培养，产生大量单克隆抗体。
单克隆抗体技术的应用•生物医学研究：–单克隆抗体可用于研究特定分子的功能、相互作用和调控机制，对药物研发和疾病治疗有重要意义。
•免疫治疗：–单克隆抗体可用于治疗肿瘤、自身免疫疾病等，通过特异性识别并靶向攻击病理相关分子。
•诊断应用：–单克隆抗体可用于检测特定分子的存在并进行定量分析，如血液中的肿瘤标志物。
•生物传感器：–单克隆抗体可用于构建高灵敏的生物传感器，检测环境中的污染物或特定分子。
总结单克隆抗体技术基于免疫原理，通过抗原注射、细胞融合、筛选、克隆化等步骤，可获得特异性高的单克隆抗体。
该技术在生物医学研究、免疫治疗、诊断应用和生物传感器等领域具有广泛的应用前景。
简述单克隆抗体技术的原理及应用
简述单克隆抗体技术的原理及应用
单克隆抗体技术是一种通过克隆并大量复制一种具有特定抗原结合能力的抗体，从而得到大量高质量的抗体产品的技术。
单克隆抗体技术的原理主要分为以下几个步骤：
1. 免疫动物：首先需要将目标抗原注射到实验动物中，以激发其免疫反应。
2. B细胞的融合：从免疫动物的脾脏或淋巴结中提取抗体产生的B细胞，与癌细胞（如骨髓瘤细胞）融合形成杂交瘤细胞（hybridoma）。
3. 杂交瘤筛选：通过培养和筛选，筛选出能够合成目标抗体的杂交瘤细胞。
4. 克隆：将筛选出的单个杂交瘤细胞直接放置于一个单独的培养皿中，进行单克隆培养。
5. 收获单克隆抗体：收集单克隆细胞培养物中培养出的抗体。
单克隆抗体技术的应用非常广泛，包括：
1. 生命科学研究：用于研究特定分子的功能、调控及相互作用。
2. 临床诊断：用于检测和测量某些疾病标志物，如肿瘤标志物、病毒感染标志物等。
3. 生物药物开发：用于生产大规模的、高质量的抗体药物，如单抗、Fc融合蛋白等。
4. 免疫治疗：用于治疗和预防一些疾病，如癌症、自身免疫性疾病等。
简述单克隆抗体技术的基本原理
简述单克隆抗体技术的基本原理单克隆抗体技术是生物技术领域的一项重要技术，在医药研发、诊断和治疗等方面都有着广泛的应用和前景。
单克隆抗体技术的基本原理是通过选择一种特定的免疫细胞，获取它产生的特异性抗体并使其进行不限制性复制，最终获得具有高度特异性和稳定性的单克隆抗体。
下面将详细介绍单克隆抗体技术的基本原理，包括鼠源性、嵌合型和人源性单克隆抗体技术，以及单克隆抗体生产的流程和应用。
一、鼠源性单克隆抗体鼠源性单克隆抗体是最早使用的单克隆抗体，其制备原理是将鼠类动物免疫一种抗原，收集其脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞，然后将杂交瘤细胞单克隆化，即从杂交瘤中分离出单个克隆细胞并培养扩大。
鼠源性单克隆抗体的优点是制备简单、产量高，但由于小鼠免疫系统与人类的巨大差异，鼠源性抗体往往容易引起免疫原性反应，从而限制了其在临床应用中的使用。
二、嵌合型单克隆抗体为了克服鼠源性单克隆抗体的局限性，研究人员提出了嵌合型单克隆抗体技术。
嵌合型单克隆抗体是由人源性的Fc区和鼠源性的可变区域组成，它可以确保高度特异性和稳定性的又可以降低免疫原性反应。
嵌合型单克隆抗体的制备方法是将人源性的IgG1的Fc片段与包含鼠源性单克隆抗体的可变区域进行基因重组，最终获得嵌合型单克隆抗体。
嵌合型单克隆抗体优点是高度特异性和稳定性、免疫原性反应小。
嵌合型单克隆抗体的制备过程较为复杂，且其效价可能比鼠源性单克隆抗体略低。
随着生物技术的不断发展，研究人员逐渐开始研制具有人源性的单克隆抗体，其能够更加充分地体现在人体内生物学免疫动态，从而降低了潜在的体内免疫原性反应。
人源性单克隆抗体制备方法有两种，一种是在小鼠背景中将人源性单克隆抗体进行筛选和生产，另一种是通过人免疫系统获得人源性单克隆抗体。
人免疫系统产生抗体的原理与小鼠类似，但需要额外进行一系列的筛选和优化步骤，以保证细胞系的干净和稳定性。
由于人源性单克隆抗体与人体内的免疫系统具有良好的兼容性和相似性，因此在临床应用中具有极高的价值。
单克隆抗体技术原理
单克隆抗体技术原理
单克隆抗体技术是一种利用体外培养的细胞制备具有特定抗原识别能力的抗体的技术。
其原理可以分为以下几个步骤：
1. 免疫原注射：首先，将目标抗原注射到动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
2. B细胞分离：从免疫动物的脾脏或骨髓中获得淋巴细胞，然后利用细胞分离技术将B细胞单独分离出来。
3. 融合细胞的制备：将B细胞与骨髓瘤细胞（如骨髓瘤细胞系SP2/0或NS0）进行人工融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞筛选：在杂交瘤细胞培养基中加入选择性培养剂（如无氨杂喹或鸟嘌呤），促使非融合细胞死亡，同时使得杂交瘤细胞存活下来。
5. 细胞克隆：将单个杂交瘤细胞分离至各个孔中，分别培养，形成单个杂交克隆。
6. 抗原筛选：通过酶联免疫吸附试验（ELISA）或其他免疫学实验方法，对每个克隆进行筛选，选取对目标抗原具有高亲和力和特异性的克隆。
7. 抗体生产：根据所选取的克隆，将其注入小鼠腹腔或体外培养，以产生大量的单克隆抗体。
通过上述步骤，单克隆抗体技术可以制备出具有高亲和力、特异性和稳定性的单克隆抗体，用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域。
单克隆抗体技术
单克隆抗体技术(monoclonal antibody, McAb)一、原理历史：Kohler和Milstein (1975)将小鼠骨髓瘤细胞与用绵羊红细胞免疫小鼠后的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既能产生抗绵羊红细胞抗体，又能进行分裂繁殖，创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
近20年来，它在生物学研究和医学临床诸多领域中被迅速推广应用，成为生物学研究三大实验技术之一(另两项为生物化学分离分析技术和DNA重组技术)。
该项创造荣获1984年诺贝尔奖。
概念：1. 克隆(clone) 是指无性繁殖细胞系或有机体群体。
对细胞而言，是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。
在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。
2. 单克隆抗体(monoclonal antibody，简称McAb) 是指在一株B淋巴细胞系中的每个细胞只能产生一种它所专有的、针对一种它能识别的抗原决定簇的抗体，从这样一株B细胞系产生的抗体即为单克隆抗体。
由于是一个细胞克隆分泌的抗体，因此易于分离纯化，这不仅有应用价值，而且对抗体分子的结构、功能的研究也有重大意义。
对单克隆抗体B 淋巴细胞进行细胞培养或小鼠体内繁殖，便可获得大量的、富集的特异抗体。
这就避免了通过对动物免疫获得循环抗体的琐碎、繁重、重复的操作，也无须考虑动物对抗原免疫反应的差异。
在组织培养过程中加入同位素标记的氨基酸还可获标记的抗体。
此外，单克隆抗体是由抗原某一决定簇诱导产生的，抗原专一性大为提高，对抗原结构的研究及临床鉴别诊断都具有实际意义。
如何筛选融合细胞？——单克隆抗体技术的关键。
1) 核酸的代谢：主要途径与补救途径(关键酶：HGPRT、TK；原料H, T)2) HAT选择性培养基。
A；H(次黄嘌呤核苷)；T(胸腺嘧啶核苷)。
3) 缺陷型骨髓瘤细胞筛选：HGPRT-/TK-。
二、技术流程免疫小鼠(3~4周) 骨髓瘤细胞↓(收集指数生长期细胞)↓饲养细胞(2周) ↓收集含McAb 杂交瘤细胞液氮冻存杂交瘤细胞注入小鼠腹腔, 上清液↓产生McAb高含量的腹水↓复苏↓鉴定↓提纯抗体再克隆。
单克隆抗体技术原理
单克隆抗体技术原理单克隆抗体技术是一种重要的生物技术，它可以用于疾病的诊断、治疗和研究。
单克隆抗体是指由单一B细胞克隆产生的抗体，具有特异性和高亲和力。
这种技术的原理是通过免疫细胞融合技术，将具有特定抗原结合能力的B细胞与肿瘤细胞融合，产生能够长期稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，从而获得单克隆抗体。
单克隆抗体技术的原理主要包括以下几个步骤：1. 抗原免疫，首先，动物（通常是小鼠）被注射一种特定的抗原，刺激其免疫系统产生抗体。
这个抗原可以是蛋白质、多肽、糖类、甚至是细胞表面的蛋白。
2. B细胞筛选，接着，从动物的脾脏或骨髓中分离出B细胞，这些B细胞中有些可以产生特异性抗体。
然后，通过细胞融合技术，将这些特异性B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
3. 杂交瘤细胞筛选，将杂交瘤细胞培养在含有抗生素的培养基中，只有杂交瘤细胞才能在这种培养条件下存活，而未融合的细胞会死亡。
这样就得到了能够长期稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。
4. 单克隆抗体筛选，最后，通过对杂交瘤细胞进行筛选和鉴定，得到能够识别特定抗原的单克隆抗体细胞株。
这些单克隆抗体可以被大量培养，并用于疾病的诊断和治疗，以及科学研究。
单克隆抗体技术的原理简单清晰，通过这种技术可以获得高度特异性和亲和力的抗体，可以应用于各种领域。
在医学上，单克隆抗体可以用于诊断疾病、治疗癌症、自身免疫性疾病和感染性疾病等。
在科研领域，单克隆抗体也被广泛应用于蛋白质的研究和分析，例如免疫印迹、免疫沉淀、流式细胞术等。
总之，单克隆抗体技术的原理简单明了，但是在实际操作中需要严格控制各个步骤，确保获得高质量的单克隆抗体。
随着生物技术的不断发展，单克隆抗体技术必将在医学和科研领域发挥越来越重要的作用。
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单克隆抗体
单克隆抗体
（monoclonal antibody, McAb）
通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某 一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体。 细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团。
经典单克隆抗体技术
B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、 增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的 能力。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融 合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克 隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能 力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力， 将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小 鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性 抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。
经典单克隆抗体技术
杂交瘤技术
通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建 系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗 体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂 交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主 要技术途径。
经典单克隆抗体技术
单克隆抗体制备原理
用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT-） 或胸腺嘧啶核苷酸酶（TK-）的瘤细胞变异株与 脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基对融 合细胞进行培养和筛选。
单克隆抗体的制备步骤
1. 免疫原的制备
颗粒性抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等
分子量大于5000Da生物物质。
可溶性抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于
5000 Da 物质。 可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性 抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。
经典单克隆抗体技术
2. 免疫动物
单克隆抗体技术
经典单克隆抗体技术
讲授提纲
• 多克隆抗体的概念 • 单克隆抗体的概念 • 单克隆抗体的制备 • 单克隆抗体的应用
经典单克隆抗体技术
1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的 淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术， 而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。
给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血 清是多种抗体的混合物, 它是由多种抗原决定 簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的, 称为多克 隆抗体。 抗原决定簇：是指抗原分子中决定抗原特异性的特
殊化学基团，又称表位(epitope)。
经典单克隆抗体技术
抗原
表位A 表位B 表位C
克隆A
多
克
隆
克隆B
抗
体
克隆C
经典单克隆抗体技术
• 可溶性抗原（蛋白质） 以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等 量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为 0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，10天后， 断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试 验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原 0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。
⑵ 瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径 合成DNA而繁殖。
⑶ B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存 活5~7d，且功能下降)。
⑷ 融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细 胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。
经典单克隆抗体技术
在HAT选择性培养基中，由于变异的瘤 细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧 啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌 呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷 酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又 被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可 避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴 细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过 次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因 此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。
• 颗粒性抗原 如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫 次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以 １％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～ ８次，取脾前３天，再免疫一次即可。
经典单克隆抗体技术
为什么要反复注射抗原？？
正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B 淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生 1.0×107~5.0×107种不同的抗体。因此一只正常 的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千 万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了 提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使 产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。
经典单克隆抗体技术
核苷酸从头合成途径 （de novo synthesis）
核苷酸补救合成途径 （salvage synthesis）
氨基碟呤 （A）
HAT 核苷酸
次黄嘌呤 （H）
胸腺嘧 啶核苷 （T）
DNA
HAT选择培养原理
经典单克隆抗体技术
单克隆抗体杂交瘤技术基本流程
经典单克隆抗体技术
经典单克隆抗体技术
经典单克隆抗体技术
3. 骨髓瘤细胞的准备
• 细胞株处于良好的生长状态，本身不 能分泌任何抗体或免疫球蛋白；
• 瘤细胞的来源应与制备脾细胞小鼠为同 一品系，以便两者组织相容性抗原一致；
• 细胞株保持HGPRT缺陷状态或TK缺陷状态。
经典单克隆抗体技术
4. 细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养 基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用 50% PEG作为融合剂，在37℃下水浴下加入0.50.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640 培 养 基 终 止 融 合 后 1500rpm 离 心 5min ， 沉 淀 用 HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细 胞板中，37℃，5%CO2的细胞培养器皿中培养。
每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗 原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因 此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大 量单克隆抗体。
单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原 分子大量制备纯一的单克隆抗体。
经典单克隆抗体技术
多克隆抗体 (Polyclonal antibody)
HAT选择性培养基： 培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤
Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。
经典单克隆抗体技术
单单克隆抗体技术
HAT培养基的选择原理
⑴ 氨甲蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径 合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正 常途径合成DNA。