天然产物

天然产物活性成分的分离提取技术应用
摘要：天然产物有效成分分离及结构鉴定是非常重要和活跃的研究领域, 从中可以发现和利用其重要的生物活性组分。

通过现在各种新技术的应用，可以更加精确地对各种天然产物进行分离提取，并对其中的多种有效成分进行鉴定，同时可以创新天然产物中生物碱、黄酮类、萜类、皂苷类、酚酸类、香豆素类有效成分的分离、纯化及结构鉴定新方法，这对生物制药，保健品开发有着极其重要的推动作用。

关键词：天然产物;分离提取;鉴定;新技术
天然产物活性成分是指从再生资源中提取的具有独特功能和生物活性的化合物，其中许多有效成分是疾病防治、强身健体的物质基础。

通过体内外试验和临床验证证明了它们具有抗氧化、抗衰老、抗菌消炎、抗癌、提高免疫力、降血脂、降血糖等功效。

目前，国内外对天然产物活性物质进行了全方位和多领域的研究，研究其原料及原料的栽培和培养技术，以期获得高含量活性成分的原料，研究天然产物的提取分离制备技术、活性物质的构成与结构、功效和机理等，方兴未艾。

研究的主要目的和实际的应用在于开发生产功能保健食品、添加剂或药品。

我国目前生产的天然产物产品占国际市场的份量相对较低,这与我国提取、分离与鉴定技术落后、设备现代化程度低等研究条件不无关系。

因此,要充分挖掘天然产物独特优势,实现其产品应用现代化,其首要问题是解决天然产物中活性成分的提取与分离技术问题。

近年来,随着一些新技术不断涌出,极大地提高了有效成分的收率和纯度以及中药制剂的有效性、稳定性。

本文将就天然产物以及新兴的提取分离技术进行论述。

一提取分离天然产物过程中应用到的新技术
天然产物的提取分离制备技术，传统方法主要是溶剂萃取，如热水浸提、碱液提取和醇类提取等。

其它溶剂的考察主要集中在如丙酮、乙酸乙酯、乙醚、苯、氯仿、正丁醇等有机溶剂对活性物质的提取上，但新技术的应用使天然产物活性成分的生产周期大大缩短，功耗大幅降低，极大地提高了活性成分的收率和纯度以及产品的有效性、稳定性。

1.超临界流体萃取技术
超临界萃取技术（Supercritical Fluid Extraction,SFE）一般采用CO2作为萃取剂，具有工艺简单、无有机溶剂残留、操作条件温和、不易破坏有效成分的优点。

超临界流体萃取技术是20世纪60年代兴起的一种新型提取分离技术。

20世纪80年代中期，超临界萃取技术特别是超临界二氧化碳萃取技术逐步应用于中药有效成分的提取分离及分析，是研究和应用较为成功的一项新技术。

其原理是利用超临界流体的独特溶解能力和物质在超临界流体中的溶解度对压力、温度的变化非常敏感的特性，通过升温、降压手段（或两者兼用）将超临界流体中所溶解的物质分离出来，达到分离提纯的目的，它兼有精馏和萃取两种作用［1］。

随着研究的不断深入，发现全氟聚醚碳酸铵能使二氧化碳与水形成分散性很好的微乳液，从而把超临界二氧化碳萃取技术的应用范围扩展到水溶液体系，现已经使强极性化合物蛋白质的提取成为可能。

超临界流体萃取设备属高压设备，一次性投资较大，运行成本高，因此这一技术目前在工业生产中较难普及。

但随着国产化、工业化超临界二氧化碳萃取生产设备的开发，超临界萃取技术将在活性成分提取领域发挥巨大的作用［1，2］。

2.超声波提取技术
超声波提取技术（Ultrasonic Wave Extraction）是利用超声波产生的强烈的空化效应、机械振动、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速药物有效成分进人溶剂，促进提取的进行。

实验表明，超声提取可以缩短提取时间，提高有效成分的提出率，提高药材的利用率，节约能源，并且避免了高温对提取成分的影响。

超声波提取技术能提高提取率，但它对提取瓶放置的位置和提取瓶的瓶壁玻璃厚薄要求较高，这两个因素直接影响超声效果，而且目前超声波提取技术主要用在小型实验室，要用于大规模的工业生产，还要解决有关工业设备放大的问题［3］。

3.微波辅助萃取技术
1986年Ganzler首先报道了微波用于天然产物成分的提取, 20年来,此项技术已广泛应用于食品、生物、制药、环境样品及天然产物的提取。

微波辅助萃取(microwave2assisted extraction,MAE)是利用极性分子可迅速吸收微波能量的性质,将样品放在不吸收微波的样品杯中,加溶剂后置于密封的萃取罐中进行萃
取。

天然植物的有效成分往往包埋在细胞壁或液泡内植物细胞壁,主要是由纤维素构成的,具有一定的硬度, 是植物有效成分提取的主要屏障。

微波辐照导致细胞内的极性物质尤其是水分子吸收微波能量而产生大量的热,使细胞内温度迅速升高,液态水经汽化产生的压力可将细胞膜和细胞壁冲破,形成微小孔洞。

进一步加热,细胞内部和细胞壁水分减少,细胞收缩,表面出现裂纹。

孔洞和裂纹的存在使细胞外液体易于进入细胞内,溶解并释放细胞内产物[4]。

目前,借助萃取过程中随时引入新鲜溶剂,动态微波萃取技术得到发展,这样便使得萃取效率更高,导出的萃取液与分析仪器在线联用,易于实现自动化[5]。

4.高速逆流色谱技术
高速逆流色谱技术(HSCCC)首创于20世纪80年代初,是美国Ito教授发明的一种新颖的分析分离技术。

它是一种不用任何固态支撑体或载体的液液分配层析法,能够完全排除固体载体导致的不可逆吸附和对样品的玷污、失活、变性等影响,能实现对复杂混合物中各组分的高纯度制备量分离。

其分离原理是在内径约1. 6mm的细管绕成的螺旋管柱里,互不相溶的两相溶剂能在重力场的作用下形成分段状态。

恒流泵输送载着样品的流动相穿过固定相,在螺旋管的高速转动下,两相就会沿螺旋管纵向分开,由于不同的物质在两相中具有不同的分配系数,在柱中的移动速度也不同,从而使样品得到有效的分离。

5.双水相萃取
Albertsson于20世纪50年代后期开发了双水相萃取(ATPE) ,又称双水相分配法。

双水相萃取现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时,由于聚合物之间或聚合物与盐之间的分子空间阻碍作用,无法相互渗透,当聚合物或无机盐浓度达到一定值时,就会分成不互溶的两相,因为使用的溶剂是水,所以称为双水相。

双水相萃取法属于液—液萃取,其原理是当物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的作用和溶液环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同,即各成分在两相间的选择性分配,从而达到萃取的目的[6].
6.膜分离技术
膜分离技术以选择性透过膜为分离递质，当膜两侧存在某种推动力f如压力差、浓度差、电位差等1时，原料侧组分选择性的透过膜，以达到分离、提纯目
的。

膜分离技术具有过程简单、无相变、分离系数大、节能、高效、无二次污染、可常温连续操作、可直接放大等优点，是一项高新技术。

膜分离技术在中药领域中的应用将推动中药现代化发展进程，同时还能提高我国中药的附加值，有利于中药出口。

可以展望，膜分离技术必将在21世纪推动中药制药工业的迅速发展，为社会带来巨大的经济效益和社会效益[7]。

7.高效毛细管电泳法
高效毛细管电泳法是近年来迅速发展的一种新型分离分析技术，以高质电场为驱动力以毛细管为分离通道依据样品中各组分之间的迁移速度和分配行为上的差异而实现的类液相分离技术。

该技术用于分析中草药，具有以下优势：分离模式多，适合于中草药中存在的各类物质的分析；简化对样品前处理的要求：分析时间一般比HPLC短：由于柱效高，有可能使同一个分离条件适合多种样品中多组分的分析；HPCE所采用的毛细管柱易于全面清洗，不必担心柱污染而报废；所用的化学试剂少，价廉，分析成本低，特别适合于我国国情[8]。

8.半仿生提取技术
半仿生提取法是将整体药物研究法与分子药物研究法相结合，从生物药剂学角度模拟1：3服给药及药物经胃肠道转运的原理．为经消化道给药的中药制剂设计的一种新的提取工艺。

张学兰等[9]以小檗碱、总生物碱、干浸膏量为指标，对黄柏的半仿生提取法和水提取法进行了比较。

结果显示，半仿生提取法在增加有效成分的提取率、提高某些药效学指标方面明显优于水提法，是一种值得在中药提取分离中推广的好方法。

9.酶工程技术
酶工程技术是近几年来用于中药工业的一项生物工程技术中草药成分复杂，有各种有效成分，选用恰当的酶，可以通过酶反应较温和地将植物组织分解，加速有效成分的释放提取，选用相应的酶可将影响液体制剂的杂质如淀粉、蛋白质、果胶等分解祛除，也可促进某些极性低的脂溶成分转化为糖苷类易溶于水成分而有利于提取[10]。

二新技术在各种天然产物中的应用
1.生物碱类
生物碱是指存在于植物中的碱性含氮化合物,有旋光性和明显的生理效应。

天然产物含有很多种生物碱, 近年来, 对天然产物中生物碱的研究成为热点。

文献资料表明, 高速逆流色谱、高效液相色谱法是生物碱分离中普遍采用且分离效率较高的方法。

此外, 毛细管电泳、硅胶柱色谱等在生物碱分离中也得到了应用; 而气相色谱法是分离烟草中生
物碱常用的方法。

目前, 生物碱的鉴定中采用最多的是电喷雾离子阱质谱法( ESI-MS) 。

ESI-MS 是近年来迅速发展并逐步完善起来的一种软电离质谱,特别适用于极性大、热不稳定的天然化合物分析。

Xubiao Luo 等[11]采用HPLC- ESI-MS 方法分离鉴定了中草药黄连中的三种生物碱类化合物, 用C18 色谱柱和醋酸盐缓冲液- 乙腈- 甲醇进行梯度洗脱, 并采用选择离子模式进行定量分析, 优化了LC 和锥的电压以得到较好的灵敏度, 方法的检出限可达( 9～30) pg。

与传统的HPLC 相比, 采用HPLC- ESIMS联用方法分离鉴定黄连中生物碱可更准确地提供更多的定性、定量信息。

2.黄酮类
黄酮类化合物指具有色酮环与苯环基本结构的一类化合物的总称, 广泛存在于植物中, 是一种天然抗氧化剂, 在医药、食品等领域具有广阔的应用前景。

由于黄酮类化合物具有不易挥发、对热不稳定性、有紫外吸收和荧光, 分子离子峰稳定等特点, 则高效液相色谱法就成了首选仪器被广泛应用于黄酮类化合物的研究。

自20 世纪70 年代以来, 应用HPLC 技术已成功分离了大量的黄酮类化合物。

Baranowska 等[12]研究从一些裸子植物树叶中使用HPLC 法分离多种黄酮类化合物, 使用不同的RP-18 柱以及平放或倾斜的洗脱方式确定了最佳分离条件。

大孔树脂分离及硅胶柱层析法也是目前分离黄酮类化合物普遍采用的方法。

Wei Wu 等利用HPLC- ESI-MSn 研究了黄酮类的结构, 根据质谱的碎裂机理及HPLC-MS 数据鉴定了野生黄芩提取物中七种黄酮类化合物, 建立了野生黄芩提取物的HPLC- ESI-MSn 鉴定方法。

Rijke 等对黄酮的分离及检测方法进行了综述, 其中着重分析了LC-MS 和LC- NMR 两种联用技术。

但所有的方法都不可能是万能的, 当两种化合物具有相同的分子量和同样的碎片分裂行为时, 就不能用MS/MS 技术对其鉴定了。

而LC- NMR 就能够给出明确的结构, 因为两化合物的光谱性质是不同的。

但LC- NMR 仪器较昂贵, 灵敏度低, 且样品分析时间较长, 而使其应用受到了限制。

此外, NIR 法在黄酮的结构鉴定中也发挥了重要的作用。

3.萜类
萜类化合物是广泛存在于植物中的天然有机化合物, 具有很强生理活性。

现今, 对该类物质的研究进展很快, 很多种类的萜类物质已被制成商品得到应用。

液相色谱、各种柱色谱[是萜类化合物分离常用的方法,此外薄层色谱及逆流色谱也是分离萜类化合物的有效方法。

Jie Liu[13]等采用硅胶柱色谱分离Lucidum 的甲醇提取物, 用正己烷- 乙酸乙酯进行梯度洗脱, 除去棕榈酸、油酸及亚麻酸等物质,对Lucidum 中的三萜类化合物进行分离纯化。

萜类化合物的结构鉴定中最常用的方法是1D- , 2DNMR及色谱- 质谱联用技术, MS 通过化合物碎裂的特征离子峰m/s 的不同对化合物进行鉴定, 而NMR谱图中不同化合物显示出的化学位移值的差异可得出化合物中的化学键的类型和数目, 通常是应用NMR 和MS 两种方法同时鉴定。

4.酚酸类
酚酸类化合物是指同一苯环上有若干个酚性羟基的一类化合物。

酚酸类化合物所具有清除体内自由基、抗癌、刺激免疫系统产生抗体等保健功能。

高速逆流色谱、各种柱色谱、薄层色谱等是分离酚酸类化合物常用的有效方法。

当样品中的成分较复杂时往往同时采用多种分离手段。

王凤美等[14]采用高速逆流色谱法分离纯化丹参水溶性成分丹酚酸类物质, 制备丹酚酸B 化学对照品。

分离采用的溶剂系统为正己烷- 乙酸乙酯- 水- 甲醇( 1.5∶5∶5∶1.5) , 上相做固定相, 下相做流动相, 流速为1.7mL/min, 仪器转速850rpm, 进样量80mg, 一次分离可制备63.4mg 丹酚酸B, 其纯度可达98.6%。

HPLC通常作为分离后的纯化手段, 但也有人将样品经溶剂提取过滤后直接用HPLC 分离酚酸类化合物。

LC/ESI-MS、LC/MS/MS 是鉴别酚酸类化合物常用的方法。

此外, 由于酚酸类化合物经衍生生成酯后, 沸点大大的降低, 衍生后可用GC-MS 对其进行测定。

Maria Plessi 等采用液- 液萃取、固相萃取等不同方法, 从紫葡萄中获得的香油醋中提取酚酸类化合物, 经BTSFA 衍生后, 由GC/MS 进行了鉴定。

5.皂苷类
皂苷是一类结构复杂的糖苷类化合物, 在植物界分布广泛, 已发现约80 个科近千种植物中含有皂苷。

研究证明皂苷类化合物具有显著的生理、药理活性。

在皂苷类成分的提取物中, 往往伴随着诸如糖类、鞣质等亲水溶性较强的植物成
分, 给皂苷类成分的分离纯化增加了难度。

在皂苷类分离的工艺研究中, 大孔树脂得到广泛的应用。

皂苷类成分利用弱极性的大孔树脂吸附后, 很容易用水将糖等亲水性成分洗脱下来, 然后再用不同浓度的乙醇洗下被大孔树脂吸附的皂苷类, 达到纯化的目的。

此外, 在皂苷分离的实验室基础研究中, 正相色谱、反相色谱、离子交换色谱、离子对色谱等均有应用。

层析柱中C18 和NH2 柱应用较多。

对于极性较强的皂苷, 应用NH2 柱的分离效果较C18 柱要好。

6.香豆素类
香豆素又称香豆精, 为顺式邻羟基桂皮酸的内酯, 具特异香气, 广泛分布于高等植物中。

在植物体内, 它们往往以游离状态或与糖结合成苷的形式存在。

超临界CO2 萃取、硅胶柱色谱法、高速逆流色谱法是分离香豆素类化合物的常用方法。

刘红梅等[15]采用超临界CO2 萃取分离白芷中香豆素类成分, 对总香豆素提取条件进行优化, 最优萃取工艺为萃取压力21MPa, 萃取温度50℃, 萃取时间3.0h, 颗粒度20 目, 分离压力6.5MPa, 分离温度30℃。

并用GC-MS 联用技术对超临界样品进行分析鉴定, 共鉴定出15 种香豆素类成分。

在香豆素的结构鉴定中, EI-MS、IR、1H- NMR、13C- NMR 等方法通常是相辅相成的。

Maes 等采用柱色谱和薄层色谱从Pterocaulon Virgatum 的石油醚提取物中分离出三种新的香豆素类化合物, 经UV、IR、EI-MS、1H- NMR、13C- NMR 等实验数据鉴定化合物的结构。

结语
天然产物活性成分的提取分离鉴定技术近几年发展迅速，不断融入新的技术。

但是我国在这方面的研究还比较落后，和国外还有相当大的差距。

我们要加强这些新技术应用于工业生产的研究，相信随着这些新技术在天然产物活性成分领域应用的进一步完善，一定能够使该学科建设提高到一个新的层次。

新型分离纯化提取技术的研究特别是一些平台技术对中国天然产物活性成分研究和新产品的开发都有重要的现实意义。