【精品课件】细胞凋亡分子机制及检测
肿瘤与细胞凋亡PPT课件
VS
机遇
随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学等 技术的发展，我们可以更深入地了解肿瘤 细胞凋亡的机制，发现新的治疗靶点。同 时，随着免疫治疗和基因治疗等新型治疗 方法的出现，也为肿瘤细胞凋亡的研究提 供了新的思路和手段。
肿瘤细胞凋亡研究的前沿技术与方法
单细胞测序技术
可以对单个细胞进行基因组、转 录组和蛋白质组测序，从而更准 确地了解肿瘤细胞凋亡的机制和 过程。
肿瘤与细胞凋亡PPT 课件
contents
目录
• 肿瘤概述 • 细胞凋亡概述 • 肿瘤与细胞凋亡的关系 • 肿瘤细胞凋亡的研究进展 • 展望与未来研究方向
01
肿瘤概述
肿瘤的定义与分类
肿瘤的定义
肿瘤是机体在各种致癌因素作用下， 局部组织的某一个细胞在基因水平上 失去对其生长的正常调控，导致其克 隆性异常增生而形成的新生物。
肿瘤细胞凋亡的信号转导通路研究
肿瘤细胞凋亡的信号转导通路
研究肿瘤细胞凋亡的信号转导通路，包括死亡受体通路、线粒体通路等，有助于揭示肿 瘤细胞凋亡的调控机制。
肿瘤细胞凋亡信号转导通路的调控
研究肿瘤细胞凋亡信号转导通路的调控，包括各种激酶、磷酸酶等对凋亡过程的调控作 用，有助于发现新的治疗策略。
肿瘤细胞凋亡与其他生物过程的相互作用研究
肿瘤细胞凋亡与自噬的相 互作用
研究肿瘤细胞凋亡与自噬之间的相互作用， 有助于深入了解肿瘤细胞的生存与死亡平衡 。
肿瘤细胞凋亡与免疫系统 的相互作用
研究肿瘤细胞凋亡与免疫系统之间的相互作 用，有助于发现新的免疫治疗策略。
05
展望与未来研究方向
肿瘤细胞凋亡研究的挑战与机遇
挑战
肿瘤细胞凋亡的机制复杂，涉及多种基 因和信号通路的相互作用，研究难度较 大。同时，肿瘤细胞常常通过多种途径 抵抗细胞凋亡，导致治疗难度增加。
细胞凋亡
医学病毒学研究所
刘媛媛
概念
细胞凋亡 (apoptosis ) 是在一定的生理或病理 条件下，一种由基因调控的细胞主动的死亡过程。 程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)，在一定时间内，细胞按一定的程序发生 死亡，这种细胞死亡具有严格的基因时控性和选 择性。
细胞凋亡与PCD的区别
②分隔机制 在凋亡细胞内由内质网分隔成大小不等 的分隔区，靠近细胞膜端的分隔膜与细胞膜融合并 脱落形成凋亡小体。
③自噬体形成机制 凋亡细胞内线粒体、内 质网等细胞器和其他胞质成分一起被内质网 膜包裹形成自噬体，自噬体在与凋亡细胞膜 融合后排出胞外形成凋亡小体。 有些细胞不形成若干个凋亡小体，而仅 仅发生核固缩和胞质浓缩，成为单个致密的 结构，这也被称为凋亡小体。在病毒性肝炎 中见到的嗜酸性小体就是凋亡小体的例子。
可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质 固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞 质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽” 及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞 噬现象。
2. 生化特征检测
1.细胞凋亡最显著的生化特征是ca2+、 Mg2+依赖的内源性核酸酶激活后，将细 胞核染色体从核小体间断裂，形成约为 180-200bp或其多聚体组成的寡核苷酸 片段。 2.针对此寡核苷酸片段发展了检测凋亡的 琼脂糖凝胶电泳法、原位末端标记法和 ELISA法等，这些方法具有很高的特异 性和敏感性，为凋亡的研究提供了强有 力的工具和手段。
细胞凋亡从启动到凋亡小体被吞噬最短的仅需 数分钟，而凋亡小体被吞噬细胞吞入后几小时 才被消化成残余体，因此实验中经常见到的是 凋亡小体被吞入后进行消化降胞内聚集的染色质块形成大 小不等的核碎片后，整个细胞通过发芽(by budding)、起泡(by zeiosis)等方式形成一个个球 形突起，并在根部缩窄脱落，形成一些大小不等、 内含胞质、细胞器以及核碎片的膜性小体，即凋亡 小体。
细胞凋亡与检测原理
细胞凋亡与检测原理细胞凋亡（apoptosis）是一种由体内分子机制调控的程序性死亡过程。
细胞凋亡对于维持身体健康和发展正常的组织功能至关重要。
它在多种生理和病理过程中发挥重要作用，包括胚胎发育、免疫监视和应答、细胞数量调节、损伤修复和肿瘤的发展等。
因此，对细胞凋亡的检测与研究对于了解细胞凋亡的机制和应用于治疗疾病具有重要意义。
细胞凋亡的检测可以通过多种方法和实验手段进行，下面将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法及其原理。
1.形态学检测法：细胞凋亡在形态上表现为细胞体积的缩小、细胞核染色质的凝结、细胞核的畸变和断裂等特征。
这些特征可以通过光学显微镜观察到。
常用的形态学检测方法有苏木精-伊红染色、核小体染色和电镜观察等。
2.核酸染色检测法：细胞凋亡过程中，细胞核内的DNA分子发生明显的断裂和畸变，这可以通过核酸染色荧光探针来检测。
常用的核酸染色方法有荧光染料染色、DNA单断链检测和TUNEL（转移酶介导的末端标记化反应）法等。
TUNEL法是最常用的细胞凋亡检测方法之一，它通过用荧光标记亲和剂连接到DNA断裂末端的3'-OH基团来检测细胞凋亡的程度。
3. 蛋白质检测法：细胞凋亡过程中，许多蛋白质的表达水平会发生明显变化。
比如，细胞凋亡会导致Bax、Caspase家族蛋白的活化和表达增加，而抑制凋亡的蛋白质Bcl-2则会下调。
因此，通过Western blot 和免疫组化等方法，可以检测细胞凋亡相关蛋白质的表达水平的变化。
4.流式细胞术：流式细胞术是一种通过光电探测器测定细胞数量和特征的方法。
流式细胞术可以通过筛选和排序上述染色体和蛋白质等特征，来确定细胞凋亡发生的程度和类型。
比如，通过测定细胞的细胞质内的卵磷脂翻转（PS）外露与细胞核DNA染色剂（如PI）结合的比例，可以鉴定凋亡细胞和坏死细胞。
细胞凋亡的检测原理是基于细胞凋亡的特征改变。
比如，形态学检测法通过观察细胞的形态学变化来鉴定细胞凋亡；核酸染色检测方法通过检测DNA断裂和畸变来判断细胞凋亡；蛋白质检测法则通过检测细胞凋亡相关蛋白质的表达水平变化来鉴定细胞凋亡。
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14 细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。
细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。
细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。
凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。
凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。
凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。
细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。
细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。
1．细胞凋亡的检测方法凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。
细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征：（1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。
借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。
（2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。
（3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
细胞凋亡的分子机制和调控
细胞凋亡的分子机制和调控细胞凋亡是机体中常见的一种细胞死亡方式，有利于维持机体内细胞种类的平衡。
细胞凋亡过程中，细胞内部的某些表现会发生变化，包括细胞体积的缩小、色素颗粒的凝聚、细胞核的碎裂等。
这些过程都需要经过严格的分子机制的调节和控制。
本文将探讨细胞凋亡分子机制和调控的相关知识。
一、细胞凋亡的分子机制1.细胞凋亡的两条途径根据通路的不同，细胞凋亡可以分为内源性和外源性两种途径。
内源性途径是通过一种叫作线粒体途径的过程触发的，又称为内部途径。
该途径受到一些生化环境变化，如氧化应激、DNA损伤以及蛋白质累积等因素的影响。
外源性途径是由一些细胞外的因素引起，比如受到外部放射线的照射、化学物质毒性的刺激等。
2.细胞凋亡的相关分子细胞凋亡过程中有许多分子参与了其中的调控和作用，比如凋亡相关蛋白（Apoptosis‐related proteins）、细胞因子（Cytokines）、Bcl‐2家族蛋白等。
其中，Bcl‐2家族蛋白是调控细胞死亡的最重要因素之一，负责机体细胞凋亡的平衡。
而Bcl‐2相似蛋白Bax则是Bcl‐2家族蛋白的最主要致死分子之一。
3.线粒体线粒体是调控机体细胞凋亡的重要器官。
细胞死亡途径的一部分——内部途径的第一步就是线粒体的程序性释放。
线粒体复合物能够从线粒体的膜中输送Bax蛋白至亚粒子结构中，并刺激激活细胞周期免疫原p53。
激活p53后，它进一步激活下游的信号通路，从而出发内部途径。
二、细胞凋亡的调控1.生存信号的影响生命信号是影响机体细胞存活状态的最主要因素之一。
当生存信号充足时，细胞内部便会对凋亡分子进行调控，从而保持生命活力。
当生存信号过少时，会导致细胞内部凋亡途径的开启，从而引发细胞凋亡。
2.凋亡相关蛋白的调节凋亡相关蛋白是调节细胞凋亡的最主要的因素之一。
Bcl‐2和Bax是该蛋白家族的重要代表成员。
Bcl‐2能够通过控制线粒体内钙离子的释放来防止细胞凋亡。
而Bax则是促进细胞凋亡的重要因素，经它介导的线粒体复合物的形成，让程序性细胞死亡途径开启。
细胞凋亡及其分子机制
细胞凋亡及其分子机制细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理情况下主动死亡的过程，也称为程序性细胞死亡。
与坏死不同的是，细胞凋亡在细胞膜完整的情况下进行，其特点是细胞色素减少、核染色体凝聚、细胞膜凹陷、细胞体积萎缩、细胞核碎裂成大小不等的小碎片等。
细胞凋亡在生理上具有维持组织稳态、代谢物质回收利用、修复受损细胞等重要作用，而在病理上则与癌症、自身免疫性疾病等有着密切的关系。
细胞凋亡发生的分子机制包括两个主要途径：线粒体途径和死受体途径。
一、线粒体途径线粒体途径也称为内质网途径，它的本质是在细胞内部信号传导通路中通过线粒体的激活导致一系列阈值被触发进而导致细胞凋亡。
该途径受到严格的调控，存在多个向下途径，因此是目前研究较为深入的途径之一。
1、内质网蛋白的释放在发生细胞应激及凋亡信号诱导后，线粒体膜内部的多种蛋白发生改变，例如内质网蛋白如Cytochrome c和APIAF1等进入细胞质，这时候线粒体的电荷和隧道颗粒大小都发生了改变，导致附近离线长链多糖等原始粒子的吸附和聚合，大量的内质网蛋白系统被激活，此时对细胞凋亡的启动信号已经传递到了其它细胞死亡通路。
2、活化卵白酶原线粒体内的腐蚀酸酶通过对多种蛋白的酸解离活化卵白酶去活化卵白酶原，激活卵白酶变得比较敏感，进而活化内质网蛋白系，引起细胞凋亡。
二、死受体途径死受体途径是指通过“受体—配体”相互作用，向内质网和其他信号转导途径中传递信号，从而达到引起线粒体途径激活的目的。
1、TNF信号的传递TNF受体（TNF-R）激活后就向下途径传递信号。
这种传递的信号是通过与逐渐逐渐鸟嘌呤二聚体结构磷酸酶激活紧密相关，最终是将这一信号传递到形式蛋白之中，这样一来大脑可与细胞膜进行分析，减弱交错作用，细胞凋亡的精致环节也跟着实现。
2、色素脱落蛋白在病毒感染、死受体等情况下，色素脱落蛋白Caspase-8敏锐受到诱导，此时它会被进行联结，这个联结的结果是色素脱落蛋白能够强制将双生体细胞内部的发生变异的基因进行打击。
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14-细胞凋亡的诱导和检测实验14 细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。
细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞内容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。
细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。
凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。
凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。
凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。
细胞凋亡时的生化变化特征是核酸内切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。
细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。
1．细胞凋亡的检测方法凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。
细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
表凋亡的检测方法（引自DL 斯佩克特等，2001）方法细胞类型特点说明形态学/细胞旋转不限简单、快速、低廉、贮存无限制略带主观性，但可靠Hoechst染色不限极快，不能贮存略带主观性，但可靠吖啶橙/溴化乙锭不限极快，不能贮存凋亡初期可用，略带主观性，但可靠FACS/FSC X SSC 非贴壁细胞简单，须及时进行客观，仅能提示凋亡FACS/PI吸收非贴壁细胞简单，需及时进行客观，不能辨别凋亡于坏死；早期凋亡的细胞呈阴性膜联蛋白V(锚定蛋白) 最好非贴壁细胞快速简单；细胞可以被固定并非所有细胞在膜整合损失前受PS影响；测定已知的显著性的反应DNA片段（琼脂糖电泳）不限很快、低廉定性，不能确定凋亡；某些细胞不适用DNA片段(PI染色) 不限很快，低廉定量；用于估计凋亡程度DNA片段(JAM 分析) 循环细胞低廉，可分析多种类混合定量，不能确定凋亡含量；不能用于所有细胞TUNEL 不限昂贵，耗时定量，常被认为可靠（尽管应该结合形态学评价）线粒体膜电位损不限低廉，不能确定凋失快速亡，并非次生坏死前的所有细胞都适用caspase活化(蛋白酶活性) 不限中等花费，很快目前不能确定凋亡，但适用于监测器；不能鉴别特定激活的caspasescaspase活化(caspase免疫印迹) 不限中等花费可以鉴别特定激活的caspases；依赖于抗体的有效性caspase活化(基质免疫印迹) 不限中等花费通过特异切割反应测定caspase活化；如这些反应功能可确定形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征：（1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。
细胞凋亡的分子机制
细胞凋亡的分子机制细胞凋亡是正常细胞死亡的一个重要过程，对于维持机体的稳态及发育起着至关重要的作用。
研究表明，细胞凋亡的分子机制涉及多种因素的调控，包括信号通路、蛋白质调控和基因表达等。
本文将系统地讨论细胞凋亡的分子机制。
一、细胞凋亡的信号通路1.细胞凋亡的外部启动因子细胞凋亡的外部启动因子包括细胞因子、趋化因子、免疫因子等，它们通过与受体结合，激活细胞内的信号转导通路，引发细胞凋亡。
其中，TNF家族受体和Fas受体等是细胞凋亡信号通路中的重要组成部分。
2.细胞凋亡的内部启动因子细胞凋亡的内部启动因子主要包括线粒体，它们在细胞内受到一系列的刺激后，释放过氧化氢、细胞色素 c 等信号分子，激活半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族酶，最终引发细胞凋亡。
值得注意的是，Bcl-2家族蛋白在这一过程中起到了关键的调控作用，它们能够调节线粒体膜通透性，控制细胞凋亡的进程。
二、细胞凋亡的蛋白质调控1.半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族caspase家族是细胞凋亡执行者的核心，包括启动caspase、执行caspase和效应caspase等各种类型。
它们通过顺序激活，逐步执行细胞凋亡过程。
例如，caspase-8和caspase-3分别是启动caspase和执行caspase，它们对于细胞凋亡的调控起到了至关重要的作用。
2.细胞凋亡抑制蛋白（IAPs）IAPs是一类抑制caspase活性的蛋白，能够通过与caspase结合，抑制其活性，从而阻断细胞凋亡的进程。
然而，在一些情况下，IAPs也被某些信号分子调节，使其失去对caspase的抑制作用，细胞凋亡过程得以进行。
三、细胞凋亡的基因表达调控1.p53基因p53是一个重要的肿瘤抑制基因，在细胞受到DNA损伤等刺激后，能够被激活，并调控多个靶基因的表达，从而抑制细胞生长和促进细胞凋亡。
p53的调控能力和稳定性对于细胞凋亡的正常进行至关重要。
2.miRNA调控miRNA是一类小分子RNA，在基因表达调控中起到了重要的作用。
细胞凋亡的分子机理
细胞凋亡的分子机理细胞凋亡是一种重要的生物学过程，它在正常的发育、维持组织的稳态以及免疫反应中发挥着关键作用。
相对于细胞不断分裂的增殖，凋亡是一个精确而有选择性的过程，只消耗了相对较少的能量，因此被认为是一种高效的细胞死亡方式。
在细胞发生重大损伤、受到异物侵入或某些信号的刺激等情况下，凋亡将成为细胞自我保护的重要途径。
凋亡的分子机理主要与三类分子相关：Bcl-2家族的蛋白、异源性死亡因子受体（Fas、TNF-α受体等）及其配体、及胞内酶系统。
Bcl-2家族的蛋白Bcl-2家族共有18个成员，其中包括两类蛋白家族：抑制凋亡的Bcl-2相似蛋白（Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w等）和促进凋亡的Bax-like蛋白（Bax、Bak等）。
Bcl-2相似蛋白在细胞凋亡过程中发挥重要的抗凋亡作用。
它们主要通过两个机制抑制凋亡：第一，它们可以结合到线粒体的外膜上，阻止线粒体膜通透性转移蛋白（TDP），从而防止线粒体膜通透性的增加和线粒体膜电位的下降。
第二，它们可以结合到细胞质中的凋亡调节酶（caspase）上，抑制凋亡酶的激活，从而防止凋亡的进一步发生。
相反，Bax-like蛋白是P53介导的PTEN磷酸酶的下游因子，它们在凋亡过程中扮演了关键的促凋亡作用。
Bax-like蛋白本身在非凋亡细胞中处于未活化状态，可以与Bcl-2相似蛋白相互作用。
当细胞受到一定信号（如DNA损伤）时，P53与MDM2分子之间的相互作用被抑制，P53得以积累。
积累的P53可以激活促凋亡蛋白Bax/Bak，从而释放Bcl-2相似蛋白的抑制作用，P53也可以通过调节Bax/Bak在线粒体膜上的定位来促进外膜通透性的改变，释放线粒体细胞色素C(Cyt c)等含有凋亡的蛋白质到细胞质中，进而引发凋亡酶（caspase）的活化，最终导致细胞的凋亡。
异源性死亡因子受体及其配体细胞凋亡也可以通过外源性成分来触发。
异源性死亡因子受体（又称死亡受体，DR）和其配体（如Fas配体和TNF超家族配体等）是调节外源性信号介导凋亡的关键分子。
细胞生物学技术-细胞凋亡
例：强烈应激反应 糖皮质激素
淋巴细胞凋亡
病原体：细菌、病毒等。例：HIV
（2）抑制因素（抑制细胞凋亡）
CD4+T细胞凋亡
细胞生长因子：如IL-2 、神经生长因子
激素 例：ACTH
肾上腺皮质细胞凋亡
其他：如Zn2+、药物、某些病毒等
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细胞凋亡信号的转导
凋亡诱导因素 作用于 细胞 转化为 凋亡信号 胞内信号转导途径 激活细胞死亡程序
➢ （3）凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小 不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细 胞膜所包围；
➢ （4）凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。
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细胞凋亡DNA的片段化
8
细胞凋亡的过程及机理
➢ 接受凋亡信号
➢ 凋亡调控分子间的相互作用
➢ 蛋白水解酶（caspases）的活化
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细胞内氧化还原状态改变的检测
• 当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧 化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从 而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移 到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。
• 由于 GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除 了对研究细胞凋亡的起始非常有用外，还可用于心脏病、中风 等疾病治疗的研究。但有些细胞如：HeLa 和3T3细胞凋亡时没 有明显的GSH水平的变化，不能用此法检测。
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线粒体膜势能（DYmt）的检测
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Caspase家族的结构与分类
ICE亚类Caspase蛋白酶：ICE（白介素1转换酶） 是单核细胞来源的参与成熟的一种蛋白酶，参与 凋亡，但不起主要作用： Caspase-1，Caspase-4， Caspase-5， Caspase-11，Caspase-12，Caspase13， Caspase-14。
细胞凋亡的分子机制PPT课件
• PT孔道的组成成分ADP-ATP在提示能量代谢的 重要分子，其表达有严格的组织专一性
• PT孔道的作用有自放大效应
2021
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The Molecular Mechanisms Of Apoptosis
细胞凋亡的分子机制
有证据表明，Ca2+浓度的升高引起细胞凋亡并 非是普遍现象，因此，可能起决定作用的因素 是维系某一细胞生存的Ca2+浓度的失衡亡
• PKA和PKC是体内主要催化蛋白质磷酸化的激酶
• PKA受cAMP激活，PKC的直接活化分子是DAG
• PKC促进细胞凋亡的机制可能与PKC的活化可激 活离子通道，使G蛋白发生磷酸化，导致GP活 化或表达的下调，引起cAMP水平升高有关
• 不同的PKC同工酶在凋亡调节中担负着不同的功 能
2021
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（2）酶蛋白信号途径与细胞凋亡
Ras-MAPK 途径与细 胞凋亡信 号的传导
Activation of the MAPK-signalling pathway.
2021
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（2）酶蛋白信号途径与细胞凋亡
• Ras-MAPK 途径与细 胞凋亡信 号的传导
• 第一信使系统与细胞膜结核并作用以后，可与 细胞内的激素受体相作用，或刺激第二信使系
统，如Ca2+、cAMP等
• 通过共同通道改变某些基因的表达，导致细胞 凋亡的发生
2021
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2、调控细胞凋亡的传统信号途径
（1）G结合蛋白（GBP/GRP/GP）信号 途径与细胞凋亡
G结合蛋白信号途径是由GBP、G蛋白偶 联受体（GpCR）、腺苷酸环化酶（AC） 三部分组成
细胞凋亡及检测方法
细胞凋亡细胞凋亡是指由基因所决定的细胞自动结束生命的过程，由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以也常常称为细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD)。
具体指细胞遇到内、外环境因子刺激时，受基因调控启动的自杀保护措施，包括一些分子机制的诱导激活和基因编程，通过这种方式去除体内非必需的细胞或即将发生特化的细胞。
例如，蛙的个体发育过程中，四肢的形成过程中尾巴消失等现象，都涉及细胞的自动死亡。
在形态学上把细胞凋亡分为三个阶段：第一个阶段是凋亡的开始，此阶段只是进行数分钟，细胞中所表现的特征是：微绒毛消失，细胞间接触消失，但是质膜保持完整性，线粒体大体完整，核糖体逐渐与内质网脱离，内质网囊腔膨胀，并与质膜发生融合，染色质固缩等等;第二阶段是形成凋亡小体，核染色质发生断裂，形成许多的片段，与一些细胞器聚集在一起，然后被细胞质膜包围，形成凋亡小体；第三阶段是凋亡小体被吞噬细胞所吞噬，而其残留物质被消化后重新使用。
细胞凋亡是一个主动性自杀过程，所以它是一个耗能的过程，需要ATP提供能量。
【细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。
细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
细胞发生凋亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，对于这种生物学观察，借用希腊“Apoptosis”来表示，意思是像树叶或花的自然凋落，可译为细胞凋亡。
人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究，近年来已成为生物学、医学研究的一个热点，到目前为此，人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡(apoptosis)。
细胞坏死是早已被认识到的一种细胞死亡方式，而细胞凋亡则是近年逐渐被认识的一种细胞死亡方式。
细胞生物学之细胞凋亡及其调控的分子机制课件-PPT
属肿瘤坏死因子受体（TNF）超家族； 包括1~6个富Cys结构域组成的保守的胞外区，
和一个由60~80aa组成的“死亡结构域” (death domain, DD)； DD将受体信号与胞内凋亡机制相偶联； 分类：CD95(Fas/Apol), TNFR1,TNFR2, DR3(Apol3/Esl1)等近十种。
GSH耗竭、ROS产生等，并形成恶习性循环。 MPT的这种自我放大效应，很可能是一种细胞死亡
“全或无”的开关。
线粒体释放的凋亡诱导分子
在多种诱导因子（如Bax过表达、UV照射）作 用下， MPT开放和外膜破坏；
线粒体释放多种凋亡相关分子，如CytC、 Smac、Endo G等
细胞色素C：
伤与修复，能抑制凋亡， 能被caspase-3灭活。
其他酶类：
丝氨酸蛋白酶（如粒酶B）、calpain、NOS等
二、细胞凋亡的信号传递途径
细胞凋亡的影响信号分为2类：
一类为凋亡的负调控信号（抑制凋亡）； 另类为凋亡的正调控信号（诱导凋亡）
细胞凋亡信号转导通路的特点：
同一性：各种因素引起的凋亡的形态与生化改 变均相同。
1. 细胞核的变化
核内染色质凝聚、形成染色质块，并聚集于核的边 缘呈多种形状排列，然后逐步分裂为碎片（核碎片 形成）。
2. 细胞质的变化
(1) 胞质脱水浓缩，体积减少约30% (2 ) 细胞器的变化: A.线粒体早期体积增大，嵴增多
晚期成空泡状, B失去微绒毛、细胞突起及细胞表 面皱褶，膜电位下降，膜 流动性下降；C. 内质网 腔扩大；D. 细胞骨架变得致密和紊乱。
3. 凋亡小体的形成
细胞凋亡的分子机制
细胞凋亡的分子机制细胞是构成生物体的基本单位，而细胞凋亡是维持生命的重要机制之一。
细胞凋亡是一种正常的细胞死亡方式，通过这种方式细胞可以主动地消亡而不会对周围组织造成伤害，从而使生物体能够保持稳定的状态。
细胞凋亡的分子机制是一个复杂的过程，涉及到多种生物分子的相互作用。
现在，我们来详细地探讨一下细胞凋亡的分子机制。
1. 细胞凋亡的基本概念细胞凋亡是指受到内外环境刺激的细胞主动进行的死亡过程，这种过程有很好的控制和规范性，既可控制和乘胜逃脱，又能确保短时间内完整的清除受损和没调用的细胞格。
2. 细胞凋亡的信号通路细胞凋亡的信号通路是一系列的分子反应，包括不同的效应，如蛋白酶活化、细胞内信号转导等。
（1）细胞外凋亡信号通路这种信号通路通过细胞外的受体引起，这些受体被离体的死亡指示分子(DI)激活。
DI被活化后，能够将其腔肽与Ced-4参与氧化还原反应的DH域结合，而使Ced-4得到释放，Ced-4则进一步激活Ced-3，从而引起纵向的蛋白酶级联反应，最终导致细胞凋亡。
（2）细胞内凋亡信号通路细胞内凋亡信号通路都是由同一个酶家族执行的，这些酶家族称为Caspase。
活化的Caspase会对不同的基质蛋白执行切割功能，结果引起细胞的凋亡，以及其他的效应，如促进信号转导、保持细胞的稳定性等。
3. 细胞凋亡的分子机制细胞凋亡的分子机制是指细胞凋亡时的分子反应及其生物学意义。
不同的细胞凋亡因素会在不同的机制下活化一些蛋白酶，这些蛋白酶要么直接作用于凋亡指示物(DI)，启动Caspase级联反应，导致大量的蛋白解车和Caspase路线形成;要么直接影响Caspase的活性，进行调节。
4. 细胞凋亡的影响因素（1）细胞凋亡基因细胞凋亡是由一系列基因参与的，这些基因被称为细胞凋亡基因。
细胞凋亡基因包括死亡受体及其相关配体、细胞色素C、Smac/DIABLO、AIF、TOM70等。
这些基因能够通过不同的机制激活Caspase，从而引导细胞凋亡。
细胞凋亡
Ced3 在哺乳类同源物是 ICE（Interleukin-1 β
-converting enzyme，白介素-1β 转换酶），
即 Caspase1，可促进细胞凋亡。
常见的细胞凋亡途径有两条： Caspase 依赖性的 细胞凋亡（外源、内源性）和不依赖于 caspase 的细胞凋亡途径，两个途径一般同时被激活。
正常细胞
2、细胞凋亡 过程及特征 最重要特征：
细胞凋 亡开始
细胞质膜保
持完整，内 含物不外泄， 不引发机体 炎症反应。 需 ATP 供能
凋亡小 体被吞 噬 凋亡小 体形成
胸腺细胞凋亡过程形态变化
正常 凋亡
凋亡细胞表面发泡，许多泡状或者芽状突起，逐渐分隔，形成单 个凋亡小体。
胸腺细胞凋亡过程形态变化
② 核纤层（lamina）蛋白
核纤层解体 ③ 细胞骨架蛋白：
核纤层
导致细胞解体，
形成凋亡小体
④ 其他的 caspases
⑤ 灭活细胞凋亡的
染色体
抑制物
2、Caspase 依赖的细胞凋亡途径
分为死亡受体（Fas）起始的外源途径及线粒体起
源的内源途径两条。 1）死亡受体起始的外源途径（书上 P450） 当细胞接受凋亡信号分子（FasL，TNF 等）刺激 后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞 内衔接蛋白（Adaptor protein）结合，这些衔接蛋
（Bcl-2 homology）结构域的 C-端片段被运送到线
粒体，与 Bcl-2 / Bax 的 BH3 结构域形成复合物，
导致细胞色素 C 释放。CytC 与胞质中 Ced4 同源
物 Apaf-1（凋亡蛋白酶活化因子 apoptosis rotease
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细胞坏死（necrosis）是在各种致病因 素（如缺氧、物理、化学和生物学因素） 的剧烈刺激下的病理性死亡。其特点是: 引起死亡的因素剧烈，死亡迅速。表现为 能量代谢下降—膜通透性增加—细胞水 肿—细胞器破裂，细胞溶解，DNA不断 裂—内含物释放—引起炎症反应。
细胞凋亡:细胞在一定的生理或病理条件 下,遵循自身的程序,结束其生命的生理性死 亡，是受基因严格调控的细胞自杀现象。凋 亡过程中，细胞骨架蛋白分解—细胞和细 胞器浓缩而不裂解—染色体DNA断裂和形 成凋亡小体—细胞内含物不外泄，不引起 炎症反应。最后凋亡小体被巨噬细胞识别和 吞噬。
2）染色体DNA的降解：细胞凋亡的一个 显著特征就是细胞染色质的DNA降解。 3）RNA/蛋白质大分子的合成。 4）钙离子变化，细胞内钙离子浓度的升 高是细胞发生凋亡的一个重要条件。
5）内源性核酸内切酶：细胞发生凋亡是 需要这种核酸内切酶参与的。
细胞凋亡的分子生物学研究阶段
1）细胞凋亡相关基因及其调控 2）细胞凋亡的信号转导 3）细胞凋亡各种分子相互作用及相互关系 4) 细胞凋亡的临床应用基础研究阶段
Ladder Pattern of Cells
二、细胞凋亡的生理意义
1. 维持组织器官细胞类型和细胞总量的基本平衡：清 除衰老损伤的细胞：皮肤、粘膜细胞的更新等。
2. 在胚胎发育中起重要作用 a 手指和脚趾的形成等。 b 大脑神经元之间形成连 接时多余的神经细胞通过凋亡清除掉。 c 在淋巴细 胞发育成熟中起重要作用。d 心脏发育过程中左右 心室、房的形成以及左右心室的厚度，通过细胞凋 亡调节。
1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡 的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始， 在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研 究，肝细胞死亡的研究都为这一概念的提出奠定 了基础。
细胞凋亡的形态学及生物化学研究阶段
（1972-1987） 1）利用光镜和电镜对形态学特征进行了 详细的研究。
细胞程序性死亡是一个发育学概念，而细胞 凋亡则是一个形态学概念，描述一件有着一整套 形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。 但是一般认为凋亡和程序性死亡两个概念可以交 互使用，具有同等意义。
凋亡概念的形成
1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉 后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡 细胞。这些细胞的溶酶体并未被破坏，显然不同 于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集,从 其周围的组织中脱落并被吞噬,机体无炎症反应。
正常 胸腺细胞 凋亡
生物化学方面： 核 酸 内 切 酶 活 化 与 DNA 电 泳 呈 梯 子 状 改 变 是
apoptosis的生物化学标志。
核酸内切酶在核小体连接处将DNA链切断，从 而最终产生寡聚核小体。这些寡聚核小体的大小 均是DNA长度为180 - 200个碱基对(bp)的倍数， 因此用琼脂糖凝胶电泳测定细胞DNA时出现特征 性的“梯状”（ladder）带纹。
形成凋亡小体： 内质网、高尔基复合体 及核被膜膨大,形成泡状结构与细胞膜融合， 以出泡方式离开正在死亡的细胞，将所包含 的完整细胞器和核碎片等细胞内容物以细胞 质膜包被成凋亡小体(apoptosis bodies） 释放到细胞外。凋亡小体很快被周围邻近间 质细胞或巨噬细胞吞噬，而不引起周围组织 的炎症反应。
细胞减少
新生细胞出现，产生相应功能
机体
正常生
原有的、不必要的、有害的细胞除去 长发育
细 胞 程 序 性 死 亡 的 概 念 是 1956 年 提 出 的 ， PCD是个功能性概念，描述在一个多细胞生物体 中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并 受到严格程序控制的正常组成部分。
特征:即散在地、逐个地从正常组织中死亡 和消失,机体无炎症反应，而且对整个机体的发 育是有利和必须的。
细胞凋亡的研究，其生命力在于最终能够 有利于疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及 问世。
第一节 概述
一、细胞凋亡概念和特征
细胞的生长发育、增殖、分化和死亡是细胞的4 大特点，细胞死亡分为细胞凋亡和细胞坏死。细 胞凋亡(apoptosis)是由死亡信号诱发的受调节 的细胞死亡过程, 是细胞生理性死亡的普遍形式。 凋亡过程中DNA发生片段化，细胞皱缩分解成凋 亡小体，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，不发生炎 症。
3. 细胞凋亡异常可引起肿瘤和神经退行性病变等疾病。
未成熟B细胞（immature B cell）完成骨髓发 育阶段后，进入血液循环。尽管它表达膜表面抗原 受体，但不具备免疫活性。因此，在结合抗原后， 细胞不被激活，而是通过凋亡被清除。
只有经过不同阶段的过渡期，分化为成熟B细 胞，才具有免疫活性。
细胞凋亡Apoptosis 和细胞坏死Necrosis
细胞凋亡的形态学特征
• 细胞：首先变圆，体积缩小，与邻近细胞的连 接丧失，失去微绒毛，胞浆浓缩，细胞膜结构 仍保持完整。
• 细胞核的变化：胞核内染色质浓缩形成密集颗 粒，位于核被膜下。
• 细胞器： 线粒体：保持完整呈正常状态 溶酶体：保持完整，内容物不外泄
细胞凋亡 分子机制及检测
细胞发生代谢停止、结构破坏和功能 丧失等不可逆性变化，此即细胞死亡。细 胞死亡包括坏死和凋亡两大类型。相比起 细胞坏死，细胞凋亡是更常见的细胞死亡 形式。
在20世纪70年代，科学家们发现了细 胞凋亡，这一研究成果获得了2002年诺贝 尔生理/医学奖。
有丝分裂 细胞凋亡
细胞增多 动态平衡
过渡期B细胞的发育、成熟是受复杂的调控。 一方面，细胞的生存机制促进未成熟B细胞的存活 与发育，保证了B细胞成熟的顺利完成。另一方面， 70%的细胞凋亡，消除潜在自身反应性B细胞，实现 了对自身组织的免疫耐受。
由HIV感染引起的艾滋病有一个重要特征是随 着病情的发展，CD4T细胞数进行性减少，其主要 原因是：