细胞培养传代冻存复苏操作规程(自编)

细胞培养程序

材料

A、仪器

1. 净化工作台，

2. 离心机，

3. 恒温水浴箱，

4. 冰箱（4℃）

5. 倒置相差显微镜，

6. CO2培养箱，

7. 振荡混合仪

8. 酶联免疫检测仪，9. 移液枪，10. 电磁力搅拌机，11. 微孔滤器

B、玻璃器皿

1. 吸管，

2. 小烧杯（100ml），

3. 废液缸，

C、塑料器皿

1. 吸头，

2. 枪头，

3. 96孔培养板，

4. 15ml离心管，

5. 50ml离心管，

6. 胶塞，

D、其他物品

1. 微量加样枪，

2. 红血球计数板，

F、试剂

1. D-Hanks液，

2. 小牛血清，

3. RPMI1640，

4. 双抗（青霉素、链霉素），

5. 0.25%胰酶，

6.0.025% EDTA

7. 二甲基亚砜（DMSO），

8. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。

一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养：

（一）细胞原代培养

1.贴壁细胞培养法：

1）、组织块培养法

将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2此，5分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置，从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小

牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml），使组织块有培养液与其接触为准，轻轻放置于37°培养。待24小时候补液。

或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。

其他方法：消化分离法、器官培养略

2.悬浮细胞培养法

对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。

（二）细胞株(系)细胞复苏培养

细胞复苏的主要操作步骤

(1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。

(2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。

(3) 然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。

(4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。

注意事项

在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生

长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。

二、细胞维持培养（细胞换液培养）、培养选拔常规观察

(一)原代细胞的维持

1、贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液）

一般三天后组织块周围即可见梭形细胞长出。第三天换液一次，其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含2%小牛血清的维持液。待不同组织块周围的细胞连接成片时即可传代。

2、悬浮细胞

凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞，需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象，淋巴细胞的短期培养无需换液，但加入生长因子或有丝分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，细胞不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，加之代谢产物增多，pH变酸，细胞不适宜生长，需进行换液。白血病细胞或淋巴瘤细胞体外长期培养时，都需换液培养，待达到饱和密度时才能传代。换液时，只能采用半量换液的方式，千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。

半量换液的方法如下：

将原培养瓶竖起，在30分钟内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸去一半上清弃去，再加入等量的新鲜完全培养基。若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，采用低速离心（1000r/min10min）弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。

（二）传代细胞维持培养：同上

（三）培养选拔常规观察：

1.培养液

2.细胞生长情况

3.细胞形态变化

4.污染情况

三、细胞的传代培养：

(1)弃旧培养液：吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以25mL培养瓶为例）。

(2)漂洗：每瓶加入2mL，无钙、镁PBS或HANKS液，漂洗贴壁细胞一次后倒掉。（此步可以省略）

(3)消化：每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.025EDTA混合液1:1），轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，在倒置显微镜下待1/2细胞变园后加适量完全培养液终止。或细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用2～3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化）。在37°或25°以上环境进行消化。

(4)终止：加入完全培养基适量（通常10-20%胎牛血清培养基）5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤。

(5)离心：离心（1100rpm）沉淀细胞（5-10分钟），去除培养基（含胰酶及EDTA）。

(6)计数：离心前先滴好计数板待计数，计算细胞的浓度。

(7)传代或冻存：离心后用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养（可1:3至1:5传代，在25cm2的培养瓶中长满细胞可达5*106/ml，经10倍稀释每瓶达105/ml即可，25cm2的培养瓶每瓶5ml培养液）。或用冻存液调整浓度（一般达1*107）冻存。（到此步时经证实未被细菌或真菌污染，则撤去抗生素，以免对细胞的生长长生不利影响，指原代培养细胞）

四．细胞冻存：

细胞冻存液：

20% 小牛血清

10% 二甲基亚砜DMSO

70% 培养液

操作步骤：