目的基因导入受体细胞
【高中生物】高中生物知识点：基因工程的基本操作程序
【高中生物】高中生物知识点：基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序：1、目的基因的获取（1）目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。
（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。
2、基因表达载体的构建（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。
如图：①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。
③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
常用的标记基因是抗生素基因。
（3）基因表达载体的构建过程：3、将目的基因导入受体细胞（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
（2）常用的转化方法：生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
4、目的基因的检测和表达（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA 分子杂交技术。
（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。
基因工程基本操作过程(目的基因与运载体结合)
2） 在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使 插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。
3）选择的载体必须在连接后对基因转录和翻译过 程中的编码区读框不改变。
当载体和外源DNA用同样的限制性内切酶切割时，所形成的 DNA末端就能够彼此相匹配，可以被T4连接酶共价地连接起 来，形成重组体分子。 但是,当靶片段的末端与载体不匹配时， 必须转换其中一个或两个片段的末端形式以便使之连接。这种 末端的转换通常用以下三种方式转换：
载体DNA和目的基因DNA的连接,按DNA片 段末端性质不同，可有下述不同的连接方法：
① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法
1. 同一限制酶切位点连接:
由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完 全相同的末端。只要酶切割产生单链突出的粘性末端 和酶切位点附近的DNA序列不影响连接 .在连接酶的 作用下即可形成重组DNA分子.
人工接头（DNA寡核苷酸连杆）是人工合成 的具有一个或数个特定 限制性内切酶识别和 切割序列的双股平端DNA 短序列。 由平端加 上新的酶切位点，再用限制酶切除产 生粘性 末端，而进行粘端连接。
优点：是进行DNA重组的一种既有效又实用的手 段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端连接法的优 点，而且它可以根据实验的不同要求，设计出具 有不同限制酶位点的人工接头。若在体外连接反 应中增加人工接头的浓度，还会大大提高平末端 DNA片段间的连接效率。
不会自身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大 多数携带有目的基因的重组质粒。
一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生DNA的 片段没有粘性末端，而是平末端。 具有平末端的 酶切载体只能与平末端的目的基因连接。 T4DNA 连接酶可催化相同或不相同的限制性内切酶切割 的平端间的连接。 平端连接比粘性末端连接要困 难的多，其连接效率很低，约有粘性末端连接的 1%。
高中生物第3章基因工程第节基因工程的基本操作程序教案选择性3
第2节基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
1。
科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1）概念:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2）实例:培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因.2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2)实例:在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物—-Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
（3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术.(2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
（3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链.②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链.④重复循环多次。
（4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。
二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图］3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
重组dna技术的名词解释_操作步骤_产业现状
重组dna技术的名词解释_操作步骤_产业现状重组dna技术的名词解释基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
重组dna技术的操作步骤工具(1)酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、(2)载体：质粒载体、噬菌体载体、Ti质粒、人工染色体1.提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。
科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因;另一条是人工合成基因。
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。
鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增，如使用PCR技术)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。
如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。
人工合成基因的方法主要有两条。
一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。
另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
目的基因导入受体细胞
（6）利用遗传选择标记筛 选哺乳动物转基因细胞
• 在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移 酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基 因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。
• 常用的标记基因还有： • -- 胸腺核苷激酶基因（tk）、 • -- 二氢叶酸还原酶基因（dhfr） • -- 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因
斑点杂交法
狭缝式点样器
斑点及狭缝印迹杂交的特点
1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量
4、菌落（或噬菌斑）原位杂交
基本原理 直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上 溶菌、变性 DNA暴露并于滤膜原位结合
第六章 目的基因导入受体细胞
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程 中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必 须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选 出期待的克隆子。
• 概念
–克隆子 –转化子 –重组子
将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的 受体细胞统称为克隆子。
把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化 子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为 转化子 ），现在这两者有通用的趋向。
含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组 子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组 子。
经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得 所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。
一、遗传表型直接筛选法
• （一）根据载体选择标记初步筛选转化子
• 在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分 子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细 胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性， 作为筛选转化子的依据。
高中生物选修 基因工程 目的基因的导入、检测与鉴定
第8课时目的基因的导入、检测与鉴定[学习目标] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。
2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。
[核心素养] 1.科学思维：结合生产实际，举例说出基因工程的基本程序。
2.社会责任：针对生产生活中的某一需求，尝试提出基因工程构想，完成初步设计。
一、将目的基因导入受体细胞1.转化的含义目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.转化的方法(1)导入植物细胞①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用的方法。
a.土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌侵染，其Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体的DNA上。
b.方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。
②基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。
表达载体DNA包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒子表面→用基因枪高速射入受体细胞或组织中→目的基因表达。
③花粉管通道法：在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
(2)导入动物细胞①方法：显微注射技术。
②常用受体细胞：受精卵。
③步骤：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→胚胎早期培养→移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的转基因动物。
(3)导入微生物细胞①原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
②常用的方法a.用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。
b.感受态细胞和重组表达载体DNA分子在缓冲液中混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子。
1.将胰岛素基因的表达载体导入大肠杆菌，从大肠杆菌中获得的“胰岛素”未能达到期待的生物活性，导致这种差异的原因可能是什么？提示大肠杆菌是原核生物，无内质网、高尔基体等细胞器，大肠杆菌中基因表达获得的蛋白质未经加工。
基因工程操作步骤
Ca2+处理细胞 将目的基因插入到 将含有目的基因 →感受态细胞 Ti质粒的T-DNA上 的表达载体提纯 →重组表达载 →农杆菌→导入植 →取卵（受精卵） 体与感受态细 物细胞→整合到受 转化过程 →显微注射→受 胞混合→感受 体细胞的DNA→表 精卵发育→获得 态细胞吸收DNA 达 具有新性状的动 分子 物
基因中启动子（具有 启动作用的DNA片段）
基因中内含子(位于编 码蛋白质序列的非编 码DNA片段） 基因多少 物种间的基因交流
无
有
某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
可以的基因的有关信息，例如，根据基因 的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的 位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达 产物蛋白质等特性来获取目的基因。
解旋方式
酶 特点 结果
热稳定的DNA聚合酶
半保留复制、 全解旋再复制 大量的DNA片段
随堂闯关
PCR技术扩增过程
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 单链DNA 在热作用下， 氢键 断裂，形成_______ b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物 双链 。 与DNA模板结合，形成局部________ c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 DNA链 。 的________
终止子
与RNA聚合酶 结合位点
外显子
内含子
基 因 结 构
内含子：不能编码蛋白质的序列 非编码区 ：有调控作用,上游有RNA聚合 酶结合位点(启动子)。
编码区
外显子：能编码蛋白质的序列1. 从基因中获取目的基因 1. 基因的概念:
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受
体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同
重组基因导入受体细胞的流程操作
重组基因导入受体细胞的流程操作
第二节 重组基因导入受体细胞
一、重组基因导入原核受体细胞
接受DNA片段
重组基因导者F·Griffth在肺炎双球菌中发现的，证
明了遗传的物质基础是DNA。
转化（transformation）——重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受 体细胞稳定维持和表达的过程，转化后的受 体菌，称转化子。
（3）筛选转化子。
重组（基因2导）入D受N体A细胞分的子流程转操化作 感受态细胞
（二）转导 是指通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞将外源DNA
分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
重组基因导入受体细胞的流程操作
λ噬菌体DNA
E突变
D突变
诱导溶菌生长
39℃ 2-3h
溶源菌培养
45℃ 15min
噬菌体颗粒转导 重组基因导入受体细胞的流程操作
三、重组基因导入动物受体细胞 （一）转染法
重组基因导入受体细胞的流程操作
（二）脂质体介导转化
重组基因导入受体细胞的流程操作
（三）动物病毒介导转导法
重组基因导入受体细胞的流程操作
第三节 重组子筛选
只有少数受体细胞能被导入重组DNA分子 例：大肠杆菌 108个大肠杆菌，转化效率10-6 只有100个细胞被转化
外源DNA浓度
当50%～70%菌体细胞死亡时，转化率最高 重组基因导入受体细胞的流程操作
（五）三亲本杂交（triparental mating）
三亲本杂交结合转化法是基于非接合型质粒的迁移作用而建 立的一种DNA转化方法。
重组基因导入受体细胞的流程操作
重组基因导入受体细胞的流程操作
基因工程的基本操作程序
课时课题：1.2基因工程的基本操作程序第2课时课型：新授课梯度训练：1.基因工程的操作步骤：①制备重组DNA分子②转化受体细胞③筛选出获得目的基因的受体细胞，培养受体细胞并诱导目的基因的表达④获取目的基因正确的操作顺序是（ C ）A．③②④① B．②④①③ C．④①②③ D．③④①②图1 图2 2.基因工程是在DNA 分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A ．人工合成基因 B ．制备重组DNA 分子 C ．转化受体细胞 D ．目的基因的检测和表达3.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法 ( B ) A ．基因枪法 B ．显微注射法 C ．农杆菌转化法 D ．花粉管通道法 4．基因工程中常用的受体细胞不包括 ( A ) A ．人体细胞 B ．动物细胞 C ．植物细胞 D ．微生物细胞5．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞。
下列不属于这样做的原因的 ( D )A ．结构简单，多为单细胞B ．繁殖速度快C ．遗传物质含量少D ．性状稳定，变异少（选做题）6.多聚半乳糖醛酸酶（PG ）能降解果胶使细胞壁破 损。
番茄果实成熟中，PG 合成显著增加，能使果实变红变软，但不利于保鲜，可利用基因工程的方法以其进行改造。
请据图 回答：（1）提取目的基因①若已获取PG 的mRNA ，可通过 获取PG 基因。
②在该基因上游加结构A 可确保基因的反义转录，结构A 上应具有 酶结合位点。
得到的目的基因两侧需人工合成BamH I 黏性末端。
已知BamH I 的识别序列如图2-甲所示，请在图2-乙相应位置上，画出目的基因两侧的黏性末端。
③重组质粒转化到大肠杆菌中的目的是 。
（2）用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有 的培养基进行筛选，与此同时，为能更好地达到培养目的，还需在培养基中加入 。
培养24～48h 后取样，在质量分数为25%的蔗糖溶液中，观察细胞 现象来鉴别细胞壁是否再生。
5-目的基因的重组导入
转化 加入 1mLSOC 培养液
10-100L转化液涂 含抗菌素的平板
（3） 平板 培养细菌
10-100L转 化液
涂于含抗 菌素的平 板
37℃过夜
4.转化率和影响转化率的因素
每gDNA转化成功的细菌克隆数 总受体细胞所获的转化成功的细菌数
（1）重组质粒
①环形质粒数 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片段进入细菌会被降解。
收DNA复合物，球状细胞复原并分裂增殖。在选择性培 养基平板上可挑选所需的转化子。简单，但转化效率不
高（106-108/gDNA）。
10ng载 体DNA 100L感 受态菌 10-100L转化 液涂含抗菌素 的平板
吸附DNA On ice混 合，静置 10分钟
摄入DNA 42º C 1.5分钟
二乙氨乙基葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外 源DNA。
1
葡聚糖 DEAE
预处理
细胞
摄入
外源DNA
2
外源DNA
混合
细胞
吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可 以进入到细胞核里。 DEAE对细胞有毒!
本章思考题（3）
1、重组DNA分子在导入受体前如何保证插入的正确？ 2、受体的选择有什么要求？ 3、导入大肠杆菌受体的方法有哪些？ 4、导入植物细胞的方法有哪些？ 5、导入动物细胞的方法有哪些？ 6、简述各种重组DNA导入法的优缺点。
但移码突变！
4. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片段的用量
（2）用碱性磷酸酶处理载体
5’
3’ 插入片段
载体
载体和外源DNA插入片段的连接结果
受体细胞：
原核生物细胞
真核生物细胞 酵母菌细胞
基因工程-基因表达载体构建(2)
（4）、检测目的基因是否进入受体细胞可以用 DNA分子杂交 方法，用 DNA与RNA杂交 方法检测目的基因是否转录，用 免疫（ 抗原抗体反应 ）法检测目的基因是否表达。另外也 让虫子啃食棉叶，观察虫子的存活状态。 可进行个体水平检测。如 4、基因拼接成功的原因 DNA都是双螺旋结构，基本组成单位都是脱 ；
（3）将目的基因导入受体细胞：基因工程中常用的受体细胞 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞 受精卵 等。动物常把 细胞作为受体细胞。导入植物细胞的 方法有 等；农杆菌转化 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 染色体DNA 法可以将目的基因导入细胞并把其整合到受体细胞的 显微注射法 上，导入动物细胞的方法有 ；如果运载体是质 CaCl2 处理，以增大细菌 细胞壁 粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用 的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的 基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制， 由于 细菌繁殖的速度非常 ，在很短的时间内就能够获 快 得大量的目的基因。
途径 方法
供体细胞中的DNA 中直接分离基因 鸟枪法
供体细胞中的DNA ↓限制酶 许多DNA片段 ↓载入 运载体 ↓导入 受体细胞 ↓ 外源DNA扩增, 产生特定性状 ↓分离 目的基因
人工合成基因（真核细胞） 反转录法
目的基因mRNA ↓反转录 单链DNA ↓合成 双链DNA(即目的基因)
根据已知氨基酸 序列合成DNA
氧核苷酸且遵循碱基互不配对原则
转基因表达成功的原因是生物 共用一套遗传密码 。 基因工程的意义： 。 目的性强；克服远源杂交不亲和的障碍。
实例：利用大肠杆菌生产人的胰岛素简要过程：
胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺 中提取，1000Kg胰腺只能提取40-50g的胰岛素，其产量之低和价格之高可 想而知。能否用大肠杆菌生产人的胰岛素？如果能，如何实现？
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入受体细胞的方法有多种，下面列举几种常用的方法：
1. 转染：将外源质粒DNA或RNA引物与适当的转染试剂一起加入细胞培养基中，使其与细胞内成分相互作用，从而实现目的基因的导入。
2. 转染载体：利用合成的质粒或病毒载体将目的基因导入受体细胞。
常用的载体包括质粒、腺病毒、逆转座子等。
3. 病毒载体：利用病毒进行基因转导。
常用的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、类似于HIV的病毒等。
这些病毒具有高度感染细胞的特性，可以有效地将目的基因导入受体细胞。
4. 基因枪：使用高压气流或射频磁场等物理力量将目的基因导入细胞。
基因枪是一种直接注射目的基因至细胞核的方法，通常用于转栽植物细胞。
5. 电穿孔：利用电脉冲使细胞膜发生短暂通透性改变，从而实现外源DNA的导入。
6. 短搏治疗：通过使用暂时增强细胞膜通透性的方法，如低温、酶处理或超声波处理，以促进目的基因的进入细胞。
这些方法各有优劣，选择适当的方法取决于目的基因、受体细胞类型和实验要求等因素。
目的基因导入受体细胞及重组子的筛选
活化菌种，扩大培养，使其 处于对数生长后期 （OD600=0.4）
3-4 ml菌液冰水浴中10 分钟，4 ℃离心集菌
转 入 37 ℃ 水 浴 上5 min， 加入 1 ml不含选择性 药 物 的 LB 培 养 基
转入42 ℃水浴 上 2 min ， 使 感受态细胞吸 收重组DNA。
0.2 ml新制备好 的感受细胞中加 入缓冲液溶解的 重 组 DNA ， 置 于冰水浴中1 h 以上，期间轻摇 几次
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受 体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能 进入受体细胞。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含 有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或 一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所 致。因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中 筛选出来。 ■转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转 化子。 ■重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。 具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
3.各种类型受体细胞的优缺点
（1）原核细胞 ■优点 大 部 分 原 核 细 胞 没 有 纤 维 素 组 成 的 坚 硬 细 胞 壁 ， 便 于 外 源 DNA的进入。 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA 与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 基因组简单，不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外 源基因进行遗传分析。 原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料， 并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。
基因工程的基本操作程序
（第二课时）
复习：基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 核心 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
复。
露一手
[解析] (1)PCR扩增过程中,目的基因在高温下解旋为单链,降温时引物与单链 互补序列结合,在酶的作用下进行子链延伸。(2)基因表达载体的构建是实施 基因工程的核心。(3)将目的基因转入植物细胞常用农杆菌转化法。通过转化, 目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达。 (4)检测对根 结线虫敏感的番茄中是否插入目的基因,可采用DNA分子杂交技术。检测目 的基因在分子水平是否表达则可以用抗原—抗体杂交的方法。(5)比较两种抗 性基因(SIMi和CaMi)在转基因植株中的抗根结线虫的效果,可分别取等量的两 种成功表达的转基因番茄植株接种等量根结线虫,比较其抗虫效果。
感受态 细胞
表达载体 与感受态 细胞混合
感受态细胞 吸收DNA， 完成转化
小结：将目的基因导入受体细胞
生物种类 常用方法 受体细胞
植物细胞 农杆菌转化法；
基因枪法； 花粉管通道法。
植物体细胞
动物细胞 显微注射技术
动物受精卵
微生物细胞 Ca2+处理法 原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒 将含有目的基因的表 的T-DNA上→农杆菌→导入 达载体提纯→取卵
的番茄转基因株系,应用于植物抗根结线虫育种。请回答相关问题: (1)PCR技术是扩增目的基因的常用手段。扩增过程中,目的基因 受热变性 后
解旋为单链, 引物 与单链相应互补序列结合,在酶的作用下进行延伸。
(2) 基因表达载体的构建 是实施基因工程的核心。 (3)将目的基因转入对根结线虫敏感的番茄中,最常用的方法是 农杆菌转化法 。
基因工程基本步骤
基因工程的基本操作程序自主学习（理知识，固基础）基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：、、、。
学点一、目的基因的获取：1．目的基因：符合人们需要的，编码蛋白质的。
也可以是一些具有的因子。
2．获取目的基因的方法(1)从基因文库中获取目的基因①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
②种类基因组文库：含有一种生物的基因。
部分基因文库：含有一种生物的基因，如cDNA文库。
③目的基因的获取依据：根据基因的有关信息：基因的序列、基因在上的位置、基因的产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等特性获取目的基因。
(2)利用PCR技术扩增目的基因。
①PCR含义：是一项在生物体外特定DNA片段的核酸合成技术。
②PCR原理：DNA 。
③条件：有一段已知目的基因的序列，以便根据这一序列合成。
④过程：目的基因DNA受热形成，与结合，然后在_____ ____的作用下进行延伸形成DNA。
⑤方式：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成扩增=2n(n为扩增循环的次数)。
(3)人工合成法：如果，已知，可以通过用化学方法人工合成。
学点二、基因表达载体的构建──基因工程的核心1．表达载体的组成： + + + 等。
2．启动子：位于基因的，它是和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA，最终获得所需的。
3．终止子：也是一段有特殊结构的，位于基因的，终止。
4．标记基因：鉴别受体细胞是否含有目的基因，从而将筛选出来。
常用的标记基因是。
5．表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中，并且给下一代；同时使目的基因能够_ __和作用。
6．不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建上也会有所差别。
学点三、将目的基因导入受体细胞(一)转化的概念：目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内和过程。
(二) 常用的转化方法：1．将目的基因导入植物细胞(1)农杆菌转化法①农杆菌特点：易感染植物和裸子植物，对____ ___植物没有感染力；Ti质粒的可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。
第七章-受体细胞PPT课件
转导(transduction)
通过λ噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径
将外源DNA分子导入受体细胞
重组型转化率106-107 pfu
.
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.
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λ噬菌体体外包装技术
(1) 外包装蛋白缺陷型
1975, Becker 和Gold首先建立
D蛋白缺失突变株 E蛋白缺失突变株
.
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E蛋白
D蛋白
.
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会有DNA分子进入大肠杆菌细胞里
.
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CaCl2引起大肠杆菌细胞处于感受态 可能的原因:
① Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使内 外膜间核酸酶解离，诱导形成感受态
② Ca2+能与DNA分子结合，使DNA与Ca2+ 复合物接近细胞膜，当42°C热激处理 时，膜出现间隙，DNA分子进入
Flash1
存在潜在治病性
.
32
诱变等方法进行遗传性状改良，获得突变型菌株:
①限制-修饰系统
限制系统缺陷型菌株(hsdR -)
②重组系统
重组蛋白缺陷型(recA- recB- recC-)
③易于转化或转导
④有明显的选择性差异
遗传表型差异大, 易于重组子筛选
⑤感染寄生缺陷型
.
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四.重组DNA分子转入真核细胞
.
35
共培养
感染后的带菌外植体, 在诱导愈伤组织或不定芽培养基上培养
脱菌培养
转移到含有抗生素的培养基上培养,去除农杆菌 常用抗生素: 羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef)等
筛选培养 外源基因抗生素
分化培养 分化培养基
.
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.
37
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含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组 子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组 子。
经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得 所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。
第六章 目的基因导入受体细胞
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第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程 中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必 须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选 出期待的克隆子。
• 概念
–克隆子
–转化子
–重组子
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2
将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的 受体细胞统称为克隆子。
以和某些目的基因构成嵌合基因，从报告基因的
表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序
列。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码
某些酶类或其他持殊产物的基因等。
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• 特征
• 作为报告基因，在遗传选择和筛选检 测方面必须具有以下几个条件：
• (1)已被克隆和全序列已测定； • (2)表达产物在受体细胞中本不存在，
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选择培养基是：
根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细 菌受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB 培养基中加入适量的某种选择物，即为选 择培养基。
选择物：
是由载体DNA分子上携带的选择标记基 因所决定。
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（一）根据载体选择标记初步筛选转化子
• （1）抗药性筛选
• （2）插入失活筛选法 • （3）插入表达筛选法 • （4）显色互补筛选法 • （5）利用报告基因筛选植物转化细胞 • （6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物
转基因细胞
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（1）抗药性筛选
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正向选择编方辑pp式t
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• 注意：
• 利用含一种选择药物的选择培养基无法 区分重组子和非重组子，只能区分转化子 和非转化子。
非转化子呈 Aps、Tcs
转化子呈 Apr、Tcr/s
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（2） 插 入 失 活 筛 选 法
即无背景，在被转染的细胞中无相似的内 源性表达产物； • (3)其表达产物能进行定量测定。
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• ①新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）抗新霉素、 卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选 动植物转化子的选择标记基因。
• ②潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）赋予转化子能 抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植 物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。
• 例如pTR262质粒载体，它由pBR322衍生而来，其 Tcr基因的上游含有一段λ噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编 码基因及其调控序列，CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制 Tcr基因的表达。当外源DNA片段插入CI基因的Hin dⅢ或BglⅠ位点上时，CI基因失活。Tcr基因因阻碍解 除而得以表达，故阳性重组子为Tcr表型。
• 具有完整乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶 (Z)、IPTG和X-gal时，产生兰色沉淀物，使菌落 成为蓝色。如果在载体DNA上组入β-半乳糖苷酶 基因（lacZ)部分缺失的片段(lacZ’)．则重组 DNA分子转化lacZ’互补型菌落，会在含有Xgal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。
• 此方法主要用于原核生物。
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α 互 补 的 检 测
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22பைடு நூலகம்
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• 以显色剂x-gal作为选择物时: DNA对照组不应出现任何菌落； 感受态细胞对照组长出的菌落应全是蓝色 的； 感受态细胞有效性对照组长出的菌落中应 有白色的。
• 其中一项不符，就有可能挑出假的转化子 菌落。
• 质粒本身因为Tcr基因受阻碍为Tcs表型，当转化细菌 涂布在Tc平板上时，只有含有外源DNA插入片段的阳 性重组子的转化菌才能生长成菌落。
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（4）显色互补筛选法
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• lacZ 基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完 整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体 之间实现互补，这种互补现象称为α-互补。
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• lac Z’是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片 段，含lac Z’的重组载体转化lac Z’互补型菌 株，可转译β-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基β-硫代半乳糖苷）的培养基上使转化子成为蓝色 菌落，而lac Z’互补型菌株本身为白色菌落。当 lac Z’区插入外源基因后，再转化lac Z’互补 型菌株，由于不能翻译β-半乳糖苷酶，转化子即 使在含有X－gal和IPTG的培养基上也只能长成白 色菌落。这样可以区分含外源基因和不含外源基 因的转化子。
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双抗药性筛选
双
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（3）插入表达筛选法
➢利用外源目的基因插入特定载体后能激活 筛选标记基因的表达，由此进行转化子的 筛选。
➢有些载体在设计时，在筛选标记基因前面 连接上一段负调控序列，当插入失活该负 调控序列时，其下游的筛选标记基因才能 表达。
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（5）利用报告基因筛选植物转化细胞
• 报告基因：系指其编码产物能够被快速地测定， 常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细 胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊 用途的基因。
• 在植物转基因研究中，在有选择压力的情况下，
可利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非
转化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可
选择药物的培养基上，在最适生长温度条 件下培养一定时间，根据菌落生长情况挑 选出转化子。
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常用的选择标记 基因主要是：
抗性基因；
表达产物可以 发光或使反应底 物显色的基因
相应的选择条件是：
可以被抗性基因产 物分解的抗生素；
可以使基因产物发
光的光线，或者是可
以使基因产物显色的
试剂。
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一、遗传表型直接筛选法
• （一）根据载体选择标记初步筛选转化子
• 在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分 子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细 胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性， 作为筛选转化子的依据。
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• 一般的做法是: • 将转化处理后的受体细胞接种在含适量