目的基因导入受体细胞

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一、遗传表型直接筛选法
• （一）根据载体选择标记初步筛选转化子
• 在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分 子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细 胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性， 作为筛选转化子的依据。
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• 一般的做法是: • 将转化处理后的受体细胞接种在含适量
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选择培养基是：
根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细 菌受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB 培养基中加入适量的某种选择物，即为选 择培养基。
选择物：
是由载体DNA分子上携带的选择标记基 因所决定。
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（一）根据载体选择标记初步筛选转化子
• （1）抗药性筛选
• （2）插入失活筛选法 • （3）插入表达筛选法 • （4）显色互补筛选法 • （5）利用报告基因筛选植物转化细胞 • （6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物
即无背景，在被转染的细胞中无相似的内 源性表达产物； • (3)其表达产物能进行定量测定。
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• ①新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）抗新霉素、 卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选 动植物转化子的选择标记基因。
• ②潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）赋予转化子能 抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植 物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。
把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化 子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为 转化子 ），现在这两者有通用的趋向。
含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组 子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组 子。
经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得 所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。
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（5）利用报告基因筛选植物转化细胞
• 报告基因：系指其编码产物能够被快速地测定， 常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细 胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊 用途的基因。
• 在植物转基因研究中，在有选择压力的情况下，
可利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非
转化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可
• 质粒本身因为Tcr基因受阻碍为Tcs表型，当转化细菌 涂布在Tc平板上时，只有含有外源DNA插入片段的阳 性重组子的转化菌才能生长成菌落。
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（4）显色互补筛选法
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• lacZ 基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完 整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体 之间实现互补，这种互补现象称为α-互补。
• 例如pTR262质粒载体，它由pBR322衍生而来，其 Tcr基因的上游含有一段λ噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编 码基因及其调控序列，CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制 Tcr基因的表达。当外源DNA片段插入CI基因的Hin dⅢ或BglⅠ位点上时，CI基因失活。Tcr基因因阻碍解 除而得以表达，故阳性重组子为Tcr表型。
转基因细胞
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（1）抗药性筛选
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正向选择编方辑pp式t
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• 注意：
• 利用含一种选择药物的选择培养基无法 区分重组子和非重组子，只能区分转化子 和非转化子。
非转化子呈 Aps、Tcs
转化子呈 Apr、Tcr/s
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（2） 插 入 失 活 筛 选 法
• 具有完整乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶 (Z)、IPTG和X-gal时，产生兰色沉淀物，使菌落 成为蓝色。如果在载体DNA上组入β-半乳糖苷酶 基因（lacZ)部分缺失的片段(lacZ’)．则重组 DNA分子转化lacZ’互补型菌落，会在含有Xgal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。
第六章 目的基因导入受体细胞
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第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程 中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必 须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选 出期待的克隆子。
• 概念
–克隆子
–转化子
–重组子
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将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的 受体细胞统称为克隆子。
以和某些目的基因构成嵌合基因，从报告基因的
表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序
列。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码
某些酶类或其他持殊产物的基因等。
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• 特征
• 作为报告基因，在遗传选择和筛选检 测方面必须具有以下几个条件：
• (1)已被克隆和全序列已测定； • (2)表达产物在受体细胞中本不存在，
• 此方法主要用于原核生物。
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α 互 补 的 检 测
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• 以显色剂x-gal作为选择物时: DNA对照组不应出现任何菌落； 感受态细胞对照组长出的菌落应全是蓝色 的； 感受态细胞有效性对照组长出的菌落中应 有白色的。
• 其中一项不符，就有可能挑出假的转化子 菌落。
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• lac Z’是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片 段，含lac Z’的重组载体转化lac Z’互补型菌 株，可转译β-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基β-硫代半乳糖苷）的培养基上使转化子成为蓝色 菌落，而lac Z’互补型菌株本身为白色菌落。当 lac Z’区插入外源基因后，再转化lac Z’互补 型菌株，由于不能翻译β-半乳糖苷酶，转化子即 使在含有X－gal和IPTG的培养基上也只能长成白 色菌落。这样可以区分含外源基因和不含外源基 因的转化子。
选择药物的培养基上，在最适生长温度条 件下培养一定时间，根据菌落生长情况挑 选出转化子。
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常用的选择标记 基因主要是：
抗性基因；
表达产物可以 发光或使反应底 物显色的基因
相应的选择条件是：
可以被抗性基因产 物分解的抗生素；
可以使基因产物发
光的光线，或者是可
以使基因产物显色的
试剂。
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双抗药性筛选
双
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（3）插入表达筛选法
➢利用外源目的基因插入特定载体后能激活 筛选标记基因的表达，由此进行转化子的 筛选。
➢有些载体在设计时，在筛选标记基因前面 连接上一段负调控序列，当插入失活该负 调控序列时，其下游的筛选标记基因才能 表达。
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