ELISA基础知识和注意事项解读
Elisa检测原理及注意事项
4.试剂使用前要恢复到室温。
5.加样过程中枪头不要触碰到孔壁。
谢谢大家
5. Elisa实验注意事项：
1.加显色液要迅速，前后不要超过5min, 如果样本过多可以用排枪 加。
显色液加入以后，颜色反应就开始了，反应时间越长，颜色越深。
2.要通过预实验确定样本的稀释倍数，保证样本的吸光度在标准曲线 的量程内。吸光度超过量程，测出的浓度可能会偏低。公司的酶标仪 最高能测到4。
4. Elisa显色原理
Ab-HRP
PH<1
TMB+H2O2
H2O+OX-TMB
联苯醌 （450nm 测OD值）
蓝色 2M硫酸 黄色
酶标抗体：Ab-HRP HRP:辣根过氧化物酶 TMB：四甲基联苯胺(TMB) H2O2：过氧化氢 OX-TMB：一种氧化后的蓝色色物质
辣根过氧化物酶底物：鲁米诺、TMB 碱性磷酸酶底物：AMPPD β-D-半乳糖苷酶底物：甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷
洗
洗
涤
涤
颜色越深，待测抗 原浓度越低
标准曲线
6000
5000 4000
y = 7741.3e-1.255x R²= 0.996
3000
2000
1000
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
2.抗原、抗体与固相载体（Elisa 板底）结合原理
固相载体 聚苯乙烯，具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其 上后仍保留原来的免疫学活性。
洗
洗
洗
涤
涤
涤
抗原（待测蛋白）含量和颜色深 浅呈正相关，颜色越深，抗原含 量越高。
ELISA原理方法操作及注意事项
ELISA原理方法操作及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测目标分子的存在和浓度。
ELISA方法基于抗原-抗体反应的原理，通过酶标记的二抗或底物来标记和检测特定抗原或抗体的结合。
1.涂覆：将特异性抗体或抗原溶液加入微孔板的孔中，使其在孔壁上吸附，形成“涂覆抗原”或“涂覆抗体”的微孔板。
孔顶部通常需要使用一个覆膜或负压干燥来防止蒸发。
2.阻断：将孔中添加阻断剂如牛血清白蛋白（BSA）或乳糖，以防止非特异性结合。
3.样品加入：将待测样品加入微孔板，并充分搅拌孔内溶液，以使潜在的目标分子与涂覆的抗原或抗体结合。
4.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。
5.次级抗体加入：加入酶标记的二抗，以与结合到涂覆抗原或抗体的目标分子结合。
这种二抗可以是对目标物质抗体的抗体，也可以是对使用的抗原的抗体。
6.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。
7.底物加入：加入底物（通常为染色底物），以使酶标记的二抗产生可观察的信号。
底物反应产生的颜色或荧光强度与目标分子的浓度成正比。
8.停止反应：加入停止剂如酸，以停止底物反应，并防止进一步的信号增加。
此步骤通常在一定时间后进行。
1.注意对ELISA试剂的保存和使用条件，避免试剂的过期或不适当的保存导致结果偏差。
2.样品收集和处理方面要仔细。
避免样品的污染和交叉污染。
根据检测的目标分子选择适当的样品收集方法和处理方法。
3.在操作过程中，严格控制操作温度和时间。
不同的ELISA方法和试剂可能需要不同的温度和时间条件。
4.遵循相关的操作规程和实验室安全准则，使用个人保护装备，确保实验室安全。
5.在操作过程中，要准确记录每个步骤的时间、温度和取样量等信息，以便进行准确的数据分析和结果解释。
6.ELISA的结果通常是通过测量光密度或荧光强度来表达的，因此在结果分析时需要针对每个样品和对照进行准确的光度或荧光测量。
口蹄疫液相阻断ELISA
4、同上洗板5次，拍干。加酶结合物 50vl/孔，封板， 37℃反应35Min。
•.
5、同上洗板5次，拍干， 50vl/孔加入底 物溶液（显色液A和B按1：1混合），37 ℃避光温育15min。
6每孔再加50vl终止液终止反应，立即在 450nm波长下读取OD值。
•.
1.5血清稀释板加样：使用稀释好的病毒 抗原加样，其中预设的4孔病毒抗原对照 孔按100vl/孔加入，其余待检血清、阴阳 性对照按50vl/孔加入。加样完毕，所有 样品孔和因阳性对照孔稀释度翻倍，变 为图1图、2所示。
1.6将加好样的血清稀释板封板，置于 37℃反应2h。
•.
2、样抗原抗体混合液及病毒抗原对照从 血清稀释板上按次序转移到包被板上 50vl/孔，封板， 37℃反应30Min。
•.
每份血清系列滴度稀释中，阳性孔的最 高稀释倍数即为该备检血清的抗体效价。
若临界值处于2孔之间，抗体效价取相邻 阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间 值，如果处在1：64和1:128之间，则该 份血清抗体效价是1：90。
定性检测时，两个孔只有一个孔为阳性， 则抗体滴度为1：128，2孔均为阳性，则 抗体效价＞1：128.
1.1稀释病毒抗原：用配制好的洗涤液在孔外6 倍稀释病毒抗原。
1.2待检血清稀释：在血清稀释板上，使用洗 涤液连续2倍稀释每份被检血清，每份血清稀 释2-8孔，根据检测用途而定。使每孔最终量 都为50vl。
1.3稀释阳性对照，参照步骤1.2，连续2倍稀释， 从1：16-1：1024。
1.4稀释阴性对照，参照步骤1.2，连续2倍稀释， 从1：2-1：4。
S1 1:32 S2 S3
ELISA原理及操作注意事项
ELISA原理及操作注意事项ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用于检测抗体或抗原的实验技术。
其原理是将待测物（抗体或抗原）通过特定的酶标记结合物与固定在试板上的配体结合，然后用底物与酶催化出彩色或荧光产物，从而通过测量产物的光学密度或荧光信号来定量检测待测物的含量。
1.实验仪器消毒：实验前应将使用的仪器、试剂瓶和器皿进行消毒，以避免实验中的污染。
2.条件优化：不同的ELISA实验条件可能有所不同，包括涂被物、孵育温度和时间、洗涤时间等，必须根据实验需要进行条件的优化。
3.阻断剂：在ELISA实验中，通常需要加入阻断剂（例如牛血清蛋白、鱼胶等）来减少非特异性的结合。
不同的样品可能需要不同的阻断剂浓度进行优化。
4.样品处理：对于待测物的检测，样品的处理包括稀释、加入试剂、混合等步骤。
处理时要注意对待测物的保存温度、避免阳性和阴性样品污染，以及避免样品的重复冻融过程，这可能会降低样品的稳定性。
5.孵育和洗涤步骤：酶标记物与涂被物结合的步骤通常需要进行一定的孵育时间和温度。
此外，洗涤步骤是为了去除不结合的物质，洗涤次数和洗涤液的成分必须根据实验需要进行优化。
6.制备酶标荧光物：在选择酶标物时，需要确保酶的活性和稳定性，并对荧光标记物的浓度和稀释倍数进行优化。
7.底物反应：根据所选择的酶，确定底物反应的最佳时间和温度。
避免底物超过反应时间，以防止过度反应导致结果不准确。
8.光学密度或荧光信号测定：ELISA的结果通常通过测量产物的光学密度（OD）或荧光信号来定量。
在测定前，必须确保光学和荧光仪器的正常工作，并根据实验条件和要求进行仪器校准。
9.数据分析：根据实验设计和实验目的，将ELISA的结果进行统计学分析，包括计算均值、标准差、相关系数等。
总结来说，ELISA是一种常用的实验技术，其原理基于酶催化反应。
在操作ELISA时需要注意实验仪器的消毒、条件的优化、样品的处理、酶标反应的制备和测定、以及数据的分析等方面。
ELISA步骤试剂及注意事项
ELISA步骤试剂及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生命科学、医学和工业领域的实验技术，用于检测和测定生物样本中的抗原或抗体。
以下是ELISA的一般步骤、试剂及注意事项的详细介绍。
一、ELISA步骤：1.样品制备：首先，需要将待测样品（血清、细胞上清、组织提取物等）制备成特定体积的稀释液，以便进行ELISA实验。
2.涂布：将测定物（抗原或抗体）加入固相（例如，微孔板或磁珠）上，使其与固相表面发生特异性结合。
3.阻断：将非特异性结合位点阻断，以降低假阳性结果。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）和干奶粉等。
4.孵育：将样品（稀释液）加入到涂布的微孔板孔中，与固相上的结合位点结合，并孵育一定时间，促使特异性结合反应进行。
5.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
6.探针反应：加入特定的称量标记的抗体或标记化的抗原，使其与待测样品特异性结合，并与固相上的结合位点结合。
7.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
8.显示：加入染色剂或底物，使其与标记物发生特异性反应，并显示颜色或荧光。
9.终止反应：加入终止液停止底物与染色剂的反应。
10.读板：使用酶标仪或光度计测量吸光度，在特定波长下测量显示产物的光密度，并根据标准曲线或控制组数据计算待测样品中特定抗原或抗体的浓度。
二、常用ELISA试剂：1.涂布缓冲液：主要用来将测定物溶解在其中，涂布在微孔板或磁珠上。
2.试样稀释液：用于制备待测样品的稀释液。
3.标准物：用于制作标准曲线，以确定待测样品中抗原或抗体的浓度。
4.阻断剂：用于封闭非特异性结合位点，以降低假阳性结果。
5.洗涤缓冲液：用于去除孔内非特异性结合物质。
6.探针：用于特定抗体或抗原的检测，通常经过标记，如HRP（辣根过氧化物酶）或荧光染料等。
7.显示试剂：用于显示标记物与底物的特异性反应，如碱性磷酸酶底物或H2O2和TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二唑基）等。
酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项
发展潜力
ELISA技术具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，在生物医学领域具有广泛的应用前 景，如疾病诊断、药物研发、免疫分析等。
技术创新
随着技术的不断发展，ELISA技术将不断创新和完善，出现更加快速、灵敏和高效的ELISA 试剂盒和检测方法。
未来趋势
随着生物医学领域的不断扩展和技术的不断进步，ELISA技术未来将向更加高效、灵敏、 自动化和便捷化方向发展。
复查结果记录
对复查结果进行详细记录，包括复 查日期、复查人员、复查结果等信 息。
数据的可重复性与可靠性评估
数据可重复性分析
通过对比不同时间点、不同实验人员的数据，分析数据的可重复 性。
数据可靠性评估
根据实验操作流程、试剂质量等因素，对数据的可靠性进行综合 评估。
数据质量标准
根据实验目的和实际需求，制定数据质量标准，规范数据使用和 分析流程。
酶联免疫吸附试验ELISA手 工操作注意事项
xx年xx月xx日
目录
• ELISA手工操作基础知识 • ELISA手工操作前的准备工作 • ELISA手工操作过程中的注意事项 • ELISA手工操作后的数据分析及处理 • ELISA手工操作中可能遇到的问题及解决办法 • ELISA手工操作的优化建议及未来发展
ELISA原理、方法、操作及注意事项解析
双抗原夹心法测抗体
Title in here
竞争法检测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去 ，或不易得到足够的纯化抗原时，可 用竞争法检测特异性抗体。
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竞争法测抗体
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竞争法测抗体
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竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可 作夹心法的两个以上的位点，因此 不能用双抗体夹心法进行测定，可 以采用竞争法模式。小分子激素 、 药物等ELISA测定多用此法。
（1） 标本 可用作ELISA测定的标本十分 广泛，大部分ELISA检测均以血清 为标本。血清标本按常规方法采集， 应注意避免溶血，红细胞溶解时会 释放出具有过氧化物酶活性的物质， 以HRP为标记的ELISA测定中， 溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体 中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如 在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法 ELISA中可使本底加深。 一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃， 超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白 质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气 泡，可上下颠倒混和 ，不要在混匀器上强烈振荡。 混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再 检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血 清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存 血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐 剂。
ABS-ELISA法
Title in here
3. ELISA的操作
在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。 完整的ELISA试剂盒包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制 血清 （定量测定中）； （5）标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液。
ELISA测定操作中的注意事项
ELISA测定操作中的注意事项ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的工具，用于测定病毒、细菌、蛋白质和其他生物分子在生物样本中的存在量。
ELISA检测方法操作相对简单，但仍然需要遵循一定的操作步骤和注意事项。
以下是ELISA测定操作中需要注意的几个关键点：1.准备工作：在进行ELISA测定之前，必须仔细准备实验室，并确保所有需要的试剂和仪器设备都得到妥善处理。
所有试剂应按照说明书储存和使用，并检查试剂有效期。
2.样品处理：样品的处理方法会因样品类型的不同而异。
无论是血清、尿液、细胞上清液还是其他类型的样品，都需要进行预处理以提取目标分析物。
必须注意避免样品污染和误导，以避免结果扭曲。
3.标准曲线制备：标准品的浓度应按照所需浓度系列依次配制。
标准曲线对于测量未知样品中目标物质的浓度至关重要。
应准确测量并稀释标准品，以保证标准品在适宜阶段内。
4.试板板块的涂覆：试板板块在试验中起到一个基础角色，对于测定结果至关重要。
在涂布之前，应完全清洗和干燥，以确保涂覆的均匀。
涂覆的目标抗体或抗原浓度也应该掌握好，以便获得准确的结果。
5.反应时间和温度：在试验进行过程中，应遵循说明书上的指导，严格控制每个反应的时间和温度。
反应时间和温度的变化可能会导致结果不准确或可读性差。
6.洗涤的重要性：洗涤步骤是ELISA测定中用来去除未结合的试剂或物质的重要步骤。
洗涤过程必须彻底，在每次洗涤中使用足够的洗涤缓冲液来确保彻底去除未结合物质。
7.底物的选择和反应停止：底物的选择对于结果的解读和显示至关重要。
不同的底物可能在不同的波长下显示颜色。
在选择底物时应确认设计好测定的波长。
同时，在底物反应后需要及时停止反应，使反应停止时间相对一致。
8.数据分析：9.消毒与废液处理：10.质量控制：为了确保ELISA测定的结果准确可靠，应进行质量控制。
包括使用质控样品、校准标准品和内部参比物来保证所得结果的精确性和可重复性。
总结起来，ELISA测定是一种有效的生化实验方法，但在操作过程中需要注意细节和实验操作的准确性。
elisa竞争法注意事项
ELISA 竞争法是一种常用的酶联免疫吸附测定技术，用于检测抗原或抗体。
在进行ELISA 竞争法实验时，有一些注意事项需要考虑，以确保实验的准确性和可靠性。
以下是一些常见的注意事项：1. 试剂和抗体的选择：选择高质量的试剂和抗体是确保实验成功的关键。
确保所使用的试剂和抗体具有高特异性和亲和力，并根据制造商的说明进行储存和使用。
2. 样本处理：正确处理样本对于获得准确的结果至关重要。
确保样本在采集、储存和处理过程中遵循适当的操作步骤，以避免样本的污染、降解或失效。
3. 标准曲线的绘制：绘制准确的标准曲线是定量分析的基础。
确保标准品的浓度范围覆盖待测样本的预期浓度，并使用合适的稀释液进行稀释。
4. 控制样本的设置：设置适当的阳性和阴性对照样本，以确保实验结果的可靠性。
阳性对照应产生预期的阳性结果，阴性对照应显示无反应。
5. 洗涤步骤：洗涤步骤对于去除未结合的试剂和杂质非常重要。
确保洗涤缓冲液的质量和洗涤次数足够，以避免假阳性结果。
6. 孵育时间和温度：严格按照试剂盒的说明控制孵育时间和温度。
过长或过短的孵育时间以及不正确的温度可能会影响实验结果。
7. 数据分析：仔细分析实验数据，确保结果在可接受的范围内。
如果结果异常，应检查实验步骤和试剂是否存在问题。
8. 质量控制：定期进行质量控制检查，包括试剂的批间和批内变异、仪器的校准和维护等，以确保实验的稳定性和准确性。
以上是 ELISA 竞争法实验中的一些注意事项。
在进行实验时，应严格按照试剂盒的说明书和实验方案进行操作，并遵循实验室的标准操作程序，以获得可靠的实验结果。
如果你对实验有任何疑问，建议咨询相关专业人士或参考相关文献。
酶联免疫吸附试验注意事项
酶联免疫吸附试验注意事项一、前言酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见的生物学实验技术，用于检测抗体或抗原的存在。
在进行ELISA实验时，需要注意许多细节，以确保实验结果准确可靠。
本文将详细介绍ELISA实验中需要注意的事项。
二、试剂准备1. 标准品的制备：标准品是ELISA实验中非常重要的一个组成部分，它通常用于建立标准曲线，从而确定未知样本中抗体或抗原的浓度。
在制备标准品时，应该按照厂家提供的说明书严格操作，并注意其保存方式和有效期。
2. 酶标板的处理：在使用酶标板之前，应该先进行预处理。
通常情况下，酶标板需要用PBS（磷酸盐缓冲液）或其他缓冲液洗涤数次才能去除表面上可能存在的污染物。
此外，在使用酶标板之前还应该对其进行预热处理。
3. 酶联试剂盒中其他试剂的制备：除了标准品和酶标板之外，ELISA试剂盒中还包括其他试剂如探针、底物、停止液、缓冲液等。
在制备这些试剂时，应该按照说明书中的要求进行操作，并注意其保存方式和有效期。
三、样本处理1. 样本的收集和保存：在进行ELISA实验之前，需要先收集样本并储存起来。
对于血清或血浆样本，应该使用无菌的容器进行收集，并在室温下离心去除细胞残留物。
此外，在储存样本时应该避免反复冻融，以免影响实验结果。
2. 样本的稀释：在ELISA实验中，通常需要将样本稀释到一定浓度才能进行检测。
稀释倍数应该根据实验需要和样品浓度确定，并严格按照说明书中的要求进行操作。
四、实验操作1. 洗板步骤：洗板是ELISA实验中非常重要的一个步骤，它用于去除不特异性结合物质以及未结合试剂等。
在洗板时应该注意以下几点：（1）洗涤次数：通常情况下，每个孔洗涤3-5次即可。
（2）洗涤缓冲液：不同的试剂盒可能需要使用不同的洗涤缓冲液，应该按照说明书中的要求进行操作。
（3）洗涤时间：洗板时间应该控制在适当的范围内，过长或过短都可能影响实验结果。
2. 加样步骤：在加样时应该注意以下几点：（1）加样量：加样量应该根据实验需要和样品浓度确定，并严格按照说明书中的要求进行操作。
培训课件：酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项
2 核对仪器
确保酶标仪正常运行， 并进行校准和调试。
3 设定样品量
根据实验要求和预期结 果，设定合适的样品量。
ELISA操作流程
取样品
使用移液管准确地取出待测样品，并转移至反 应孔板中。
混合试剂
根据实验要求，将不同试剂混合，并加入反应 孔板中。
洗涤反应孔板
使用洗涤缓冲液彻底洗涤反应孔板，去除非特 异性结合物。
3
反应孔板处理
处理反应孔板，包括洗涤、封闭非特异性结合位点等步骤。
4
标准曲线绘制
通过稀释标准品制备标准曲线，用于分析待测样品的浓度。
材料清单
反应孔板
96孔黑胶板
用于测定光学密度
洗涤缓冲液
用于洗涤反应孔板
实验前准备工作
1 检查试剂
确认试剂溶液的保存状 态和有效期限，避免使 用过期或变质的试剂。
添加底物溶液
加入致色底物溶液，观察反应孔板颜色的变化。
实验注意事项
避光操作
在取样、反应和测量过程中， 避免试剂暴露在强光下，以 保证测量结果的准确性。
注意交叉污染
使用专用移液管和洗涤缓冲 液，避免不同试剂之间的交 叉污染。
标准曲线绘制
密切按照标准曲线绘制的要 求进行操作，以获得准确的 样品浓度。
结果分析
如何避免交叉污染？
使用专用移液管和洗涤缓冲 液，并避免将试剂污染到外 部容器或工作台。
应该如何解读ELISA 实验结果？
根据标准曲线将光学密度值 转化为样品浓度，并根据浓 度结果判断样品中目标物质 的含量。
1 测量光学密度
使用酶标仪测量各反应孔板的光学密度，并记录数据。
2 标准品对照
根据标准曲线将测得的光学密度值转化为待测样品的浓度。
ELISA测定操作中的注意事项
ELISA测定操作中的注意事项1.实验准备：-所有试剂和材料都应该保持清洁，并且在防尘环境中储存，以免被污染。
杂质和污染物可能会干扰实验结果。
-所有试剂和材料的质量控制必须符合规范，并且要检查试剂的过期日期。
2.样品处理：-样品的处理步骤和条件要准确无误。
对于血清和其他生物样品，必须遵循正确的方法进行采集、收集和储存，以确保没有损坏或污染。
-如果样品需要预处理，例如稀释、离心、过滤等，必须严格按照操作规程进行。
3.酶标板处理：-酶标板的表面必须干净而平滑，以确保所有试剂和样品都能均匀地附着在板上。
-酶标板在使用前和每次使用后都必须仔细清洗，以防止旧的试剂残留对结果产生影响。
-使用适当的洗涤缓冲液来冲洗酶标板孔洞。
过强或不够强的冲洗可能会干扰测定结果。
4.试剂添加：-规定每次添加试剂的顺序和时间，确保步骤按照要求执行。
-对于标准曲线的制备，必须准确称量，遵循要求的稀释方法，并尽量避免任何误差。
-每次添加试剂时都必须用新的、干净的移液器以避免交叉污染。
5.反应条件：-反应温度和时间必须严格控制。
温度变化可能会影响酶结合和反应动力学。
-每个步骤完成后都要正确地暴露在正确的环境中，以获得准确的检测结果。
6.测定结果：-应该使用正确的仪器进行结果读取，并确保仪器校准和校准曲线。
-样品结果应与控制结果进行比较，以减少误差。
-对结果进行多次重复测量，并计算平均值和标准偏差，以便计算结果的可靠性。
7.数据分析：-严格按照相关数据分析方法进行数据处理和统计分析。
-对于结果的解释，应根据实验设计、样品类型和研究目的进行相关解释。
总结起来，ELISA测定操作中的关键是保持实验材料和环境的清洁，遵循严格的操作规程，准确分析数据，并进行适当的质量控制。
通过严谨操作和数据分析，可以确保ELISA结果的准确性和可靠性。
ELISA知识
ELISA的概念、原理、操作步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.0的碳酸盐包被缓冲液，将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
ELISA的操作
ELISA的操作与注意事项一、阻断ELISA1、液相阻断ELISA（代表试剂盒：口蹄疫O型、ASIAⅠ型、A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒：兰州兽医研究所生产）1.1原理：①兔抗口蹄疫血清+病毒抗原（被检血清与病毒抗原反应后病毒抗原剩余）+豚鼠抗口蹄疫血清+兔抗豚鼠酶标结合物+底物显色+终止液+读数（OD值，颜色越深OD值越大）。
颜色的深浅与病毒抗原剩余量成正比，病毒抗原剩余多，则与之反应的被检血清的抗体效价低，反之，病毒抗原剩余少，则与之反应的被检血清的抗体效价高。
因此，随着被检血清的递倍稀释，血清效价逐渐降低，与被检血清反应的病毒抗原剩余逐渐增多，颜色也逐渐加深。
②兔抗口蹄疫血清+被检血清（被检血清与病毒抗原反应后被检血清剩余），则反应终止，以后加入的试剂随着洗板被清洗，最终无颜色反应，则说明被检血清抗体效价高。
因此，反应颜色越浅则抗体效价最高，颜色的深浅也抗体的效价成反比。
1.2 操作过程1.2.1提前一天准备工作：①稀释血清：使用血清稀释板（U型96孔板），常用稀释布局如下图：按图示加入相应量的PBST,吸取12.5ul被检血清和50ul阴、阳性血清于相应孔中，将待检血清和阴、阳性血清做2倍连续稀释，然后再加入50ul的病毒抗原对照，病毒抗原对照孔加入100ul病毒抗原对照，这时，除去空白孔，所有孔均为100ul体系。
用包被缓冲液稀释口蹄疫兔抗血清至工作浓度，将稀释后的口蹄疫兔抗血清加入ELISA板中，每孔加50ul,震荡后使包被液布满整个孔底，封板，在室温条件下过夜。
1.2.2 第二天工作（严格按说明书操作）洗ELISA板→转移血清稀释板上的病毒抗原与血清反应液（按照稀释血清布局图的格式相应的转移至ELISA板上）→孵育60分钟→洗ELISA板→加入稀释好的豚鼠抗血清→孵育60分钟→洗ELISA板→加入稀释好的兔抗豚鼠酶结合物→孵育60分钟→洗ELISA板→加入底物（现加入相应量的H2O2）→孵育15分钟→加终止液→读数→结果判定。
elisa操作步骤及注意事项
elisa操作步骤及注意事项以elisa操作步骤及注意事项为题，本文将为大家介绍elisa（酶联免疫吸附测定法）的操作步骤和注意事项。
一、操作步骤1. 准备工作在进行elisa实验前，需要准备好实验所需的试剂和仪器设备，包括酶标板、试剂盒、洗涤缓冲液、底物溶液、阻断缓冲液等。
同时，需要对实验室台面和仪器进行消毒，并佩戴好实验手套和口罩，以确保实验的准确性和安全性。
2. 样品处理将待测样品（如血清、尿液、细胞培养上清液等）和对照样品放置在室温下静置，使其达到室温后，进行稀释处理。
通常情况下，待测样品需要按照一定比例进行稀释，以确保其浓度处于检测范围之内。
3. 酶标板涂覆将酶标板中的亲和素或抗体溶液加入到孔板中，然后将其在4℃下静置过夜，使亲和素或抗体能够均匀地吸附在酶标板上。
4. 标准曲线制备将标准品按照一定比例稀释，以制备出一系列浓度递增的标准品溶液。
然后将这些标准品溶液依次加入已涂覆的酶标板孔中，孔位之间要保持一定的距离。
5. 样品孔加样将样品溶液加入到酶标板的样品孔中，注意每个孔的加样量要保持一致。
为了保证实验的准确性，通常会设置阳性对照孔和阴性对照孔，以验证实验的可靠性。
6. 孔板洗涤使用洗涤缓冲液对酶标板进行洗涤，去除未结合的物质和杂质。
洗涤时要注意洗涤液的温度和洗涤次数，以确保洗涤的充分彻底。
7. 酶标记物加入将酶标记的二抗或酶标记的亲和素加入到酶标板的孔中，使其与靶分子结合。
然后，将酶标板置于恒温摇床上，进行孵育反应，使酶标记物与靶分子发生特异性结合。
8. 反应终止通过加入反应终止溶液，使酶标记物的酶活性停止，并终止酶标记物与靶分子的结合。
终止溶液的选择要根据实验所使用的底物和酶标记物来确定。
9. 读板测定使用酶标仪或多功能酶标仪对酶标板进行测量，测定底物的反应产物的吸光度。
根据吸光度值，可以计算出样品中靶分子的浓度。
二、注意事项1. 严格控制实验条件在进行elisa实验时，需要严格控制实验条件，包括温度、湿度、时间等。
《ELISA基础》课件
样品处理：将待测样品进行 适当处理，如稀释、离心等
显色：加入显色剂，使结合 的物质发生颜色变化
孵育：将酶标板放入孵育器中， 在适当温度下孵育一段时间
读数：使用酶标仪读取吸光 度值，计算结果
实验准备：准备所需试剂和仪器， 包括酶标板、抗体、抗原、洗涤
液等
洗涤：用洗涤液洗涤酶标板，
去除未结合的物质
加样：将待测样品和标准品加入 酶标板中，注意加样顺序和体积
,
汇报人：
01
02
03
04
05
06
ELISA是一种免疫学检测方法，用于检测样品中的抗原或抗体
原理：利用抗原-抗体特异性结合，通过酶催化反应产生颜色变化，从而检测样品中 的抗原或抗体
步骤：样品处理、加样、孵育、洗涤、显色、终止、结果分析
应用：广泛应用于医学、生物学、食品科学等领域
酶联免疫吸附试验（ELISA）的分类：间接法、夹心法、竞争法 ELISA的应用领域：临床检测、生物药物研究、食品安全检测等 ELISA在临床检测中的应用：肿瘤标志物、传染病、自身免疫病等 ELISA在生物药物研究中的应用：抗体药物、细胞因子等的检测和定量
终止：加入终止液，终止反
应
注意事项：避免交叉污染，确保 实验环境清洁，严格按照操作规
程进行实验。
抗原和抗体的选择：选择合适的抗原和抗体，确保实验结果的准确性 实验条件的控制：控制实验温度、时间、pH值等条件，确保实验结果的稳定性 实验步骤的优化：优化实验步骤，提高实验效率和准确性 数据分析和结果解释：对实验数据进行分析和解释，确保实验结果的可靠性和可重复性
技术挑战：ELISA技术在检测过程中存在假阳性和假阴性的问题，需要进一步改进和优化。
发展趋势：未来ELISA技术将朝着自动化、高通量、高灵敏度、高特异性的方向发展，以满 足科学研究和临床诊断的需求。
elisa操作要 点及注意事项
elisa操作要点及注意事项
Elisa操作是一种常见的实验技术，用于检测各种生物分子，如蛋白质、抗体等。
在进行Elisa实验时，需要注意以下几点：
1. 建立标准曲线：在进行Elisa实验前，需要先建立标准曲线，以确定样品中分子的浓度。
建立标准曲线的方法是将已知浓度的标准样品加入到酶标板中，然后测定其吸光度值。
通过标准曲线可以得到样品中分子的浓度。
2. 样品的处理：在进行Elisa实验前，需要对样品进行处理，如离心、过滤、稀释等。
处理样品时需要注意不要破坏样品中的目标分子。
3. 抗原、抗体的选择：在进行Elisa实验时需要选择适合的抗原和抗体。
抗原和抗体的选择要基于实验目的和样品特性。
4. 实验条件的控制：在进行Elisa实验时需要控制实验条件，如温度、湿度、时间、pH值等。
这些条件直接影响实验结果的准确性和重复性。
5. 结果的分析：在进行Elisa实验后需要对结果进行分析。
分析结果时需要注意标准曲线的斜率、截距和相关系数的准确性，以及实验的重复性和可重复性等因素。
总之，在进行Elisa实验时需要遵循标准实验操作规程，注意实验条件的控制和结果的分析，才能得到准确、可重复的实验结果。
- 1 -。
ELISA基础知识和注意事项
按要求操作，并适当延长浸泡时 间。
洗板时，垂直加入洗液，保证一 定的冲击力；洗液要注满 板孔，并保证30-60秒的浸 泡时间。
手工洗板，并联系仪器厂家维修。
防止组分的污染。如使用容器， 注意容器的清洁。
显色完立即终止反应。
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重复性不好
10 试剂开启时间过长，污染。 12 不同批号试剂中混用
试剂开启后应该在尽可能短的时间内用 完，在保证正确贮存的前提最 长不要超过。
不同批号试剂不能混用
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36
假阳性多，本底高甚至花板
序号 原因
解决方法
1
试剂过期
2
加样时污染
3
加酶时污染
过期试剂不能使用
注意更换吸头。尽可能避免污染。
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Elisa结果的影响因素
试剂盒的选择 标本 加样与稀释 温育 洗版 显色 质控
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试剂盒的选择
同行的试剂使用情况
上级部门对试剂实际使用的综合评价
使用临界值质控血清进行实际检测比较,选 择林敏度和准确度高、特异性强试剂盒
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OD值出现负值 阴性对照值比空白小 样本OD值和cutoff接近
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OD值出现负值
波长不对，酶标仪上显示的波长和实际的滤光片不 对应
溶液里有沉淀
板子脏了，如果有能冲洗的洗板机可以冲洗 bottom，或者洗瓶冲干净用滤纸吸干，然后双波 长检测
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ELISA原理方法操作及注意事项
原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。
ABS-ELISA法
Title in here
3. ELISA的操作
在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。 完整的ELISA试剂盒包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制 血清 （定量测定中）； （5）标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液。
一、加样
在 ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本， 加酶结合物，加底物。有的测定（如间接法ELISA ）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释 后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入 血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混 和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道 加液器，使加液过程迅速完成。
ABTS[2,2'-azino-di-(3ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后 ，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便 ，是HRP结合物最常用的底物 。OPD本身难溶于 水，OPD·2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异 变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧 化氢混 合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用
竞争法测抗原
Title in here
捕获包被法
在临床检验中测定抗体IgM 时多采用捕获包被法。如用抗 原包被的间接法直接测定 IgM 抗体，因标本中一般同时存在 较高浓T度itle i的n IgG抗体，后者将 竞争结合here固相抗原而使一部份 IgM抗体不能结合到固相上。
酶联免疫吸附试验的注意事项
酶联免疫吸附试验的注意事项
酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测特定抗原或抗体的
存在。
在进行酶联免疫吸附试验时，需要注意以下事项：
1. 严格遵守实验室安全规范：实验室应具备适当的生物安全措施，如佩戴防护手套、实验室外套和眼镜等。
遵循正确的废弃物处置程序，以防止交叉感染。
2. 严格控制实验条件：在进行试验之前，要确保实验室温度、湿度和洁净度等条件符合要求。
避免因外界因素的干扰引起结果误差。
3. 选择合适的试剂和材料：尽可能选择高纯度的试剂和材料，以确保实验的准确性和可重复性。
4. 严格按照实验步骤操作：按照试剂和材料的添加顺序和比例，按照实验步骤进行操作。
在各个步骤中严格控制反应时间和温度。
5. 注意交叉污染的可能性：使用洁净台和洁净仪器，避免试剂和样品之间的交叉污染，尽量避免试剂间的接触。
6. 保证质量控制的合理性：在每次实验中设置适当的对照组，如阴性对照和阳性对照。
这有助于确保实验结果的准确性，并
监控试剂和仪器的性能。
7. 仔细读取和解读结果：根据试验结果进行正确的结果解读，应注意避免主观判断和误解。
8. 记录实验过程和结果：记录试验过程中的操作细节和实验结果，包括试剂名称、批号、使用日期等信息，以备将来进行结果分析和复查。
总之，要严格遵守实验操作规范和安全措施，保证实验条件的稳定和准确性，同时注意样品和试剂的交叉污染情况，并进行质量控制，严谨地进行实验操作和结果解读，以获得可靠的酶联免疫吸附试验结果。
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捕获法ELISA
1.加样 2.孵育 3.洗涤
4.加入抗原
5.加入二抗
孵育
孵育
6.显色
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区别理解
检测抗原？抗体？
包被什么？ 标记什么？
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间接法和捕获法比较
间接法：假阴性，假阳性
捕获法：酶标抗体的要求较高
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间接法的假阳性
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室内质控：实验室内部使用控制实验结果可 靠性的一种质量控制。 室间质评：用于考核各个实验室结果可靠性 的一种考核，可分为国家级和地方级的室间 质评。可以理解为 “各个实验室的质量评 比”。
2019/2/26
临界值（CUTOFF值）：临界值是判断阴阳 性或有临床意义水平的数值，临界值的确定 是测定大量数据后应用统计学方法确定的。 许多试剂都会给出临界值或临界值的计算方 法。 本底：就是底色。如ELISA HBsAg，阳性 显色，阴性不显色，本底就是整个阴性显色 的情况。ELISA 抗–HBcAb，阳性不显色， 阴性显色，本底就是整个阳性显色的情况。
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检测抗原
双抗体夹心法ELISA
1.加样 2.孵育 3.洗涤
4.加入二抗
5.孵育
6.显色
包被特异性抗体
酶标特异性抗体
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双抗原夹心法
双抗原夹心法ELISA——检测标本中的总 抗体（包括IgM和IgG型抗体） 。将特异 性抗原包被于固相载体表面，与标本中特异 性IgM和IgG型抗体结合，洗涤后加入酶 标的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后 加入底物显色
4
恒温箱温度过高
注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在37±0.5℃。
5
整个操作时间过长、造成反应时间不同（第一孔与最后 一孔反应时间相差很悬殊）。气温高时更明显。
在尽可能短的时间内完成操作。 尽量不要堆积多块板子操作（尤其手工操作时）。
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6 7 8 9
洗液稀释倍数过高 洗板次数不够 洗板时浸泡时间不够 手工洗板方式不正确
标本
应注意避免溶血
在5 天内测定的血清标本可放置于4℃、超 过一周测定的需－20℃保存 尽量避免反复冻融（少量分装）
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加样和稀释
加样本的准确性（个人因素和实验条件） 尽可能排除主关因素（尽可能用加样枪， 避免直接使用滴瓶） 各种试剂盒标本的稀释使用，严格按照说 明是操作
阴性对照值比空白小 样本OD值和cutoff接近
20波长不对，酶标仪上显示的波长和实际的滤光片不 对应
溶液里有沉淀 板子脏了，如果有能冲洗的洗板机可以冲洗 bottom，或者洗瓶冲干净用滤纸吸干，然后双波 长检测
2019/2/26
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Elisa结果的影响因素
试剂盒的选择 标本 加样与稀释 温育 洗版 显色 质控
2019/2/26
试剂盒的选择
同行的试剂使用情况
上级部门对试剂实际使用的综合评价 使用临界值质控血清进行实际检测比较,选 择林敏度和准确度高、特异性强试剂盒
2019/2/26
2019/2/26
灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示 检测下限的能力。 相对灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性） ×100% 测定方法及表示方法：灵敏度标准品、质控 血清、阳性标本稀释终点、血清盘 （pannel）及临床标本阳性率。
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特异性： 真阴性标本的检出能力。 相对特异性=真阴性/（真阴性+假阳性） ×100% 测定及表示方法：质控血清、血清盘、临床 标本阴性率。
2019/2/26
质控
室内质控血清
即刻法
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ELISA试剂的常见问题原因及其解决
显色浅，灵敏度低 假阳性多，本底高甚至花板 重复性不好 白板
2019/2/26
显色浅 灵敏度低
序号 1 2 原因 试剂盒运输时间过长，受高温天气影响，酶的活性 降低。 试剂盒（包括未用完的板条及其他组分）保藏条件 不正确。 试剂盒使用时已超出有效期。 温育时间不够。 恒温箱温度达不到37℃。 解决方法 试剂运输过程加放足够冰袋并尽可能缩短运输时间。 试剂盒内所有组分都应当在4℃冷藏，未使用完的板 条要密封保存。 过期试剂盒不可以使用。 严格按照说明书操作。 注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在37±0.5℃。 尽量避免频繁开关恒温箱门。 经常注意水箱中合适的水位。 在保证水不没过酶标板的前提下，使水位尽量高， 以保证反应温度。
2019/2/26
竞争法ELISA
1.加样 3.孵育 3.显色
A
B
检测抗原 包被特异性抗体 酶标抗原
加样
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孵育
洗涤后显色
双抗体夹心法
双抗体夹心法ELISA ——将特异性抗体包 被于固相载体表面，与标本中相应抗原相结 合，洗涤后再加入酶标的第二特异性抗体与 抗原结合，加入底物后显色。 检测测抗原要有至少具有2个抗原决定簇
2019/2/26
双抗原夹心法ELISA
1.加样 2.孵育 3.洗涤
4.加入酶标
抗原
5.孵育
6.显色
2019/2/26
间接法
间接法 ELISA（Indirect ELISA）—— 将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本 中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标 的抗人IgG或IgM抗体与之结合，洗涤后 加入底物显色。 酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子 只需要变换包被抗原，就可用一种酶标二抗 检测各种与抗原结合的抗体
9
试剂、样品使用前未平衡至室温。
试剂、样品从低温保藏条件中拿出来后，要先平衡至室 温方可以使用。
10
试剂开启时间过长，污染。
试剂开启后应该在尽可能短的时间内用完，在保证正确 贮存的前提最长不要超过。
12
不同批号试剂中混用
不同批号试剂不能混用
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假阳性多，本底高甚至花板
序号 原因 解决方法 1 2 3 试剂过期 加样时污染 加酶时污染 过期试剂不能使用 注意更换吸头。尽可能避免污染。 对先加样后加酶的操作，加酶时要注意吸头不要接触标 本，造成污染。当可能造成污染时，一定要更换 吸头，切忌侥幸心理。
抗人酶标 IgM抗体
类风湿因子 麻疹IgG 麻疹IgM
麻疹 抗原
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间接法的假阴性
酶标抗人 IgM抗体
麻疹IgG 麻疹IgM
麻疹 抗原
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ELISA的有关名词概念
质控血清：质控血清是为了对实验结果进行控制而 配制的血清。质控血清可以是定值也可以是不定值， 可以购置也可以自配。自己配制时要注意选用无脂 血的血清或血浆，不能用试剂盒内的阳性对照。若 用稀释的血清作为质控血清，应考虑稀释基质成分 对结果的影响。因质控血清与临床标本不一致，应 该注意对结果的分析，应该注意质控血清只能用于 质控活动，不可用于标定仪器或评价方法。用于室 内质控的质控血清一般选取CUTOFF值2-3倍的 质控品。
4 5 6
反应时间、温度等不相同。 标本不同（被混淆或者处理不同） 精密度测定方法不标准 采用正确的方法操作
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白板
1 忘记加酶 严格按照说明书操作。
2
忘记加显色液
3
酶或A、B液被污染失效
防止组分被污染，注意保存。
4
把终止液当A液
注意液体组分加样顺序。
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结果处理
OD值出现负值
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间接法ELISA
1.加样 2.孵育 3.洗涤
4.加入二抗
5.孵育
6.显色
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捕获法
ELISA（Capture ELISA）——专门用 来检测IgM型抗体的方法。将抗人IgM抗 体包被于固相载体表面，与标本中所有人 IgM抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相 应的特异性IgM抗体结合，洗涤后再加入酶 标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入 底物显色。
按照要求倍数稀释洗液 按试剂要求，不可任意减少洗板次数 按要求操作，并适当延长浸泡时间。
洗板时，垂直加入洗液，保证一定的冲击力；洗 液要注满板孔，并保证30-60秒的浸泡时 间。 手工洗板，并联系仪器厂家维修。 防止组分的污染。如使用容器，注意容器的清洁。
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洗板机调试不正确或者有故障 （可通过手工洗板判定） 酶被污染 显色液B液被污染 显色完后没有终止反应。
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温育
温度 水浴箱 发硬板应漂浮于水上或水面应高于反应板
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洗版
手洗
洗板机 （微孔液体残留<2ul、浸泡时间 >45s）
2019/2/26
显色
通常是A、B两种液体，不稳定，又颜色应 立即丢弃 先加A后加B，显色时间严格按说明书进行 终止后15内比色
2019/2/26
ELISA的基本原理
抗原或抗体在体外结
合到某种固相载体表 面后，仍然能保持其 免疫学活性而能相互 特异性结合。
2019/2/26
抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下 显色，颜色的深浅与特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定 量分析。
2019/2/26
ELISA基础知识和注意事项
2019/2/26
类容
ELISA的基本原理和相关概念 特别说说捕获法 ELISA结果的影响因素 ELISA结果的处理
2019/2/26
ELISA的基本原理和相关概念