磁珠提取DNA原理讲课教案

磁珠提取D N A原理

磁珠纯化DNA原理

1.DNA与磁珠作用原理

分选磁珠的作用原理是基于一种固相载体可逆化固定（SPRI）的分离纯化方法。磁珠体系中一般包含：磁珠、DNA、聚乙二醇（PEG）、以及盐离子等，在一定浓度的PEG和盐离子环境中，DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面（即固相载体），该过程是可逆的，在适当条件下，结合的DNA分子可以被洗脱回收。

纳米级别的磁珠表面性质不同，分离原理也不尽相同，但基本上固态的球状材料组成并无太大差异，基础结构一般分为3层，最内层的核心是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁（Fe3O4），最外层表面是羧基（-COOH）修饰的高分子材料所构成，其中羧基行使与核酸结合的工作。

在整个体系中，PEG是影响DNA回收的决定性因素（其他因素还包括DNA 大小和浓度、盐离子浓度、孵育时间等等）。DNA在一定浓度的PEG存在条件下，NaCl或MgCl2促进条件下，使DNA发生脱水反应，分子构象会发生急剧变化，由线状被压缩形成卷曲球状，继而聚集沉淀，同时随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同，不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中，特定分子量的PEG的功能主要是与盐离子共同作用，改变不同长度DNA的分子构象，同时增加体系的粘稠程度，使磁珠存在其中处于悬浮状态，不易沉降，增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥，从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果，除此之外，PEG与蛋白质具有相容性，也可去除样品中的蛋白质。

当处于PEG和盐离子环境中的DNA，因脱水作用而发生分子构象改变后，会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团，与表面带负电荷的羧基磁珠

结合，但如何解释负负电荷之间的作用，目前还不得而知。但普遍认为，这是由于带正电荷的盐离子的作用（如Na+）。带负电的磷酸基团借由解离的盐离子（如Na+）与羧基形成离子桥，使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。当PEG和盐类被去除之后，加入水性分子，会快速充分水化DNA，解除其三者之间的离子相互作用，使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。

磁珠的出现，使得核酸制备的实验可以实现自动化，同时相较于传统的回收方式，还具有3个明显的优势：1）效率更高，以DNA为例，1μL磁珠的承载量可达7μg；2）避免使用有机溶剂，如酚类、氯仿等等，更加安全；3）操作简单，无需离心，也更有利于保留核酸的完整性。

2.蛋白酶K的作用

蛋白酶K具有降解蛋白的功能，而细胞膜主要是由蛋白质构成的富有弹性的半透性膜，因此蛋白酶K能够裂解细胞，从而DNA能够释放出来。

3. 无水乙醇沉淀DNA

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA 失水而易于聚合。

4.TE缓冲液溶解DNA

采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，并且TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。

5.为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？

在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。